CN113151421A - 一种评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法 - Google Patents

一种评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法。该方法通过n轮脱氧核糖核酸聚合酶链式反应后扩增得到的目标分子数计算公式
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE001
推导出生物群落中研究对象a和b在分别进行
Figure RE-438943DEST_PATH_IMAGE002
和
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE003
轮聚合酶链式反应后的扩增效率与反应所合成的目标分子数量及
Figure RE-957780DEST_PATH_IMAGE002
和
Figure RE-230630DEST_PATH_IMAGE003
的关系为：
Figure RE-897234DEST_PATH_IMAGE004
，其中0 <
Figure RE-913732DEST_PATH_IMAGE003
<
Figure RE-411709DEST_PATH_IMAGE002
，且
Figure RE-121039DEST_PATH_IMAGE003
,
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE005
∈N*；
Figure RE-947044DEST_PATH_IMAGE006
、
Figure RE-767232DEST_PATH_IMAGE008
分别为a、b的聚合酶链式反应扩增效率；
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE009
、
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE011
、
Figure RE-995083DEST_PATH_IMAGE012
、
Figure RE-875314DEST_PATH_IMAGE014
分别为
Figure RE-250932DEST_PATH_IMAGE003
、
Figure RE-609232DEST_PATH_IMAGE002
轮反应后a、b的目标分子数量。因为
Figure RE-19484DEST_PATH_IMAGE002
和
Figure RE-132934DEST_PATH_IMAGE003
已知，应用高通量测序技术可以测得
Figure RE-995848DEST_PATH_IMAGE002
和
Figure RE-157839DEST_PATH_IMAGE003
轮聚合酶链式反应后a、b的目标分子数量
Figure RE-157019DEST_PATH_IMAGE012
和
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE015
以及
Figure RE-175790DEST_PATH_IMAGE009
和
Figure RE-588317DEST_PATH_IMAGE016
，因此利用本发明得到的聚合酶链式反应扩增效率与反应所合成的目标分子数量及
Figure RE-694945DEST_PATH_IMAGE002
和
Figure RE-814210DEST_PATH_IMAGE003
的关系公式能够评估群落中目标脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异。

Description

一种评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差 异的方法
技术领域
本发明涉及生物学领域，尤其是分子生态学和分子生物学中评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法。
背景技术
聚合酶链式反应被广泛应用于脱氧核糖核酸分子的体外扩增，以获取大量序列相同的脱氧核糖核酸分子。采用通用引物对生物群落中的目标分子进行聚合酶链式反应扩增后再采用高通量测序技术对得到的扩增片段进行测序分析成为当前分析生物群落中目标分子以及它们对应的物种或基因组成信息的重要技术手段，尤其是针对核糖体小亚基RNA基因（即原核生物的16S rRNA基因和真核生物的18S rRNA基因）、真核生物的ITS序列、氨单加氧酶amoA基因等目标分子的测序研究，已广泛应用于土壤、水体、底泥、肠道、热泉等多个生态系统群落物种和功能基因组成研究。
然而，由于引物匹配性差异、各种拟扩增的目标分子序列差异以及这些序列的内部结构差异等因素的影响，导致在进行聚合酶链式反应时，生物群落中不同的目标分子的扩增效率可能存在差异，从而影响到这些目标分子经过聚合酶链式反应后得到的扩增片段的数量比例与扩增之前的数量比例存在差异，进而影响到对所分析的生物群落中目标分子以及它们对应的物种或功能基因组成比例分析的准确性。但是，目前为止尚没有一种有效评估生物群落中各种目标分子聚合酶链式反应扩增效率差异的技术或方法。
发明内容
本发明要解决如何评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的问题，利用本发明提供的实验和计算方法，能够有效评估群落中各研究对象的脱氧核糖核酸分子在进行聚合酶链式反应时的扩增效率差异，并能够通过数据换算排除因聚合酶链式反应扩增效率差异对研究群落中各研究对象相对比例的计算造成的影响。
本发明基于进行n轮脱氧核糖核酸聚合酶链式反应后扩增得到的目标分子数的计算公式1：
Figure 725724DEST_PATH_IMAGE001
（公式1）
其中
Figure 146341DEST_PATH_IMAGE002
为进行n轮脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应后研究对象a扩增得到的目标分子数量，
Figure 494277DEST_PATH_IMAGE003
为群落中研究对象a的核酸扩增效率，
Figure 483093DEST_PATH_IMAGE004
为聚合酶链式反应开始时研究对象a的目标脱氧核糖核酸分子数量。
对公式（1）两边进行对数处理，得到公式2：
Figure 80427DEST_PATH_IMAGE005
（公式2）
同理，对于群落中的研究对象b，也有：
Figure 383364DEST_PATH_IMAGE006
（公式3）
其中
Figure 444861DEST_PATH_IMAGE007
为进行n轮脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应后研究对象b扩增得到的目标分子数量，
Figure 604578DEST_PATH_IMAGE008
为群落中研究对象b的核酸扩增效率，
Figure 17104DEST_PATH_IMAGE009
为聚合酶链式反应开始时研究对象b的目标脱氧核糖核酸分子数量。
将公式2跟公式3相减，得到：
Figure 717207DEST_PATH_IMAGE010
（公式4）
进行如下格式转换：
Figure 953981DEST_PATH_IMAGE011
得到：
Figure 815758DEST_PATH_IMAGE012
（公式5）
设 0 <
Figure 715581DEST_PATH_IMAGE013
<
Figure 360320DEST_PATH_IMAGE014
，且
Figure 661988DEST_PATH_IMAGE013
,
Figure 897928DEST_PATH_IMAGE015
∈N*，根据公式5则有：
Figure 957151DEST_PATH_IMAGE016
即：
Figure 326953DEST_PATH_IMAGE017
（公式6）
其中
Figure 296177DEST_PATH_IMAGE018
为
Figure 765335DEST_PATH_IMAGE013
轮聚合酶链式反应后研究对象a的目标分子数量；
Figure 374171DEST_PATH_IMAGE019
为
Figure 423030DEST_PATH_IMAGE013
轮聚合酶链式反应后研究对象b的目标分子数量；
Figure 433711DEST_PATH_IMAGE020
为
Figure 480296DEST_PATH_IMAGE014
轮聚合酶链式反应后研究对象a的目标分子数量；
Figure 248532DEST_PATH_IMAGE021
为
Figure 960136DEST_PATH_IMAGE014
轮聚合酶链式反应后研究对象b的目标分子数量。
对公式6进行格式转换，得到：
Figure 903952DEST_PATH_IMAGE022
即：
Figure 714913DEST_PATH_IMAGE023
（公式7）
由公式7可以看出，研究对象a和研究对象b的目标分子的聚合酶链式反应扩增效率仅与经过
Figure 298341DEST_PATH_IMAGE014
和
Figure 423423DEST_PATH_IMAGE013
轮脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应后研究对象a和研究对象b扩增得到的目标分子数量的比值以及
Figure 487325DEST_PATH_IMAGE014
和
Figure 797084DEST_PATH_IMAGE013
的差值有关，其中
Figure 539912DEST_PATH_IMAGE014
和
Figure 593319DEST_PATH_IMAGE013
轮脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应后研究对象a和研究对象b扩增得到的目标分子数量的比值可以通过高通量测序得到，
Figure 308465DEST_PATH_IMAGE014
和
Figure 664491DEST_PATH_IMAGE013
的差值已知，因此可以计算得到研究对象a和研究对象b的目标分子的聚合酶链式反应扩增效率的差异。
利用本发明开展群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异评估的技术流程为：首先提取生物群落总DNA并采用目标分子通用引物对群落总DNA进行不同循环次数的聚合酶链式反应扩增得到目标分子脱氧核糖核酸片段，同一个生物群落至少要进行两次不同循环次数的聚合酶链式反应；而后对扩增得到的目标分子脱氧核糖核酸片段进行高通量测序分析，得到不同循环次数的聚合酶链式反应扩增获得的群落中的脱氧核糖核酸序列组成及相对比例信息；最后通过公式7计算得到
Figure 956932DEST_PATH_IMAGE024
（图1）。
附图说明
图1本发明的技术流程图。其中DNA为脱氧核糖核酸，PCR即聚合酶链式反应；0 <
Figure 689396DEST_PATH_IMAGE013
<
Figure 462311DEST_PATH_IMAGE014
<
Figure 113872DEST_PATH_IMAGE025
，且
Figure 831292DEST_PATH_IMAGE013
,
Figure 101868DEST_PATH_IMAGE015
,
Figure 650661DEST_PATH_IMAGE025
∈N*；
Figure 614069DEST_PATH_IMAGE003
为群落中研究对象a的脱氧核糖核酸聚合酶链式反应扩增效率；
Figure 881102DEST_PATH_IMAGE008
为群落中研究对象b的脱氧核糖核酸聚合酶链式反应扩增效率；
Figure 955369DEST_PATH_IMAGE018
为
Figure 234034DEST_PATH_IMAGE013
轮聚合酶链式反应后研究对象a的目标分子数量；
Figure 492977DEST_PATH_IMAGE019
为
Figure 122673DEST_PATH_IMAGE013
轮聚合酶链式反应后研究对象b的目标分子数量；
Figure 735051DEST_PATH_IMAGE020
为
Figure 258436DEST_PATH_IMAGE014
轮聚合酶链式反应后研究对象a的目标分子数量；
Figure 563647DEST_PATH_IMAGE021
为
Figure 415059DEST_PATH_IMAGE014
轮聚合酶链式反应后研究对象b的目标分子数量。
图2 本发明的技术流程图。
图3 实施例1中分析的硝化螺旋菌（Nitrospira）与红游动菌（Rhodoplanes）、浮霉菌（Planctomyces）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、假单胞菌（Pseudomonas）、黄杆菌（Flavobacterium）、地杆菌（Geobacter）、红长命菌（Rubrivivax）、沙壤土杆菌（Ramlibacter）和土微菌（Pedomicrobium）的16S rRNA基因聚合酶链式反应扩增效率差异情况。
具体实施方式
以下实施是对本发明的进一步说明，而不是对本发明技术参数的限制。
实施例1
采用本发明描述的方法，对广东省东莞市松山湖园区2个采样地区采集的6个森林土壤样品细菌群落的核糖体小亚基RNA基因（即16S rRNA基因）分别进行了25个循环、28个循环和30个循环的聚合酶链式反应扩增，得到的扩增片段采用HiSeq高通量测序仪进行PE250测序后采用QIIME 1.9.0软件对测序数据进行分析，每个样品随机抽取16056条序列进行分析，得到每个样品的可操作分类单位（OTU）组成（可看作是物种组成）信息，而后采用本发明中描述的公式7对群落测序数据中硝化螺旋菌（Nitrospira）与红游动菌（Rhodoplanes）、浮霉菌（Planctomyces）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）、假单胞菌（Pseudomonas）、黄杆菌（Flavobacterium）、地杆菌（Geobacter）、红长命菌（Rubrivivax）、沙壤土杆菌（Ramlibacter）和土微菌（Pedomicrobium）的16S rRNA基因聚合酶链式反应扩增效率差异情况，结果如图2所示，在多数情况下，各物种与硝化螺旋菌的
Figure 955762DEST_PATH_IMAGE024
比值都在1附近，说明它们的扩增效率基本一致；但也存在该比值远远偏离1的情况，这种情况并不是因为扩增效率差异造成的，而是因为该细菌在群落中的相对丰度较低，高通量测序时存在随机测序造成的随机误差。另外，利用我们提供的评估方法还发现，各细菌与硝化螺旋菌的
Figure 474599DEST_PATH_IMAGE024
比值并没有展现出都大于1（表示扩增效率大于硝化螺旋菌）或者都小于1（表示扩增效率小于硝化螺旋菌）的情况，表明不同的聚合酶链式反应中，各物种的扩增效率存在随机性。

Claims (4)

1.一种评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法，其特征在于：根据公式
Figure 8985DEST_PATH_IMAGE001
（其中0 <
Figure 485097DEST_PATH_IMAGE002
<
Figure 823805DEST_PATH_IMAGE003
，且
Figure 43565DEST_PATH_IMAGE002
,
Figure 885750DEST_PATH_IMAGE004
∈N*；
Figure 657397DEST_PATH_IMAGE005
为群落中研究对象a的脱氧核糖核酸聚合酶链式反应扩增效率；
Figure 748981DEST_PATH_IMAGE006
为群落中研究对象b的脱氧核糖核酸聚合酶链式反应扩增效率；
Figure 506853DEST_PATH_IMAGE007
为
Figure 734703DEST_PATH_IMAGE002
轮聚合酶链式反应后研究对象a的目标分子数量；
Figure 677251DEST_PATH_IMAGE008
为
Figure 990552DEST_PATH_IMAGE002
轮聚合酶链式反应后研究对象b的目标分子数量；
Figure 552114DEST_PATH_IMAGE009
为
Figure 759105DEST_PATH_IMAGE003
轮聚合酶链式反应后研究对象a的目标分子数量；
Figure 747920DEST_PATH_IMAGE010
为
Figure 548517DEST_PATH_IMAGE003
轮聚合酶链式反应后研究对象b的目标分子数量）和应用高通量测序技术测得的
Figure 648191DEST_PATH_IMAGE003
和
Figure 975268DEST_PATH_IMAGE002
轮聚合酶链式反应后生物群落中研究对象a和研究对象b的目标分子数量
Figure 869405DEST_PATH_IMAGE009
和
Figure 157298DEST_PATH_IMAGE010
以及
Figure 185297DEST_PATH_IMAGE007
和
Figure 242246DEST_PATH_IMAGE008
，能够评估群落中目标脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异。
2.权利要求书1所述的一种评估群落脱氧核糖核酸分子聚合酶链式反应扩增效率差异的方法，包括以下步骤：首先采用脱氧核糖核酸目标分子通用引物对群落所有生物的总脱氧核糖核酸分别进行
Figure 572864DEST_PATH_IMAGE003
和
Figure 207108DEST_PATH_IMAGE002
轮聚合酶链式反应得到扩增产物，其中0 <
Figure 648585DEST_PATH_IMAGE002
<
Figure 825619DEST_PATH_IMAGE003
，且
Figure 451773DEST_PATH_IMAGE002
,
Figure 448679DEST_PATH_IMAGE004
∈N*；然后采用高通量测序技术对得到的扩增产物进行高通量测序；随后通过对得到的测序序列进行分析，得到
Figure 693846DEST_PATH_IMAGE003
和
Figure 725388DEST_PATH_IMAGE002
轮聚合酶链式反应后群落中研究对象a和研究对象b的目标分子数量的比值
Figure 522442DEST_PATH_IMAGE011
和
Figure 6644DEST_PATH_IMAGE012
；最后将
Figure 789924DEST_PATH_IMAGE011
和
Figure 675971DEST_PATH_IMAGE012
以及
Figure 643927DEST_PATH_IMAGE003
和
Figure 615425DEST_PATH_IMAGE002
带入公式
Figure 202396DEST_PATH_IMAGE001
计算得到
Figure 67584DEST_PATH_IMAGE013
。
3.权利要求书1所述的研究对象a和研究对象b，指群落中具有脱氧核糖核酸序列差异、能够进行区分的脱氧核糖核酸分子，以及基于这些核酸分子确定的物种或基因。
4.权利要求书1所述的
Figure 81807DEST_PATH_IMAGE003
和
Figure 517164DEST_PATH_IMAGE002
轮聚合酶链式反应，其特征在于：通过多组
Figure 32459DEST_PATH_IMAGE003
和
Figure 627519DEST_PATH_IMAGE002
轮聚合酶链式反应进行组合分析，在得到
Figure 812644DEST_PATH_IMAGE013
的同时能够评估
Figure 883368DEST_PATH_IMAGE013
在不同的聚合酶链式反应循环数条件下是否会发生变化；且只有当
Figure 812141DEST_PATH_IMAGE014
时，才表明研究对象a和研究对象b不存在聚合酶链式反应扩增效率差异。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104611432A (zh) * 2015-01-27 2015-05-13 西北农林科技大学 一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法

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