CN113151273A

CN113151273A - 非生物逆境诱导型启动子及其应用

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Publication number: CN113151273A
Application number: CN202110399368.XA
Authority: CN
Inventors: 陈全家; 郭亚萍; 郑凯; 陈琴; 曲延英
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Agricultural University
Priority date: 2021-04-14
Filing date: 2021-04-14
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-04-14
Also published as: CN113151273B

Abstract

本发明公开了非生物逆境诱导型启动子及其应用。本发明具体地公开了一种DNA分子，所述DNA分子为诱导型启动子PHSPIn9和PHSPDel。本发明启动子来源于陆地棉中GhHSP70基因优势单倍型启动子，检测其在非生物逆境下驱动GUS基因的表达量，结果表明PHSPIn9和PHSPDel启动子均能够在非生物胁迫条件下增强GUS基因的表达水平。并且PHSPIn9启动子驱动的GUS基因相对表达水平极显著地高于PHSPDel和CaMV35S。本发明开发的非生物逆境诱导型启动子为植物应对非生物胁迫如高温、干旱、等的基因工程育种提供了优良的定向表达基因的工具，对植物基因工程技术的研究和生产实践具有重要的意义。

Description

非生物逆境诱导型启动子及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及非生物逆境诱导型启动子及其应用，特别是涉及来源于棉花的非生物逆境诱导型启动子PHSPIn9/PHSPDel的开发及应用。

背景技术

启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能与RNA聚合酶等转录相关蛋白准确结合，并具有转录起始的特异性，是基因表达调控的重要组成元件，控制基因表达的起始时间和表达程度。植物基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控下游相应基因表达，使基因具有时空表达特异性，因此对启动子的分离和功能分析是植物基因工程研究的重要内容。根据启动子的调控特性，启动子可分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子等三类。组成型启动子(constitutive promoter)能够在所有组织中启动基因的表达，其驱动基因表达的能力不受时空限制，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。组织特异性启动子(tissue-specific promoter)是指在特定的组织或器官中调控基因表达的启动子。诱导型启动子(inducible promoter)是指只有在某些特定的物理或化学信号的刺激下，才具有转录活性的启动子。植物基因工程中应用较为广泛的是组成型启动子，包括异源和内源的组成型启动子，常见的异源启动子为来源于花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子和章鱼碱合成酶基因Ocs启动子。常见的内源启动子来源于植物本身，例如：玉米聚泛素基因启动子ZmUbi1、水稻肌动蛋白基因启动子OsAct1和OsAct2。这些组成型启动子的作用特点是：能持续高效的启动基因的表达，RNA和蛋白质表达量也是相对恒定，表达量不表现时空特异性也不受外界因素的诱导。然而，在转基因植物中，组成型启动子持续过量的表达会导致过度消耗和浪费植物体内的物质和能源，往往影响或阻碍植物的正常发育，甚至降低其产量。如利用组成型启动子CaMV35S驱动CBF/DREB基因在转基因拟南芥和马铃薯中过量表达能够增强转基因植株的抗逆性，但是CaMV35S启动子的组成型表达导致转基因植株出现矮化、叶片变小和花期延迟等不良表型。而诱导型启动子通常不启动基因转录或转录活性很低，只在外部条件发生改变时，转录活性能够显著提高，因此诱导型启动子可以有效地解决组成型启动子存在的问题，尤其是对于逆境响应的相关基因。

目前在转基因技术改良作物中，应用最为广泛的是组成型启动子—花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，该启动子会驱动其下游基因在植物生长的所有时期和组织器官中高效表达，不仅增加了植物的代谢负担，影响正常生长，还可能导致其死亡。因此，开发和利用在特定条件下诱导表达的诱导型启动子，以缓解异源蛋白的过量表达对植物生长造成的伤害，是解决这个问题的有效途径，对植物基因工程技术的研究和生产实践具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种棉花来源的非生物逆境诱导型启动子，在不同的非生物逆境胁迫条件下可以显著提高下游基因的表达水平。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种DNA分子，所述DNA分子名称为P-GhHSP70，为下述任一种：

A1)所述DNA分子为PHSPIn9或PHSPDel：

所述PHSPIn9是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.1的双链DNA分子；

所述PHSPDel是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.2的双链DNA分子；

A2)与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有70％或更多，80％或更多，85％或更多，或90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的同一性且具有非生物逆境诱导型启动子功能的DNA分子。

上述DNA分子中，所述DNA分子来源于棉花(Gossypium sp.)。

进一步地，所述DNA分子来源于陆地棉(Gossypiumhirsutum)。

上述DNA分子中，所述DNA分子来源于陆地棉GhHSP70基因。

上述DNA分子中，所述DNA分子是非生物逆境诱导型启动子。

所述非生物逆境选自渗透逆境、干旱逆境、盐逆境、强光逆境、紫外线逆境、温度逆境、重金属逆境或缺氧逆境中的至少任一种。

进一步地，所述DNA分子是陆地棉GhHSP70基因优势单倍型启动子，所述陆地棉GhHSP70基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明的两种陆地棉材料中，GhHSP70基因启动子起始密码子ATG上游586bp启动子区段共存在6个SNP位点和一个In/Del位点(TCTTTTTTT/-)的变异，分为两种单倍型启动子，分别命名为PHSPIn9和PHSPDel。其中突变基因型启动子PHSPIn9为优势单倍型启动子，在不同的非生物逆境胁迫条件下可以显著提高下游基因的表达水平。

所述两种陆地棉材料为抗逆性强品种“石远321”和抗逆性弱品种“新陆早26”。

本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料为下述B1)至B6)中的任一种：

B1)含有所述DNA分子P-GhHSP70的表达盒；

B2)含有所述DNA分子P-GhHSP70的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B3)含有所述DNA分子P-GhHSP70的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B4)含有所述DNA分子P-GhHSP70的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B5)含有所述DNA分子P-GhHSP70的转基因植物组织、或含有B1)所述表达盒的转基因植物组织；

B6)含有所述DNA分子P-GhHSP70的转基因植物器官、或含有B1)所述表达盒的转基因植物器官。

本发明所述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体，所述质粒具体可为pCAMBIA3301，也可为将pCAMBIA3301改造后得到的载体。

所述重组载体具体可为将启动子PHSPIn9构建到pCAMBIA3301载体上，得到的重组载体pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS。

所述重组载体还可为将启动子PHSPDel构建到pCAMBIA3301载体上，得到的重组载体pCAMBIA3301-PHSPDel-GUS。

pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS是将pCAMBIA3301载体的HindIII和NcoI识别位点间的片段(CaMv35S启动子)替换为序列表中SEQ ID No.1的第1-596位所示的DNA片段，保持pCAMBIA3301载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。

pCAMBIA3301-PHSPDel-GUS是将pCAMBIA3301载体的HindIII和NcoI识别位点间的片段(CaMv35S启动子)替换为序列表中SEQ ID No.2的第1-587位所示的DNA片段，保持pCAMBIA3301载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。

所述微生物可为细菌，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。具体可为根癌农杆菌或大肠杆菌。

本发明还提供了所述DNA分子P-GhHSP70在作为启动子中的应用。

本发明还提供了所述DNA分子P-GhHSP70在制备重组生物中的应用。

本发明还提供了所述DNA分子P-GhHSP70在植物育种中的应用。

本发明还提供了所述DNA分子P-GhHSP70在植物抗逆基因工程育种中的应用。

上述应用中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

上述应用中，所述植物为锦葵科植物或十字花科植物。

上述应用中，所述植物为棉花或拟南芥。

本发明中，所述启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能与RNA聚合酶等转录相关蛋白准确结合，并具有转录起始的特异性。

可以根据几种技术的目前研究(诸如定向进化技术或定点诱变技术)在一定程度上修饰本发明的DNA分子。例如，与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有70％或更多，80％或更多，85％或更多，或90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的同一性且具有相同功能的DNA分子也包括在本发明的范围内。

如本文中使用的，术语“同一性”指多核苷酸序列间的序列同一性的程度(以百分比表示)。在本说明书中，与给定多核苷酸序列相同的序列或与给定多核苷酸序列具有相似活性的序列的同一性按照“％同一性”表示。例如，可以通过使用标准软件(例如BLAST 2.0)计算诸如得分、同一性和相似性等参数来测定多核苷酸序列的同一性。或者，可以通过根据在限定的严格条件下进行的杂交方法比较序列鉴定多核苷酸序列的同一性。可以考虑本领域技术人员公知的方法确定杂交方法的限定且适合的条件。如本文中使用的，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本发明将诱导型启动子PHSPIn9和PHSPDel构建在含有报告基因GUS(β-glucuronidase，编码葡萄糖醛酸酶)的pCAMBIA3301载体中，通过农杆菌介导的转基因技术获得该重组载体的转基因阳性拟南芥植株。对获得的T3代转基因拟南芥进行PEG(聚乙二醇)、NaCl、ABA(脱落酸，Abscisic acid)和SA(水杨酸)胁迫处理后(以转CaMV35S融合GUS拟南芥材料为阳性对照)，检测其在非生物逆境下启动子驱动GUS基因的表达量。结果表明PHSPIn9和PHSPDel启动子均能够在非生物胁迫条件下增强GUS基因的表达水平。并且PHSPIn9启动子驱动的GUS基因相对表达水平极显著地高于PHSPDel和CaMV35S。

实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明开发的非生物逆境诱导型启动子PHSPIn9和PHSPDel驱动外源基因只有在诱导信号时才会表达，避免了因持续表达目标基因造成的过度消耗和浪费植物体内的物质和能源，从而影响和阻碍植物的正常发育、降低其产量的问题。

2、将抗逆基因作为外源基因，利用本发明开发的诱导型启动子，可以在非生物逆境胁迫条件下显著地提高抗逆基因的表达水平，增强植物的抗逆性。

3、本发明开发的非生物逆境诱导型启动子为植物应对非生物胁迫如高温、干旱、高盐等的基因工程育种提供了优良的定向表达基因的工具，对植物基因工程技术的研究和生产实践具有重要的意义。

附图说明

图1为不同陆地棉中GhHSP70基因启动子序列对比图。图1中：TM-1为陆地棉遗传标准系“TM-1”GhHSP70基因启动子序列；新陆早26为陆地棉品种“新陆早26”GhHSP70基因启动子序列；石远321为陆地棉品种“石远321”GhHSP70基因启动子序列；Consensus表示三种陆地棉GhHSP70基因启动子的共有序列。

图2为植物表达载体构建表达盒。图中，由上至下分别为pCAMBIA3301、pCAMBIA3301-PHSPDel-GUS、pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS。

图3为逆境条件下不同单倍型启动子棉花材料中GhHSP70基因表达模式。

图4为逆境条件下不同转启动子拟南芥中GUS基因表达量。图中，PHSPIn9表示T₃代pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS转基因拟南芥，PHSPDel表示T₃代pCAMBIA3301-PHSP Del-GUS转基因拟南芥，CaMV35S表示T₃代pCAMBIA3301转基因拟南芥。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

申请人选择了前期课题组鉴定的陆地棉抗逆性强品种“石远321”和抗逆性弱品种“新陆早26”为材料，根据陆地棉遗传标准系“TM-1”基因组序列为模板，设计引物克隆“石远321”和“新陆早26”GhHSP70基因起始密码子ATG上游586bp启动子区段，分别命名为PHSPIn9和PHSPDel，三种不同陆地棉中GhHSP70基因启动子测序序列比对图如图1所示。在不同的非生物逆境胁迫后，棉花和转基因拟南芥植株中不同目标基因表达水平上调明显，本发明通过下述两个方面来证明本发明启动子片段确实为一个非生物逆境诱导型启动子。

(1)通过分别检测含不同启动子的抗逆性强品种“石远321”、抗性弱品种“新陆早26”和遗传标准系“TM-1”棉花材料在非生物逆境下GhHSP70基因的表达量(图3)。

(2)通过T₄连接酶将PHSPIn9和PHSPDel分别构建到pCAMBIA3301载体上，形成重组载体pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS和pCAMBIA3301-PHSPDel-GUS(图2)。通过农杆菌介导法将pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS，pCAMBIA3301-PHSPDel-GUS和pCAMBIA3301导入野生型拟南芥中。对获得的T3代转基因拟南芥检测其在非生物逆境下三种不同启动子(PHSPIn9、PHSPDel、CaMV35S)驱动GUS基因的表达量(图4)。

在不同的非生物逆境胁迫后，不同棉花品种和转基因拟南芥中不同目标基因表达水平上调明显，证明本发明启动子片段确实为一个生物逆境诱导型启动子。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA的3’末端核苷酸。

实施例1GhHSP70基因启动子的克隆和测序

根据https://cottonfgd.org/网站获得GhHSP70基因(Ghir_D06G018900.1)启动子序列(SEQ ID No.1)，设计引物P-F1/P-R1，以陆地棉品种“石远321”和陆地棉品种“新陆早26”的叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增。

P-F1：TCTCTTATGGTTGGGTTGGGAC

P-R1：TACGGTTGCCTTGGTCGTTG

PCR扩增体系和反应程序见表1：

表1 PCR扩增反应体系和反应程序

其中，5×

FastPfuFly buffer和

FastPfu Fly DNAPolymerase来自全式金生物有限公司。

扩增得到的PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR扩增产物的回收和纯化：

将PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统(Bio-Rad)中观察目的条带，并切下目的条带于离心管中，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物技术有限公司)回收和纯化目的条带。操作步骤按照厂商提供的说明书进行。

目的DNA片段的连接与转化：

①连接体系(5μL)：4μL PCR回收纯化产物(15-30ng/μL)和

-T5ZeroCloning vector(全式金)，轻柔混合，在PCR仪中反应20min，28℃。反应结束后置于冰上。

②从-80℃冰箱中取出大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞(全式金)，待感受态细胞刚刚解冻时加入全部连接产物。轻柔混匀，冰浴25-30min。

③连接结束后，42℃热激40s(水浴)后，迅速放至冰上3min。

④加入450μL室温未加抗生素的液体LB培养基，转速200rpm，温度37℃的摇床中培养1h复苏。

⑤取出离心管4000×g离心1min，弃部分上清，保留150μL，轻弹混匀，均匀涂抹于含50μg/mL Kan抗生素的LB固体培养基上。

⑥待菌液吸收后，倒置平板，过夜培养(37℃)。

阳性克隆测序：

①挑取平板培养基上的单克隆菌株，分别放置于500μL LB液体(Kan 50μg/mL)培养基的离心管中，200rpm，37℃培养2-4h。

②取1μL菌液作为DNA模板，利用通用引物M13进行PCR扩增，PCR扩增体系与反应程序见表2，产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测。

③检测结果为阳性单克隆的菌株送华大基因科技有限公司测序。

测序结果表明：

以陆地棉品种“石远321”基因组DNA为模板，利用引物P-F1和引物P-R1扩增得到596bp的DNA片段，命名为PHSPIn9。其序列如SEQ ID No.1所示。

以陆地棉品种“新陆早26”基因组DNA为模板，利用引物P-F1和引物P-R1扩增得到587bp的DNA片段，命名为PHSPDel。其序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2非生物逆境处理下棉花启动子驱动GhHSP70基因表达模式鉴定

为了检测不同棉花材料中突变启动子PHSPIn9(石远321)和PHSPDel(新陆早26)驱动GhHSP70基因的表达模式的差异，将4-5片真叶的棉花幼苗分别用15％PEG(聚乙二醇)营养液(向1/2Hoagland营养液中加入PEG至PEG含量为15％得到的液体)处理6h，250mM NaCl营养液(向1/2Hoagland营养液中加入NaCl至NaCl含量为250mM得到的液体)、100μM ABA(脱落酸，Abscisic acid)营养液(向1/2Hoagland营养液中加入ABA至ABA含量为100μM得到的液体)和100μM SA(水杨酸)营养液(向1/2Hoagland营养液中加入SA至SA含量为100μM得到的液体)分别处理3h，对照组用1/2Hoagland营养液培养；提取样品RNA，通过实时荧光定量检测GhHSP70基因转录水平的表达量。结果发现，在非生物逆境胁迫下，陆地棉品种“石远321”(简称石远321)的PHSPIn9启动子驱动GhHSP70基因的表达量的上调程度均显著高于陆地棉品种“新陆早26”(简称新陆早26)的PHSPDel启动子。结果表明，棉花材料石远321的突变型启动子PHSPIn9在非生物逆境的诱导下具有更强的驱动活性(图3)。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示石远321与新陆早26相比具有显著性差异，P＜0.01(**)表示石远321与新陆早26相比具有极显著性差异。

实施例3、PHSPIn9与PHSPDel是非生物逆境诱导型启动子

1、载体的构建

分别以实施例中1中石远321和新陆早26测序正确的启动子单克隆菌株的质粒DNA为模板，通过HindIII-P-F/NcoI-P-R引物进行PCR扩增，给基因启动子加上不同的接头。(下划线部分分别为限制性内切酶HindIII和NcoI的识别位点)

HindIII-P-F：

NcoI-P-R：

PCR扩增体系和程序见表2：

表2 PCR扩增反应体系和程序

用DNA产物纯化试剂盒(TIANquick Midi Purification Kit)纯化PCR产物。

通过HindIII和NcoI内切酶双酶切纯化的PCR产物和pCAMBIA3301(可常规市购)，纯化酶切产物。酶切反应体系及反应条件见表3：

表3酶切反应体系及反应条件

利用T₄连接酶(Thermo Scientific)将酶切后含有粘性末端的线性pCAMBIA3301载体和目的启动子片段进行连接，重组质粒连接体系见表4：

表4重组质粒连接体系和反应条件

连接反应完成后，将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞(Trans1-Blue)(全式金)，在不含抗生素的液体LB培养基中培养1小时，培养条件为：摇床转速180rpm、温度37℃。4000rpm离心1min去上清，收集菌体，涂抹于含有抗生素(Kan，50μg/mL)的固体LB培养上，倒置培养皿，37℃过夜培养。待培养基上长出单克隆菌落，挑取单克隆菌落于含抗生素(Kan，50μg/mL)液体LB培养4小时，摇床转速200rpm、温度37℃。通过菌落PCR筛选阳性转化菌株，以单菌落为PCR模板，分别利用构建载体引物和PCR Mix(2×

PCR SuperMix)扩增启动子目的片段。以0.8％琼脂糖检测扩增结果，将阳性克隆菌株送测序。测序正确的重组载体即为pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS和pCAMBIA3301-PHSPDel-GUS(图2)。

pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS是将pCAMBIA3301中启动GUS转录的CaMV35S取代为PHSPIn9的重组表达载体。

pCAMBIA3301-PHSPDel-GUS是将pCAMBIA3301中启动GUS转录的CaMV35S取代为PHSPDel的重组表达载体。

2、表达载体的遗传转化

将pCAMBIA3301、pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS和pCAMBIA3301-PHSPDel-GUS分别通过农杆菌介导的花序浸染法转入盛花期的野生型拟南芥(WT，Col)(哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)，Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC))。

拟南芥阳性植株筛选：

将T₁代展开两片子叶的拟南芥，用含有120mg/L的草铵膦水溶液喷洒拟南芥，连续喷洒3天，每天1次。培养约一周后，能够正常生长(根系发育正常、植株直立、叶片鲜绿)的植株，初步确定为转基因阳性植株，将这些植株移入土壤中生长。待初步筛选的T₁代阳性植株开始抽薹，提取叶片DNA，进行PCR检测。分单株收获阳性植株的种子。取T₁代植株获得的种子分别用草铵膦继续进行抗性筛选，选择抗性分离比为3:1的T₂代植株单株收获。对T₂代种子继续筛选，标记全部为抗性植株的株系，收获后的种子记为转基因纯合系种子(即T₃代)。得到pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS转化拟南芥得到的T₃代植株(简称T₃代pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS转基因拟南芥)、pCAMBIA3301-PHSPDel-GUS转化拟南芥得到的T₃代植株(简称T₃代pCAMBIA3301-PHSPDel-GUS转基因拟南芥)和pCAMBIA3301转化拟南芥得到的T₃代植株(简称T₃代pCAMBIA3301转基因拟南芥)。

3、非生物逆境处理下拟南芥中启动子驱动GUS表达模式鉴定

为检测不同GhHSP70突变启动子PHSPIn9和PHSPDel在非生物逆境胁迫下的驱动活性，分别检测了步骤2中的T₃代pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS转基因拟南芥、T₃代pCAMBIA3301-PHSPDel-GUS转基因拟南芥和T₃代pCAMBIA3301转基因拟南芥中报告基因GUS的表达量，结果见表5。

具体方法如下：

转启动子融合GUS基因的T₃拟南芥生长3周后，选取T₃代pCAMBIA3301-PHSPIn9-GUS转基因拟南芥、T₃代pCAMBIA3301-PHSPDel-GUS转基因拟南芥和T₃代pCAMBIA3301转基因拟南芥这3个株系，每个株系分别进行15％PEG水溶液处理6h(PEG处理)，250mM NaCl水溶液、100μM ABA水溶液和100μM SA水溶液分别胁迫处理3h(即分别为NaCl处理、ABA处理和SA处理)，同时设置用水进行处理的对照(CK处理)，处理方式为用溶液浇灌拟南芥的根部：具体为拟南芥用相同重量的有机土在种植在花盆中，放在同一托盘中，分别用不同的处理溶液进行浇灌。对照组用相同体积的水浇灌。每种处理3个生物学重复(3个植株)，液氮速冻存放于-80℃保存待用。提取每个样品的总RNA，通过实时荧光定量PCR检测GUS基因表达量，以T₃代pCAMBIA3301转基因拟南芥的GUS基因表达量为1，以组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化，用2^-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis ofrelative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-△△CTmethod.Methods.25:402-408)分析GUS基因在非生物逆境处理下的表达情况。实时荧光定量PCR中的特异扩增GUS基因的引物为GUS-Rt-F：GTAATGTTCTGCGACGCTCAC；GUS-Rt-R：CCCGGCTAACGTATCCACGC；内参基因引物为：Actin2-F GAAATCACAGCACTTGCACC；Actin2-RAAGCCTTTGATCTTGAGAGC。结果表明，在PEG、NaCl和SA处理下，PHSPIn9启动子驱动的GUS基因相对表达水平极显著高于PHSPDel和CaMV35S。在ABA诱导下，PHSPIn9与PHSPDel驱动的GUS基因表达量差异不显著，但显著高于对照CaMV35S。根据试验结果可知，PHSPIn9突变型启动子在非生物逆境诱导下，能显著上调报告基因GUS的表达量(图4)。采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示与T₃代pCAMBIA3301转基因拟南芥相比具有显著性差异，P＜0.01(**)表示与T₃代pCAMBIA3301转基因拟南芥相比具有极显著性差异。

表5不同非生物逆境处理条件下转基因拟南芥的GUS基因相对表达量

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆农业大学

<120> 非生物逆境诱导型启动子及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 596

<212> DNA

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum）

<400> 1

tctcttatgg ttgggttggg actatggata attttagaca ttgtatcaaa aagaagagat 60

ataattaaaa tctataataa aattatttaa aaaagaattt gtatatcact atagaaatat 120

ttatttattt attttgggca tcttaaaaat atatttaata acaaagtttt caaccaaaaa 180

agaatataaa atgaaggtcc atatgtgtaa ttcgggttga gtttgaatcc aaacccgaaa 240

aagacaagac ccgtcataag cgcgtagccg acttcattca aaaagaaaaa tcaaaattct 300

cacccgccca aaacacgcaa ctaaaaactc gtggtggagc ccacgacttc tttttccaaa 360

tccgaaaatc aaatctcaac cattcattct atcaaatcca acggccgtaa accccccatt 420

ttccctccga acattctaga accctagtca ccctaattta aaatatataa aagcactaac 480

ccttaatact aagccacaca gttcattcta aagagcaact cttcgttctt cattttcttt 540

ttttcttttt ttctttttct ctctagtttc tttgattttt cttggaattt agagtg 596

<210> 2

<211> 587

<212> DNA

<213> 陆地棉（Gossypium hirsutum）

<400> 2

tctcttatgg ttgggttggg actatggata attttaaaca ttgtatcaaa aaaaagagat 60

ataatcaaaa tctataataa aattatttaa aaaaagaatt tatatatcac tatagaaata 120

tttatttatt tattttgggc atcttaaaaa tatatttaat aacaaagttt tcaaccaaaa 180

aagaatataa aatgaaggtc catatgtgta attcgggttg agtttgaatc caaacccgaa 240

aaagacaaga cccgtcataa gcgcgtagcc gacttcattc aaaaagaaaa atcaaaattc 300

tcacccgccc aaaacacgca actaaaaact cgtggtggag cccacgactt ctttttccaa 360

atccgaaaat caaatctcaa ccattcattc tatcaaatcc aacggccgta aagcccccat 420

tttccctccg aacattctag aacctagtca ccctaattta aaatatataa aagcactaac 480

ccttaatact aagccacaca gttcattcta aacagcaact cttcgttctt cattttcttt 540

tttctttttc tctctagttt ctttgatttt tcttggaatt tagagtg 587

Claims

1.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子为下述任一种：

A1)所述DNA分子为PHSPIn9或PHSPDel：

所述PHSPIn9是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.1的双链DNA分子；

所述PHSPDel是一条链的核苷酸序列是SEQ ID No.2的双链DNA分子；

2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子来源于棉花。

3.根据权利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子来源于陆地棉。

4.根据权利要求1-3任一所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子是非生物逆境诱导型启动子。

5.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述B1)至B6)中的任一种：

B1)含有权利要求1-4中任一所述的DNA分子的表达盒；

B2)含有权利要求1-4中任一所述的DNA分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B3)含有权利要求1-4中任一所述的DNA分子的重组微生物、或含有B1)所述表达盒的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；

B4)含有权利要求1-4中任一所述的DNA分子的转基因植物细胞系、或含有B1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B5)含有权利要求1-4中任一所述的DNA分子的转基因植物组织、或含有B1)所述表达盒的转基因植物组织；

B6)含有权利要求1-4中任一所述的DNA分子的转基因植物器官、或含有B1)所述表达盒的转基因植物器官。

6.权利要求1-4中任一所述的DNA分子在作为启动子中的应用。

7.权利要求1-4中任一所述的DNA分子在制备重组生物中的应用。

8.权利要求1-4中任一所述的DNA分子在植物育种中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物为锦葵科植物或十字花科植物。