CN113150102A - 一种合成表面活化剂的成分、方法以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种合成同加拉泡蟾成分。合成同加拉泡蟾成分包括六种全合成的雷纳舒明蛋白(RSN‑1至RSN‑6)，其中仅合成RSN蛋白的活性部分，还包括六种全合成的多糖，该多糖由四种四糖、一种七庚糖以及一种不可吸收糖组成。描述了泡沫的多种创新应用。

Description

一种合成表面活化剂的成分、方法以及应用

序列表的相关声明

本专利申请相关序列表是通过纸质副本采用文本格式提供的，特此在说明书中予以引用。包含序列表的文本文件名称为Sequence_Listing_222857 1.txt。文本文件大小为9KB，创建日期为2020年6 月29日，采用电子方式通过EFS-Web提交。

优先权要求

本专利申请要求备案日期为2019年6月28日编号62/868,137的美国临时专利申请以及备案日期为2020年3月26日编号为63/000,141的美观临时专利申请中的权利。以上引用的专利申请作为参考而在本次申请中通篇予以引用。

技术领域

本发明通常涉及材料科学，尤其涉及生物化学以及分子生物学。本发明的主题涉及同加拉泡蟾泡沫的全合成,其中包括用于各种应用的该泡沫的蛋白以及多糖。

技术背景

对于很多生物体而言，通过动物来产生泡沫并非是一种不常见的繁殖性状1。但是，一些生物体产生的表面活性泡沫可以在数天内处于稳定状态。

此类泡沫的稳定时间可能长达57天而且适应环境的天气变化2-3。采用蛋白基表面活性剂的情况下，此类泡沫趋向于形成水基泡沫。业界曾经针对一个特定的生物体Engystomops pustulosus(常被称为同加拉泡蟾)开展了大量的研究，涉及采用该生物体的繁殖泡沫4。这个品种具有一种有趣的泡沫结构，其原因是由于泡沫具有其它品种并不常见的抗真菌和抗菌性质5。此外，抗菌和抗真菌性质也不会干扰青蛙的胚胎或者导致青蛙胚胎细胞死亡。

泡沫的稳定时间长达10天，而且不存在表面张力效应导致的任何脱水或者丧失泡沫结构的情况1。值得注意的是，泡沫仅由蛋白和多糖组成6。之前的文献中，并未在这种泡沫中发现任何已知的去污剂或者表面活性剂。由于这种引人注意的不存在去污剂的情况，使得业界大量研究了蛋白作为表面活化剂的用途7-8。同加拉泡蟾泡沫巢具有6种独特蛋白，这些蛋白被称为雷纳舒明蛋白。这些蛋白包括雷纳舒明(RSN)1至RSN 6，而且RSN 2是青蛙泡沫中起到表面活性剂作用的重要蛋白。人们发现这些蛋白属于岩藻糖型蛋白，在多糖的1位置与羟基结合9。正是这些表面活性剂对泡沫巢起到了稳定作用1。业界曾经研究过泡沫的蛋白，并且采用重组DNA技术和成果这种蛋白1。曾经采用PCR分析表征了蛋白序列，但是任何研究均未开发出一种方法来表征泡沫的多糖。没有多糖，则泡沫仅具有10埃的厚度，而从同加拉泡蟾泡沫巢采集的泡沫，厚度为85埃。没有多糖，就无法人工合成泡沫。

一项研究尝试采用不同单糖与蛋白反应来判定青蛙泡沫巢的糖类，从而判定其溶解性。本次研究证明了，蛋白rsn1-6仅溶于半乳糖，这种半乳糖是常见的岩藻糖型蛋白。

多糖的表征具有一定挑战性，其原因是由于多糖不容易接受质谱分析法的电荷10。只是最近通过采用基质辅助激光解吸电离(MALDI)并结合质谱分析法(MS)，才可以表征多糖11。本次研究项目结合采用了MALDI-MS来判定同加拉泡蟾泡沫中多糖的结构与序列，以便人工合成青蛙泡沫巢。在青蛙泡沫巢中共计发现了6种多糖，而且对全部6种多糖进行了排序，以判定组成多糖的每种具体单糖。

发明内容

本发明包括了一套组合的生物化学/分子生物学方法论，用于表征一种独特的合成有机表面活性蛋白，该蛋白使得自身具有多种多样的应用。

同加拉泡蟾泡沫巢具有6种独特蛋白，这些蛋白被称为雷纳舒明-1(RSN-1)至雷纳舒明-6(RSN-6) 蛋白。for its表面活性剂capabilities as由于这些蛋白可能形成天然泡沫，因而业界从这些蛋白表面活性能力角度出发，大量研究了同加拉泡蟾产生泡沫的情况。这种天然泡沫巢的稳定时间长达10 天，而且不存在表面张力效应导致的任何脱水或者丧失泡沫结构的情况。值得注意的是，任何研究组均未能采用这种泡沫的人工合成物来模拟这种稳定性。

本发明可能包括仅涉及RSN蛋白活性部分的创新合成方式，这导致适当折叠蛋白，从而允许在合成泡沫中保持预期的表面活性能力。一个实施例描述了仅采用活性氨基酸链顺利合成RSN 1至6，以及由此获得的表面活性泡沫的大量重新应用。

如本发明的一些实施例，一种创新的合成表面活化蛋白泡沫被描述为具有改善的稳定性以及持久性。

如本发明的其它实施例，采用合成表面活化蛋白泡沫明显强化了水力压裂法以及可持续分离沥青砂矿床中油类的功效。

如本发明的另外实施例，采用合成表面活化蛋白泡沫明显提高了培养植物的生长与繁殖。

又如本发明的其它实施例，采用合成表面活化蛋白泡沫来强化活性有机物的活性以及转运。

又如本发明的另一个实施例，采用合成表面活化蛋白泡沫改善了海产食品的运输以及持久性。

以下采用更为详尽方式描述了本发明的此类实施例和其它实施例。

附图说明

图1示出了可用于RSN蛋白的示例性载体。示出的载体为针对每种合成的雷纳舒明蛋白设计的载体。

图2示出了泡沫巢、蝌蚪以及青蛙的各种图。

图3示出了一张泡沫多糖质谱分析图。

图4示出了质谱分析图中四糖的裂解规律。

图5示出了质谱分析图中四糖的裂解规律。

图6示出了质谱分析图中四糖的裂解规律。

图7示出了质谱分析图中四糖的裂解规律。

图8示出了质谱分析图中多糖的裂解规律。

图9示出了质谱分析图中多糖的裂解规律。

图10和11示出了雷纳舒明蛋白的胰蛋白酶消化相关的质谱分析图。

图12阐明了一种提出的同加拉泡蟾泡沫巢糖蛋白结构，其中包括表面活性蛋白(RSN-2、RSN-3和RSN-5)以及结合蛋白(RSN-1、RSN-4以及RSN-6)。

图13示出了采用

处理的12株生长四周的拟南芥(哥伦比亚型)植物。

图14示出了采用

处理的拟南芥(哥伦比亚型)植物的均质化对照叶片以及试验叶片。

图15示出了5天之后对照叶片样本GC/MS运行的色谱图。22.04分钟时的峰值表示咖啡因的内部标准峰值，而33.49分钟时的峰值则表示农药的峰值。

图16示出了5天之后试验叶片样本GC/MS运行的色谱图。22.04分钟时的峰值表示咖啡因的内部标准峰值，而33.49分钟时的峰值则表示农药的峰值。

图17示出了10天之后对照叶片样本GC/MS运行的色谱图。22.05分钟时的峰值表示咖啡因的内部标准峰值，而33.43分钟时的峰值则表示农药的峰值。

图18示出了1天之后试验叶片样本GC/MS运行的色谱图。22.05分钟时的峰值表示咖啡因的内部标准峰值，而33.42分钟时的峰值则表示农药的峰值。

图19示出了一种切向流过滤系统。

图20示出了GC/DCM(下图)以及RSN混合物(上图)的色谱图，示出10分钟之前的芳族区域以及15-25分钟之间的碳链脂肪族化合物。

图21示出了3次通过切向流过滤系统之后RSN混合物的质谱分析。10分钟之前的芳族区域以及 15-25分钟之间的碳链脂肪族化合物。

图22示出了针对切向流过滤系统开展产品回收之后RSN混合物的质谱分析。10分钟之前不存在芳族区域，以及15-25分钟之间的碳链脂肪族化合物。

图23a以及23b示出了RSN 1-4的Kirby Bauer抗菌测定，示出0小时以及培养24小时之后的情况。

图24a以及24b示出了RSN 5-6、RSN 1-6混合物以及对照样品的Kirby Bauer抗菌测定，示出0 小时以及培养24小时之后的情况。

图25示出了RSN 1在20°至80℃温度范围内变性的光谱分析。

图26示出了RSN 2在20°至90℃温度范围内变性的光谱分析。

图27示出了RSN 3在20°至70℃温度范围内变性的光谱分析。

图28示出了RSN 4在20°至90℃温度范围内变性的光谱分析。

图29示出了RSN 5在20°至90℃温度范围内变性的光谱分析。

图30示出了RSN 4在20°至90℃温度范围内变性的光谱分析。

图31 a示出了24小时之后不采用稳定剂的脂质体照片。黑色方框是图31b中照片的放大位置。

图31 b示出了24小时之后不采用稳定剂的脂质体的放大照片。

图32a示出了24小时之后采用稳定剂的脂质体的照片。黑色方框为图32b中照片的放大位置。

图32b示出了24小时之后采用稳定剂的脂质体放大照片。

图33a示出了96小时之后不采用稳定剂的脂质体的AFM照片。黑色方框为图33b中照片的放大位置。

图33b示出了96小时之后不采用稳定剂的脂质体的放大AFM照片。

图34a示出了96小时之后采用稳定剂的脂质体的AFM照片。黑色方框是图34b中照片的放大位置。

图34b示出了96小时之后采用稳定剂的脂质体的放大AFM照片。

图35示出了96小时之后采用稳定剂的脂质体的AFM照片。

图36a示出了1个月之后采用稳定剂的脂质体的AFM照片。黑色方框是图36b中照片的放大位置。

图36b示出了1个月之后采用稳定剂的脂质体的放大AFM照片。黑色方框是图36c中照片的放大位置。

图36c示出了1个月之后采用稳定剂的脂质体的放大AFM照片。

图37示出了2个月之后采用稳定剂的脂质体的显微照片。

具体实施方式

以下通篇说明中，要求了特定详情，以便更深入理解本次指导。但是，无需这些详情依然可以实践本次指导的主题。在其它情况下，并未详细示出或者说明众所周知的要素，以避免不必要地导致本次指导令人难以理解。因此，说明书以及图片应当涉及示例而非狭义事项。

通过减少合成蛋白中氨基酸的数量，可以修改本文所述的合成RSN蛋白，从而仅包括成熟RSN蛋白的DNA代码。采取前体形态合成RSN蛋白，该蛋白具有氨基末端疏水性信号肽。

真核細胞中，这种信号肽将蛋白指引至分泌部，具体做法是关联并且插入到内质网(ER)之中。在这一过程中，膜结合酶通过蛋白水解方式裂解信号肽，而该膜结合酶专门执行这一功能。成熟肽的活性形态是众所周知的，某些情况下，在清除这种信号肽之前是无法发挥功能的。这一方法中，采用成熟氨基酸序列，在细菌中以重组方式合成活性RSN蛋白。正如产生的泡沫的持久性以及稳定性所展示的，与前体形态相比，已经证明这种成熟序列具有提高的活性。

如本发明所述，6种RSN蛋白的基因序列分别如下所述：

RSN-1(384bp)(Syntetic Amino Acid Sequence No.1)

GGGNIGGGAKLGPEKPATPGIQDLLKSLLSVLNLSPPAIPEDAEAVSYRDAKNGKFRLIKIHLGGELYCHVKQIAGPILALPIVSDVVE VTGKECGKTEDDPLEDFPIP

RSN-2(288bp)(Synthetic Amino Acid Sequence No.2)

LILDGDLLKDKLKLPVIDNLFGKELLDKFQDDVKDKYGVDTKDLKILKTSEDKRFYYVSVDAGDGEKCKFKIRKDVDVPKMVGRKCRKD DDDDDGY

RSN-3(519bp)(Synthetic Amino Acid Sequence No.3)

IDPTGLVQILLLEQVVHKIPPGNINLARTGIATQDSDYTASAVPSEARLAIDGNRNSDFNQKSCSHTGGNEPAWWRLELKKKSKISVVV IAIRSDCCMDRFKGAELRIGNSQDATVNPICGKVSAVKGSNYLFCCDGMEGKYISVVIPDRHEFLSLCEVEVYGAKPIEGTHCK RSN-4(522bp)(Synthetic Amino Acid SequenceNo.4)

NRNLALDGRATMSSIWMDPDIRQSFLGVAMNGIDGNTDSVYFHGSCFHTGLDSPAWYRVDLLRTSKISSITITNRGDFGSRTNGAEIRI GDSLANNGNNNPRCALVTSIADGETRTFQCNNMVGRYVNIVLTGKTEFLHLCEVQIFGENLPRSFSCQYSNDGMITLLVSTRFMK RSN-5(531bp)(Synthetic Amino Acid SequenceNo.5)

GAPGGAAGPLLVLNILGSVVHETKPPEGVNLALKGIASSDSIASNGSVTGLAAKAIDGIRVSDFFKGHCSLTNGLNNPTWWKVDLKKSY KISSVFVTNRDDCCTERLLHAEIRIGSNPDHNHNP；ICAEVKTKASSNIGFCCGGMEGRYVSVSVPRKEQLSLCEVEVYGDLKKVLHCA RSN-6(690bp)(Synthetic Amino AcidSequence No.6)

ETLCIPGRMKQLDAGAGRVVAVKSNGDVYQLLENNWVQIPGKLIHVTVGPAGLWGVNKDKNIYKYVDNDWLQVDGLLNQIDAGGNRFVV GVNDNEDIFCLNQDQTTSNAVKLDYKGVDGKLKYYSSGGYGSWGVNAAYDIFYRRNVHPMSCQGTNWENVEGKLVMLEVAEDGSVYGVN YNGHVYKREGITAGNPMGTSWTYLKVDEKVRHVSYDRGVLYVVTIDDRIFRC

对于RSN-1、RSN-2、RSN-3、RSN-4RSN-5和RSN-6而言，RSN蛋白的分子量分别为11.38kDa、 11.11kDa、18.85kDa、19.26kDa、18.73kDa以及25.69kDa，而且并不附带任何组氨酸标签。

可以修改这种蛋白序列，以确保合成实施例仅产生成熟RSN蛋白。真核(高阶生物体)细胞以及原核(细菌)细胞均采用信号肽将蛋白指引至其各自的分泌机制。事实上，采用原核宿主表达的情况下，已知可以有效清除很多源自真核宿主的很多信号肽。

采用设计在细菌细胞内部和外部发生的累积，可以开展蛋白生产：外部蛋白纯化策略依赖于培养基中细胞之外蛋白产物的生产与累积的细胞分泌机制。在此类情况下，蛋白可能具有某种氨基末端信号肽，以便利用分泌部，而膜结合蛋白酶会裂解这种分泌部。通过离心作用丸粒化细胞之后，由于成熟蛋白会表现为上层清液中的相对纯产物，因此随后会进行纯化。由于一些蛋白可能在细胞外环境并不会处于稳定状态，而且其纯化需要浓缩非常大量的培养基，因而不总是可能采用这种方法。而且，蛋白生产的强诱导可能超出分泌部的限度，导致以包涵体形态在细胞内部累积前体产物。如本文所述，一种可能的方案是避开整个分泌部，而直接合成成熟形态。本实施例导致高产出成熟活性形态，而且不会出现前体泡沫造成的污染。因此这一方案提供了更高的合成成熟蛋白产出量，可以适当折叠，而且保持了活性产物的特性。尽管我们曾经采用过内部累积方案，但是预计我们采用经由分泌通路方案的情况下，可以导致外部累积成熟产物，因而我们会获得等效结果。

示例性生产方法说明

众所周知的是，目前存在各种技术，可以采用这些技术来生产上述一种或者多种合成RSN蛋白。以下将详细说明用于获得令人满意结果的不受限工艺的一个实施例。当然，对于我们观察的结果而言，目前的一种常规技巧是理解达到这种结果无需采用所有的各个步骤以及纯化工艺的详情，而且涵盖而且可能采用很多替代方案。本发明的生产阶段包括：DNA载体设计、细菌生长、蛋白表达、蛋白纯化、泡沫稳定性以及质谱表征。各个阶段均会导致合成人工RSN蛋白，而该蛋白保持了表面活性能力。下文详细描述了这些阶段。同样地，这些步骤仅为合成RSN泡沫的方法的实施例之一，而且并非意在起到限定作用。

DNA载体设计

制备需要插入到DNA载体中的亚克隆RSN基因的情况下，从基因序列中消除了对应于1-23氨基酸之间的DNA。如本发明的各种实施例所示，6种RSN蛋白中每种蛋白的载体均设计包含氨苄青霉素抗性基因，从而仅转化(含载体)需要生长的细胞。此外，本文所述的载体设计包含亚克隆RSN基因上游的LacO基因启动子，确保仅在采用异丙基II-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)诱发的情况下表达RSN蛋白。这一载体还相容于宿主，在这一示例性实施例中，该宿主是BL21(DE3)细菌。(请参见图1)。

细菌生长

如本次发明的所述实施例，生产厂商(VectorBuilder)采用50：50甘油：水储备溶液的形式提供了含有各种载体的转化细胞。采用-80℃贮存这种溶液，以避免细胞死亡。从冷冻箱中取出的情况下，将细菌菌株划线接种到溶原性肉汤(LB)氨苄青霉素琼脂平板上，从而允许大肠杆菌生长，并且在 37℃条件下彻夜培养。此类划线接种发展成各个菌落。一旦菌落具有足够的大小，则将其接种到小型 LB氨苄青霉素100mL培养物上。另外实施例中，可以针对1-2ml培养物而进行源自平板的首次接种，此后，可以在次日将其转移到100ml培养物之中。在37℃条件下令这些培养物生长2天，并且持续晃动，直至光密度为0.6为止。接下来，采用源自小100mL培养物的20mL溶液接种1L的LB氨苄青霉素介质，然后放入37℃的恒温振荡培养箱之中，时间为6小时。

分离质粒

为了验证源自载体构建器的细菌细胞是否具有正确的插入片段，发明人包括了用于纯化载体的工艺说明。这一工艺具有众多可用的商业实施例。拥有一般行业技术的人员随时可了解可用的方法，而且此类方法可用于完成这一步骤。如本发明的一个实施例所述，分离了质粒。通过将甘油储备溶液划线平板接种到LB氨苄青霉素平板上，获得了含有质粒而且RSN1-6序列的大肠杆菌细胞单一菌落。从每个平板(RSN 1-6)拾取了一个单独的菌落，而且接种到5ml液体LB介质(含有氨苄青霉素)的玻璃试管之中，并且在37℃条件下彻夜生长，而且在次日晃动，以便分离质粒。次日早晨，在分离质粒之前，检查了培养物的光密度(O.D.)，而且估算大约为0.8-1。在这一特殊实施例中，采纳了Bimboim以及 Doly(1979)标准化的碱裂解法，以便从细菌培养物中分离出质粒DNA。将采集的可分量移入1.5-ml 微量离心管之中，并且采用台式离心机，以13000rpm的速度将其旋转两次，时间为1分钟。弃用上层清液，并且通过在数秒内将试管倒置放在一片低尘擦拭纸上，从而彻底清除液体。接下来，向每个试管中加入100μl的再悬浮溶液(PI缓冲液)，而且进行涡流处理，以便完全重新悬浮细胞团块，然后采用100μl的裂解液(P2缓冲液)并且通过轻轻导致试管5-6次的方式进行混合。溶液快速变为透明而且变得更黏稠，表明发生了细菌裂解。接下来，添加150μl的中和溶液(P3缓冲液)，并且通过倒置试管数次的方式进行混合。在此时，细菌染色体DNA的外观通常表现为白色沉淀物。采用13000转/ 分钟(rpm)对试管进行离心处理，时间为10分钟，然后，在不扰动白色沉淀物的情况下，将上层清液小心地移如新帖标签的1.5-ml微量离心管之中。向每个试管内添加2mL的绝对低温乙醇，并且通过将试管导致数次的方式进行混合。采用13000rpm的速度旋转试管，以便令质粒DNA(透明团块)沉淀，时间为10分钟。然后，弃用上层清液，继而通过将试管导致置于低尘擦拭纸上，从而清除剩余的液体；随后将其风干，时间为10-20分钟。最后，采用50μl Tris-EDTA缓冲液的溶解质粒DNA团块，具体做法是数次对溶液进行吸液，以促进团块混合。采用1％琼脂糖凝胶以及lx TAE缓冲液运行提取的质粒，并且采用溴化乙锭(EtBr)进行染色，以便在UV凝胶文档成像系统中开展观察。

在本发明的另外一个车实施例中，为了确认具体的培养物含有正确尺寸的DNA载体，可以从生长的培养物中取可分量，并且可以开展DNA载体纯化。应当理解的是，存在众多周知而且市面销售的多种方法可用于纯化源自细菌细胞的载体结构，属于最新技术的人员将这种称为迷你制备或者最大制备。

采用序列特定引物的RSN1-6插入片段的PCR扩增

如本发明所述的实施例，载体的尺寸大大超过插入的DNA序列，因此可选的优点是可以进一步确认插入到的基因序列具有正确的大小。人们可以选择多种方法来开展此项工作，而且从事最新技术实践的人员熟悉这些方法。比如，人们可以采用限制酶来清除特定的基因片段，并且确认其大小。人们还可以对插入的部分进行排序。如一个实施例所述，采用了PCR以及凝胶电泳，以及22μl的无核蒸馏水，以便将混合物的总体容积设定为50μl。采用Flexlid Thermal Cycler(Eppendorf，N.Y，USA)运行标准的35次循环PCR反应。采用lxTAE缓冲液髂，在1％琼脂糖凝胶上运行15μl的扩增PCR产物，并且采用溴化乙锭(EtBr)进行染色，以便观察产物。为确认产物PCR大小，采用了10μl的100bp 梯状物(NEB，MA，USA)。采用序列特定引物的情况下，假设RSN-1可以提供386bp产物，RSN-2为 290bp产物，RSN-3为521bp产物，RSN-4为524bp产物，RSN-5为533bp产物以及RSN-6为692bp 产物)。发现重组载体中顺利克隆了插入序列。与100bp梯状物相比，PCR条带表现出匹配预计的大小。这一结果确认了，重组大肠杆菌在曾经转化进入的质粒之中具有RSN1-6序列。

蛋白表达

细菌细胞一旦生长，而且确认生长的细菌培养物具有正确的插入片段，则可以通过把异丙基II-D- l-硫代半乳糖苷(IPTG)放入培养物之中，达到1mM的最终浓度，来表达RSN蛋白，并且在室温条件下，在摇晃的同时彻夜保存。一旦完成蛋白的表达，则清除大块培养物并且开始蛋白纯化。

蛋白纯化

目前存在很多纯化技术。拥有一般行业技术的人员理解可以获取多种替代方案，而且下列详细发明仅为可以采用的纯化技术的一个简单无限制的实施例。此外，可以采用不同的纯化技术，或者RSN之间可能存在变化。可以采纳镍亲和色谱工艺来开展蛋白纯化。采用10,000rpm的速度，对源自1L培养物的细胞团块进行20分钟的离心处理。掌握最新技术的人员当然了解替代速度可以作为分离方式。清除并且弃用上层清液。然后结合剩下的团块，并且在-80℃条件下冷冻。取出团块，然后向每个试管中添加40mL的NPI-10缓冲液。然后采用细胞破碎仪对试管进行声纳降解。将试管放入冰浴之中，并且采用30秒开启，1分钟关闭的间隔进行声纳降解，振幅为80％。声纳降解之后，将样本放入4℃的离心机中，然后采用12,000rpm的速度运行20分钟。二次开展这种运行，以确保上层清液中不存在任何细胞碎片。接下来，取出上层清液并且在4℃条件下彻夜贮存。

然后，可以对样本进行镍亲和柱纯化，从而采用Novagen His-Bind树脂纯化套件仅提取重点蛋白。本套件允许在每次运行时最多提取10mg的各种蛋白。将2mL树脂放入柱中，采用重力过滤方式令树脂凝固，从而开始这一工艺。接下来，将5mL的电荷缓冲液放入柱中，以便提供柱的镍基，由于蛋白上存在组氨酸标签，因而蛋白可以与该镍基结合。一旦完成电荷缓冲液，则采用3mL的结合缓冲液来清理柱内的所有污染物。然后将样本提取物(200mL)放入柱内。为确保适当提取，采用每小时10mL 的流量。一旦完成样本提取，则再次进行清洗，以清除柱内的所有污染物。最后，采用洗脱缓冲液从柱内将蛋白提取到6mL的缓冲液之中。接下来，取出这一缓冲液，搅动的情况下，会形成泡沫。

执行二次纯化。如本示例性实施例所述，采用Sartorius Vivaspin 20离心管的情况下，通过二次纯化将蛋白溶液从1mg/mL浓缩为10mg/mL。比如，本实施例中，试管具有10,000分子量截点(MWCO)，使得溶液中仅剩余大小超过10,000分子量的蛋白。然后提取该溶液，并且彻夜冻干，以清除所有剩余的污染物以及源自蛋白的溶剂。然后采用电喷射离子化结合质谱分析法(ESI-MS)以及基质辅助激光解吸电离结合质谱分析法(MALDI-MS)来分析蛋白，以确认蛋白合成。在替代性安排中，还可以采用 SDS-PAGE凝胶来验证大小。

在其它替代性实施例中，为了纯化源自包涵体的蛋白，采用低浓度采纳的Urea及/或GdnHCL等柔性变性剂来改善细胞包涵体的产出量。

泡沫稳定性

本文报告的方法以及其它方法和本领域已知的替代方案，均允许实质性提高6种RSN蛋白的泡沫稳定性。比如，所述方法产生的泡沫具有的稳定性远超之前报告的合成方法。

所述方法指示采用缩短氨基酸序列来重组合成活性RSN蛋白。由于蛋白中缺乏其它氨基酸，因此如本发明所述方法比现有技术中提议的方式实质性地增加了泡沫稳定性。在某些情况下，泡沫稳定性可能超过10天，而且具有的稳定性可能至少是天然雷纳舒明蛋白稳定性的5倍或者更多倍。，并且不存在表面张力效应导致的任何脱水或者丧失泡沫结构的情况。而且，由于明显降低了错误折叠的可能性，因此合成蛋白中数量减少的氨基酸还使得可以适当折叠合成蛋白。简言之，合成蛋白中存在更多氨基酸的情况下，更可能发生错误折叠，这样就限制了合成蛋白模拟天然雷纳舒明结构的能力。

在另外实施例中，采用了其它合成蛋白方法，其中包括采用逐步合成法、片段组合法甚至是化学连接的化学合成。

表面活性蛋白的创新应用

表面活性蛋白泡沫可用于各种场景，以便实现现有技术中并未提供的结果。表面活性蛋白络合物表现出亲水尾部(亲水性)以及疏水尾部(疏水性)，使其可以成为水基环境与膜质环境之间的桥接结合部分。此类分子络合物的应用极具多样性，而且其范围包括生命保护环境、稳定药物输送系统、改善油类提取方法，乃至确保食品生产行业的持续发展。

蛋白质的疏水性和亲水性尾部以及相关多糖部分综合作用，为这种蛋白络合物提供了相关的活性。这种蛋白络合物的独特结构以及性质导致这种蛋白在各种商业领域的多样性应用。比如，本发明的糖主链确保蛋白的持久完整性，从而改善其可用性。采用重组技术随时可生产大量的蛋白，因而消除了蛋白生产的任何扩展性相关问题。

药物输送

用于肺部药物输送的表面活性剂包括聚山梨醇酯80、泊洛沙姆407以及表面活性素。采用本发明的创新表面活性蛋白可以替代这些现有技术表面活性剂。本技术无需采用有毒的表面活性剂来进行肺部药物输送，同时仍然可以保持强化的药物吸收率。

油气行业应用

如本发明所述，表面活性泡沫一项发明应用是泡沫应用于油气行业，以便改善产出量和降低成本。油气行业的一个主要问题是水力压裂工艺期间会采用有毒化学品。借助这些创新有机表面活性剂，会采用更少的有毒化学品，导致某种“绿色”跟踪工艺。

更具体地，如本发明的一个实施例所述，可以在水力压裂工艺中采用所述表面活性泡沫，而且有益于这一工艺。水力压裂法是通过钻取的方式，从地下矿藏中提取天然气和液烃的工艺(主要是将垂直转换为水平)。在含有所需天然气/液体的区域内，穿透钻管，而且通过注入高压液体来“破碎”矿藏岩石(数万psig)。采用的温度取决于岩石的深度，可能达到200-300°F。水力压裂法采用的液体含有添加的表面活性剂、盐分、砂子等。跟踪的情况下，最好获取所有跟踪物质，这种情况下，此类物质不得留在地下，否则可能污染地下水。应用表面活性泡沫有助于物质流，同时可以在沉积物水力压裂法期间减少摩擦力。泡沫有助于释放油气。比如，由于蛋白可以与油气结合，同时仍然溶解于水溶液，因而表面活性蛋白可能有助于释放油气。一旦形成含有油气、蛋白以及溶剂的水溶液，则可以采用切向流过滤系统过滤溶液，以释放蛋白中的油气。

沥青砂或者含油砂也代表了一种基于以及本发明的实施例。沥青砂属于砂子和沥青的混合物。天然沥青是一种类似于糊剂的物质，由有机物组成，主要为烃类，但是还含有氧和其它原子。采用蒸汽加热砂子-沥青物质来分离砂子与沥青，这种情况下会添加或者不添加一些石油稀释剂。采用本发明中所述表面活性泡沫等表面活性剂(去污剂)，有助于3相分离(砂子、沥青以及水)。处理产生的废物(砂子与水)是一个重要问题。本发明的一个实施例中，采用了本发明的有机表面活性剂，而且可以从所有基质中自然分离出任何油类，此类基质包括砂子。这种有机表面活性剂与沥青砂中的油类结合，可以从溶液中过滤出砂子，仅留下表面活性剂与油类混合物。一旦从砂子中分离出来，则可以采用切向流过滤从蛋白中分离油类。

另外，可以重建并且再次使用天然蛋白，在提高功效的同时大幅降低成本。采用切向流过滤仪器的情况下，可以分离油类与蛋白，这样可以分离蛋白并且与源自沥青砂的油类结合之后，即可再次使用。可以持续使用蛋白，直至蛋白变性为止。泡沫还可以生物降解，可以理想地用于这一工艺，同时降低对于环境的影响。

农业应用

本发明的另一个实施例涉及表面活性蛋白应用于植物。在各种实施例中，喷洒到植物上的情况下，本发明的蛋白表面活性剂倾向于“紧贴”到叶片和茎干上。与营养物/水混合的情况下，本发明可以增加樱花树吸收进入植物的时间，从而加快生长。比如，采用的有机表面活性剂极具黏性，限制了叶片以及茎干上液体的总体蒸发量。

此外，由于有机表面活性剂极具黏性，可以保留在叶片以及茎干上，提供一种涂层，防止任何农药被冲洗掉，因而表面活性剂的“紧贴性”可以提高杀虫剂/农药的功效。应用表面活性剂使得农民可以使用更少的水以及更少的杀虫剂/农药，而且具有生物降解性，节省资源并且是现有实践的一种环境保护作用上乘的替代方案。

活性组织转运应用

本发明的另外一个实施例采用表面活性泡沫来改善器官以及其它活性组织的转运。本应用有助于转运期间任何器官组织中累积任何细菌。此外，本专利申请还允许采用一种有机黏性保护剂来涂覆器官组织，从而在转运期间不会损伤细胞。

而且，如本实施例所述，本发明的表面活性泡沫具有抗菌性。泡沫的抗菌性质和易于气体交换，以及保持含水量，均为保持和转运器官提供了一种理想的保护剂。

食品运输应用

采纳合成表面活化剂可以改善编号2018/0213807美国专利申请中所述的方法。本发明的有机表面活性剂可能有助于提高容易变质食品活体运输的新鲜度。通过延长运输时间并且减轻采用单纯泡沫而非海产食品专用水等任何其它液体以及气体的运输重量，可以大幅增加运输行业的利润。这一工艺使得必须采用泡沫充填放置和运输相关食品的运输集装箱。这一工艺可用于存在变质问题的任何食品类型。

应用涉及活体运输甲壳纲动物以及需要非常注意变质和新鲜度的其它食品。在一些实施例中，将新鲜的甲壳纲动物或者其它海产食品放入至少部分充填泡沫成分的适当容器之中，此类泡沫成分包括本文所述的表面活性泡沫，气体以及水载体。在一些实施例中，在最终包装或者以散料方式提供给消费者之前，作为中间贮存或者包装措施而采用了这种方法。

方法

样本采集

从太平洋大学Marcos GridiPapp实验室的一个同加拉泡蟾种群中采集了青蛙泡沫样本。本实验室提供了一个泡沫巢，采用该泡沫巢来表征泡沫中的分子。对泡沫进行冷冻以及冻干处理，以保留泡沫用于今后的研究。允许卵孵化，并且将蝌蚪置于25℃的水箱中，直至蝌蚪变态为止。一旦完成变态，则将青蛙放入装有岩石以及苔藓的箱中，允许进一步形成泡沫巢，以备日后研究使用(图2)。此后，在水中重建泡沫。在水中采用10％TCA将糖蛋白分离为蛋白与碳水化合物。彻夜静置样本，并且从碳水化合物中分离出蛋白，同时对溶液进行沉淀。接下来，冷冻并且冻干含有碳水化合物的剩余液体。然后，将剩余粉末放入乙醇溶液之中，以便清除碳水化合物中的任何可能存在的污染物。此后，冻干并且贮存分离出的蛋白和碳水化合物，以备日后研究使用。

碳水化合物研究

冻干之后，将碳水化合物重新溶解到80：20乙腈：水溶液之中。然后将溶液放入MALDI平板，通过将1μl的样本放入平板的方式开展分析。一旦样本变干，则将1μl置于干燥样本之上，采用10mg/ml 2,5-二羟基苯甲酸溶液作为基质。在1000-2000m/z范围内运行配备MALDI进口的Thermo LTQ Orbitrap 质谱仪。此后，对碳水化合物对应的峰值进行片段化，以确定多糖的结构。

蛋白研究

将采集的冻干蛋白溶解到100mM碳酸氢铵缓冲液之中，该缓冲液含有8M尿素。然后，添加0.5M 的二硫苏糖醇(DTT)溶液，使得溶液的最终浓度达到5mM DTT。接下来，将混合物置于56℃环境中，时间为45分钟。然后将溶液冷却至室温，并且采用25mM碳酸氢铵稀释为1：5。此后，向混合物中添加0.1M氯化钙溶液，以形成最终浓度为1mM氯化钙。然后，添加浓度为5ug/ml胰蛋白酶，并且在 37℃条件下彻夜培养。接下来，令溶液冷却至室温，并且采用0.4％三氟乙酸进行酸化而停止消化。此后，采用C18 ZipTip清洁样本，并且采用WatersSynapt G2 HD-MS质谱仪开展分析。

结果

碳水化合物结果

发现m/z 967.50、981.51、1003.49、1017.51、1031.53、1281.83以及1744.86条件下会出现碳水化合物峰值(图3)。分别对这些峰值进行片段化，并且开展分析，以判定碳水化合物结构。m/z 967.50 条件下的峰值为[M+Matrix+H]+ion，而且发现片段化为m/z812.42、602.28、513.28、366.21以及 283.72的结果是四糖。发现m/z 812.42条件下的峰值为四糖而且不存在基质。m/z 602.28条件下的峰值是丧失水分以及丧失岩藻糖导致的。m/z513.28条件下的峰值是由于丧失6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺导致的。366.21位置的峰值是丧失6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺以及丧失半乳糖导致的，而m/z 283.72 条件下的峰值是源自6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺的峰值以及丧失水分导致的。四糖是岩藻糖通过αl-4 与n-乙酰半乳糖胺结合导致的。这种n-乙酰半乳糖胺具有通过β6-3结合的6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺。而且，n-乙酰半乳糖胺也具有通过β-3键结合的半乳糖(图4)。

981.50位置的峰值为[M+Matrix+H]+ion，而且涉及其它四糖并且在m/z 826.43条件下为四糖。将m/z 981.51ion片段化为m/z 963.49、826.43、616.30、527.30、380.23、366.21以及283.71(图 5)。发现这种四糖是通过αl-3键的n-乙酰半乳糖胺、通过βl-3结合的糖醛酸以及β6-3位置的6- 磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺导致的。m/z 963.49峰值涉及丧失源自加合四糖基质的水分。m/z 826.43峰值为四糖的离子。m/z 616.30峰值涉及丧失岩藻糖。m/z 527.30峰值是丧失6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺导致的。m/z 380.23峰值涉及丧失岩藻糖以及6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺。m/z 366.21峰值涉及丧失糖醛酸以及6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺。283.71峰值涉及6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺以及丧失水分。

m/z 1003.39条件下的峰值为[M+Matrix+H]+离子，而且片段化为m/z 866.43、664.31、549.28 以及283.72，发现这属于另外一种四糖(图6)。这种四糖由通过βl-3键与另外一种n-乙酰半乳糖胺结合的n-乙酰半乳糖胺组成的。甲基化半乳糖胺通过β1-3键结合至中心n-乙酰半乳糖胺。通过β 6-3键将6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺与中心n-乙酰半乳糖胺结合。峰值m/z866.43是没有基质加合物的四糖。m/z 664.31是丧失n-乙酰半乳糖胺导致的，而m/z 549.28峰值是丧失6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺导致的。283.72条件下的m/z峰值是仅存在6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺导致的。

发现m/z 1017.51条件下的峰值是样本中最后的四糖，而且发现由通过1-3键与中心n-乙酰半乳糖胺结合的n-乙酰半乳糖胺组成。存在通过βl-3键与中心n-乙酰半乳糖胺结合的乙酰半乳糖胺。还存在通过36-3键与中心n-乙酰半乳糖胺结合的6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺(图7)。m/z 1017.51峰值片段化为m/z 999.57、880.57、678.44、549.42以及402.39。999.57是具有基质加合物的离子和丧失水分导致的。m/z 880.57峰值属于没有基质加合物的四糖。m/z 678.44峰值是丧失通过βl-3结合的n-乙酰半乳糖胺导致的。m/z 549.42峰值是丧失β6-3键位置6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺导致的。m/z 402.39峰值是丧失源自549.42峰值的多个水分子导致的。

在m/z 1281.63以及1744.84发现更大的多糖。此类化合物是七庚糖以及不可吸收糖导致的。七庚糖含有两个岩藻糖分子，该分支通过αl-2和α6-3键与半乳糖胺结合。半乳糖胺通过β1-2键与n-乙酰半乳糖胺结合。n-乙酰半乳糖胺拥有分别通过β6-3以及β3-1键结合的6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺和半乳糖分子。半乳糖还拥有另外一个通过134-1键结合的半乳糖。该离子在m/z 1281.63条件下片段化为m/z 1264.79、1206.78、1175.74、939.61、843.56以及698.44(图8)。1189.61条件下的m/z 峰值是仪器导致的，和实际样本没有可比性。m/z 1264.79峰值是丧失源自母离子的一个水分子导致的。 m/z 1206.78峰值是丧失n-乙酰基以及丧失原子母离子的水导致的。m/z 1175.74峰值是m/z 1206.78 条件下丧失源自离子的甲氧基导致的。发生m/z 939.61峰值的原因是由于丧失源自n-乙酰半乳糖胺的两个半乳糖分子。843.56峰值是丧失6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺导致的。m/z 698.44峰值是由于丧失一个岩藻糖分子以及丧失6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺所致。

1744.84条件下的m/z峰值是不可吸收糖造成的，这种不可吸收糖由通过βl-3键与其它半乳糖结合的半乳糖组成。半乳糖同样通过βl-3键与n-乙酰半乳糖胺结合。n-乙酰半乳糖胺具有另外一个通过β6-3键结合的6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺。n-乙酰半乳糖胺拥有在1位置与其结合的第三个糖类，而且与半乳糖结合。这种半乳糖分别通过α6-3键以及βI-2键与岩藻糖和其它半乳糖结合。这种结合的半乳糖拥有一个通过β6-4键结合的6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺，而且6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺拥有一个通过β3-1键结合的半乳糖(图9)。这种母离子片段化为m/z离子1726.82、1560.75、1069.31 以及924.4。其它离子的存在，是m/z 1189.61、1207.57、1244.74、1283.66以及1301.01条件下的仪器导致的。1726.83条件下的m/z峰值是由于丧失源自母离子的水导致的。m/z 1560.75峰值是由于丧失一个岩藻糖分子导致的。m/z 1069.31是由于丧失6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺、丧失一个半乳糖分子以及丧失水导致的。m/z 924.40峰值是由于丧失三个半乳糖分子、一个6-磺酸盐-n-乙酰半乳糖胺分子导致的。完成分析之后，发现同加拉泡蟾泡沫的糖蛋白结构共计采用了6个多糖。

蛋白结果

胰蛋白酶消化之后，运行蛋白样本，以确保如之前报告的，泡沫中存在雷纳舒明。运行蛋白样本导致发现m/z数值为462.866、372.940、333.964、317.174、278.959、273.946、262.342、234.141、 175.054、147.121以及121.032条件下存在蛋白片段。这些m/z数值对应于MVGR、LIK、DAK、NGK、 MK、VR、DK、SK、R、K以及C蛋白片段(图10)。通过确定片段，可以准确判定Rsn-1、Rsn-2、Rsn-3、 Rsn-4、Rsn-5以及Rsn-6。

结论

采用上述方法可以表征采集的同加拉泡蟾泡沫。我们分析了本项目中发现的所有碳水化合物，并且进行了片段化，以判定每个多糖的结构。而且，还通过之前报告的内容确认了蛋白，此类报告提及雷纳舒明蛋白是泡沫巢中的主要蛋白。多糖由4种四糖、1种七庚糖以及1种不可吸收糖组成。糖类全部包含至少一个自由羟基，以便通过丝氨酸或者苏氨酸氨基酸与雷纳舒明结合。雷纳舒明均包含一个或者多个丝氨酸或苏氨酸，以便通过F型岩藻糖进行结合。这样，就可以通过Cooper研究小组对提出的泡沫结构布局进行强化，从而在泡沫中包含所有多糖，这是表征同加拉泡蟾泡沫巢的最后一个步骤(图12)。

已知多糖的结构以及已经序列化的蛋白，对糖蛋白成分进行了表征。人工重建泡沫的下一步是判定碳水化合物与蛋白的结合位置。可以采用计算化学并且结合蛋白的晶体结构来完成这项工作。不幸的是，尚未对所有雷纳舒明的晶体结构进行过表征。应当开展进一步的研究以判定所有雷纳舒明的晶体结构。但是，在发现雷纳舒明的晶体结构之前，已经上市销售的此类雷纳舒明的代用品可以作为一种选项来仿真及人工合成泡沫，直至人们发现所有雷纳舒明的晶体结构为止。

一旦仿真并且获取了代用品，则可以合成多糖。多糖的合成具有挑战性，但是，通过将两种多糖合成途径综合成一种途径，可以缩短总体合成时间。这样可以将每个四糖的总体合成时间从向链中每添加一个单糖需要20小时，缩短至向链中每天加一个单糖需要10-12小时12-14。这样可以缩短合成多糖的总体时间，并且可以合成糖蛋白。

试验

雷纳舒明蛋白混合物(RSN1-6)作为农药助剂的应用

从较大范畴来讲，可以将农业助剂或者农药助剂归类为添加到喷罐中的任何物质，这些物质不同于农药制剂，会改善农药的性能及/或功效。这其中包括改善农药在叶片保留度的化学品、湿润剂撒布器，乃至促摄食物质等等。

试验目的

除了具有抗菌性、抗病原性之外，已知雷纳舒明蛋白还具有表面活性15。本次试验的目的旨在检测蛋白的表面活性是否有助于提高农药的功效及/或提高使用之后农药在叶片上的保留度。

试验设置

采用12株生长四周的拟南芥(哥伦比亚型)植物来开展试验。(6株对照，6株试验)(图13)。

生长条件：植物在土壤中生长，采用16小时白天/8小时黑夜光照循环，而且温度为22℃。采用日光灯提供光照，平均光强度为175微摩尔/米2秒。吸胀以同步发芽之后，在4℃条件下对种子进行3天的低温处理(分层)。

采用移液管，直接在试验植物叶片上涂布

与RSN 1-6混合物(50μL的10mg/mL)。仅采用农药来涂布对照植物。5天以及10天结束的时候，采集了样本。

叶片样本采集以及提取方法

涂布5天和10天结束的时候，采集了4片对照叶片以及4片试验叶片。采用液氮对叶片进行了均质化，并且采用甲醇：氯仿混合物(2：1)进行了提取(图14)。采集了水相以便开展GC/MS分析。采用0.01mg/mL咖啡因溶液作为内部标准。

GC/MS分析

采用配备DB-5柱的GC/MS仪器(Thermo Focus GC，Polaris ion trap MS)来量化农药。采用氦气作为载气，恒定流速为1mL/min。烘箱温度开始为75℃，而且将该温度保持3分钟，然后采用25 ℃./min的斜率提高至120℃，继而采用5℃./min的斜率提高至300℃，保持300℃，时间为11分钟。将注入端口调节为250℃，并且采用无缝模式注入。将MS转移线保持在200℃，而且针对运行而将质量范围设定为m/z 0-650。

结果

以下采用表格方式列出了源自针对对照以及试验叶片样本开展的GC/MS运行的数据。计算了对照样本与试验样本的联苯肼酯浓度，以便对比两个步骤导致农药在叶片上保留度的差异。

对照叶片样本中联苯肼酯的浓度-0.018gg/gL(图15)。试验叶片样本中联苯肼酯的浓度-0.065 μg/μL(图16)。采用内部标准的峰值面积与农药的峰值面积相比较结果计算了浓度。经过计算可知，试验叶片的联苯肼酯量是对照叶片的3.6倍。

对照叶片样本中联苯肼酯的浓度(10天之后)-0.321μg/μL(图17)。试验叶片样本中联苯肼酯的浓度(10天之后)-0.403gg/gL(图18)。采用内部标准的峰值面积与农药峰值面积的比较结果计算了所有浓度。经过计算可知，试验叶片的联苯肼酯量是对照叶片的1.2倍。

结论

试验品5天和10天结束时采集的样本表明，从涂布泡沫和农药混合物的叶片提取样本中的农药浓度超过从仅涂布农药叶片采集样本中的农药浓度。这可能意味着实际上泡沫充当了农药助剂，而且有助于叶片更好地吸收农药及/或有助于农药采取更高效方式附着于叶片上。

雷纳舒明蛋白混合物(RSN1-6)作为沥青砂提取方法的应用

目前，沥青砂的提取方法是采用二氯甲烷(DCM)等无机溶剂。采用雷纳舒明蛋白等有机溶剂，并且借助切向流过滤系统(TFF)，可以从沥青砂中发现的烃类中提取芳族化合物。

试验目的

已知雷纳舒明蛋白属于表面活性剂。业界不仅采用无机溶剂从沥青砂中提取油类，还曾经采用表面活性剂作为无机溶剂的清洁替代品15。通过采用雷纳舒明，可以从沥青砂中分离芳族以及烃类，而且雷纳舒明与DCM无机方法相比，可以提供更高效的提取量。

试验设置

将2mg的沥青砂(Athabsca)分为1mg部分，然后放入两个独立小瓶内，该小瓶中含有1mL的 DCM以及1mL的RSN 1-6。对样本进行20分钟的涡流处理，将10μL的经过涡流处理DCM样本放入990 μL的己烷之中。然后，采用己烷提取含有RSN混合物的样本，接下来，将己烷层贮存到玻璃小瓶内。将10μL的样本放入990μL的己烷中，采用GC-MS运行两个样本。在TFF系统中运行剩余的RSN混合物。

切向流过滤系统(TFF)

为了运行TFF系统(图19)，将含有蛋白和油类的诱发添加到贮液器之中，该贮液器的最小容积为1.7mL。接下来，采取泵取方式令样本流过系统，最佳流速为30mL/分钟至40mL/分钟，直至样本触碰到胶囊为止。一旦样本到达胶囊，则从已经从沥青砂中提取的油类中分离蛋白。令样本至少3次连续通过系统，以提高从油类中清除蛋白的百分比。将作为TFF系统的首批制品来采集油类。执行取回操作步骤，以便重新采集从胶囊中分离的蛋白。采用GC-MS运行产品回收以及首个产品。

GC/MS分析

采用配备DB-5柱的GC/MS仪器(Thermo Focus GC，Polaris ion trap MS)来量化沥青砂样本。采用氦气作为载气，恒定流速为1mL/min。烘箱温度开始为60℃，而且将该温度保持3分钟，然后采用8℃./min的斜率提高至260℃，保持260℃，时间为3分钟。将注入端口调节为250℃，并且采用无缝模式注入。将MS转移线保持在200℃，而且针对运行而将质量范围设定为m/z 0-350。

结果

针对DCM、通过TFF系统运行之前和之后RSN混合物，执行了GC/MS运行，继而获得了数据。图20 示出了针对DCM的GC运行(下图)，图20示出了RSN混合物(上图)，以对比RSN混合物的性能。

一旦通过TFF，则图21示出了RSN混合物GC-MS运行的首次产品回收。图22示出了RSN混合物 GC-MS运行的最终产品回收。3次通过TFF之后，碳链脂肪族化合物的浓度降低了大约30％.一旦执行了产品回收方案，则从样本中彻底分离出芳族区域。

结论

RSN混合物可以提取芳族化合物以及碳链脂肪族化合物。与DCM相比，目前采用无机溶剂从沥青砂中提取油类，采用RSN混合物提取上述化合物。我们得出结论认为，RSN混合物是一种功能性表面活性剂，用于从沥青砂中提取油类。借助TFF系统，RSN混合物样本针对芳族化合物以及碳链脂肪族化合物而表现出大约30％的降幅，而且仅三次通过系统。执行了产品回收方案之后，芳族区域彻底与碳链脂肪族区域分离。这样可以在高性能汽油中采用较低的芳族浓度。

针对雷纳舒明蛋白(RSN1-6)的Kirby Bauer抗菌测定

抗菌剂阻止大肠杆菌(E.coli)等微生物的生长，或者将其杀灭。采用Kirby Bauer抗菌测定或者纸片扩散法来检测何种抗生素可以应对细菌菌株17。Kirby Bauer抗菌测定最长被用于监测纸片周围细菌的生长情况，存在间隙的情况下，同时还会测量纸片的生长半径/直径；这一测定时间周期最短为24小时，最长为5天18。

试验目的

除了具有抗菌性以及抗病原性之外，已知雷纳舒明蛋白还具有表面活性15。可以采用大肠杆菌作为纸片扩散研究中的细菌来检测雷纳舒明蛋白是否对大肠杆菌培养物具有抗菌性。

试验设置

采用等份的每种蛋白(RSN 1-6)来制备RSN混合物，浓度为10mg/mL，并且进行涡流处理，直至结合为止22。制备了大肠杆菌培养平板，令其干燥，在平板上放置较小的滤纸环，以及20μL的RSN样本，并且标签标记上RSN 1-6。将RSN混合物(1-6)以及对照品放置在图23a和图23b示出的滤纸上。

一旦将蛋白放置在大肠杆菌培养平板上，则将平板放入新的BrunswickScientific Excella E24恒温振荡培养箱之中，将培养箱设定为37℃，时间为24小时。24小时之后，从恒温振荡培养箱中取出平板并且进行观察。

结果

只有RSN 2以及RSN 5这两种蛋白才具有抗菌性。RSN 1、3-4以及6并未表现出任何抗菌性。可以将此类蛋白与运行的对照品进行对比，图23b示出了对比结果。除了RSN 2以及5均具有抗菌性之外，其它全部采用等份的RSN 1-6混合物也表现出不具有抗菌性。RSN 2以及5表现出抗菌性，RSN 2的大肠杆菌菌落抗性半径为1.1cm，而RSN 5的半径则为0.7cm。RSN2表现出对大肠杆菌较高的抗性，滤纸片附近并未表现出大肠杆菌菌落生长的任何迹象。而RSN 5则表现出对大肠杆菌的中度抗性，RSN 5 在滤纸片附近仍然有菌落残留物。

结论

这表明，不同于RSN 2，RSN 5降低了大肠杆菌菌落的生长速率，而RSN 2则杀灭了大肠杆菌菌落。将RSN蛋白拥有抗生素的情况下，可以实现这种应用。可以采用不同的培养物，以检测其它RSN蛋白是否会针对不同的细菌菌株而表现出抗菌性。

采用Circular Dichromium的雷纳舒明蛋白(RSN 1-6)变性

在过去数十年内，采用circular dichromium(CD)观察蛋白的二级结构19。α螺旋、β折叠以及无规卷曲均源自CD谱。α螺旋趋向于在大约200-220nm条件下体现出两次负转角，f折叠在220nm表现出谷而且在大约200nm条件下表现出峰，而无规卷曲则在220nm表现出峰，而在200nm表现出谷20。

试验目的

可以采用CD确认雷纳舒明蛋白的二级结构，以确定是否不存在α螺旋、f折叠或者无规卷曲。此外，还可以采用CD来监测蛋白结构的变性，具体做法是观察转角在光谱上的强度。采用CD谱的情况下，本试验采用不断提高的温度来判定雷纳舒明蛋白何时开始在二级结构中变性。

试验设置

采用范围为2.69mg/mL-0.50mg/mL储备溶液来稀释3mL溶液，浓度为0.25mg/mL的RSN 1-6。采用Jasco 815Circular Dichromium，并且配合采用Jasco温度控制器以及水浴附件来分析RSN 2蛋白结构。将初始温度设定为20℃.，将波长设定为200-300nm，而且每次测量之后将温度提高5℃，并且稳定60秒，之后再记录下次测量结果，其温度范围为20-90℃。针对基准点而运行某个库，然后通过CD运行1.5mL溶液，并且检测峰谷中光谱的变化强度。

结果

图25、图28以及图30示出的RSN 1、RSN 4以及RSN 6体现了一种无规卷曲，其峰出现在200 与220nm之间。对于RSN 1而言，蛋白在50℃条件下开始变性，而且在70℃条件下进一步变性，对于RSN 4而言，蛋白还在50℃条件下开始变性，而且在90℃条件下进一步变性。对于RSN 6而言，蛋白在40℃条件下变性，而且在90℃之前会慢慢变性。RSN 2表现出200-220nm之间的双谷，表明存在α螺旋。随着温度的升高，RSN 2开始在70℃条件下变性，具体如图26所示。RSN 5在大约 220nm表现出谷，表明蛋白中存在β折叠。随着温度的升高，RSN 5开始在60℃条件下变性，而且在70℃条件下完全变性(如图29所示)。RSN 3非常类似于RSN 5，也在大约220nm条件下表现出谷，表明蛋白中存在β折叠。一旦温度达到70℃，则RSN 3完全变性(如图27所示)(波长(nm) 210 220 230 240 250 260强度)。

结论

RSN 2具有α螺旋，表现为200-220nm之间的双谷，而且增加热量的情况下，蛋白会开始变性。 70℃条件下，蛋白开始丧失远端双峰谷，导致RSN 2二级结构在最高60-69℃条件下保持完好无损。RSN 3以及5具有β折叠，表现为200-220nm之间的单谷，而且增加热量的情况下，蛋白会开始变性。 70℃条件下，蛋白开始丧失远端单峰谷，导致RSN 3以及5二级结构在最高60-69℃条件下保持完好无损。RSN 1以及4具有无规卷曲，而且在200-220nm之间表现为单峰，而且增加热量的情况下，蛋白会开始变性。50℃条件下，RSN 1开始变性，并且在70℃条件下进一步变性。RSN 4在50℃条件下开始变性，并且在90℃条件下进一步变性，同时独特的峰的强度开始下降。结果表明，RSN 1 以及RSN 4二级结构在最高可达40-49℃条件下保持完好无损。RSN 6也在200-220nm之间具有峰，表明存在无规卷曲，而且增加热量的情况下，蛋白开始在40℃条件下变性，并且慢慢变性，直至90 ℃为止。RSN 6具有二级结构，在最高可达30-39℃条件下保持完好无损。

用作脂质体包被大麻二醇(CBD)稳定剂的雷纳舒明蛋白(RSN 2)

人们在过去数十年内发现，通过采用中性长链饱和磷脂质以及胆固醇组成的制剂，可以大幅提高脂质体在生物液体中的稳定性21。人们还发现，没有稳定剂的情况下，脂质体的半衰期大约为12-24小时22，采用聚乙二醇(PEG)等稳定剂的情况下，脂质体的寿命显著增加22-23。为了将某种化学品用作脂质体的稳定剂/表面活性剂，该化学品应当具有亲水性聚合物，该聚合物将水层吸引到脂质体表面 21-23。

试验目的

采用原子力显微法(AMF)的情况下，可以测量1-105μm正方形区域内的脂质体的大小以及脂质体质量。鉴于事实上RSN2具有较低的液体表面张力，因而可以将RSN 2归类为表面活性剂。脂质体的半衰期为12-24小时，但是采用表面活性剂/稳定剂的情况下，增加了脂质体的寿命。可以采用3％甘油溶液中的RSN 2来延长药物中包被的脂质体的寿命，并且可以采用AFM进行监测。

试验设置

将RSN 2冻干，然后从10％甘油溶液稀释为3％甘油溶液。此后混合物的最终浓度为1.99mg/mL。为了制作脂质体，将50mL的乙醇添加到200mL圆底烧瓶之中，加热至40℃。向烧瓶内添加1.5g 的磷脂酰胆碱，并且持续搅动，直至完全溶解为止。一旦溶解，则向烧瓶内天加0.5g的胆固醇以及 50mL的RSN 2溶液，而且溶液浓度为1.99mg/mL，直至完全溶解为止。向烧瓶内添加0.5g的CBD，搅动直至溶解为止。

接下来，将溶液置于旋转蒸发仪上，时间为45分钟，直至清除所有溶剂为止。向烧瓶内天加50mL 的mili Q水，用力晃动，直至清除烧瓶侧壁上所有固体为止，对溶解的样本进行超声波处理，时间为 15分钟，采用的间隔为10秒开启和15秒关闭，而且振幅为60。完成对样本的超声波处理之后，采用 AFM分析脂质体。

为了制备AFM所需的样本，将999μL的mili Q水放入1.5mL微量离心管之中。添加1μL的脂质体混合物，并且进行10秒的涡流处理。对直径15mm而且厚度为0.15mm-0.21mm的Muscovite Mica V4进行裂解，并且将10μL的样本置于云母片上。然后，采用热风枪对样本进行干燥处理，直至云母片上不再有液体为止。接下来，将云母片置于nano surf AFM上。

将激光器与至少50％探测器强度对齐。选择悬臂拥有ACL-A(固体样本)，将仪器设定为动态力，而且进行频率扫描，以确保步进频率设定为1000Hz，并且将自由振动设定为500mV。针对图像大小而将每次运行的参数设定为5μm，时间/线设定为0.98s，点/线设定为256，而且将旋转设定为0。针对点集合而将Z控制器参数设定为65％，I增益设定为2000，P增益以及D增益设定为0。将悬臂降低至样本，并且在大约8.0分钟的时间内采集图像。完成图像采集的情况下，采集范围为1-2μm的近距离照片的扫描结果，将点/线变更为512，而且将时间/线变更为1.2s。然后在大约20分钟的时间内采集图像，并且拥有测量每个脂质体的平均半径。

结果

拍摄了脂质体的AFM照片，以确认24小时之后CBD的形成以及包被情况。图31a示出了未采用稳定剂的脂质体。图31b示出了从5μm放大为1μm的脂质体照片。图32a示出了24小时之后采用泡沫稳定剂的脂质体，而且图32b示出了采用泡沫作为稳定剂情况下，从5μm放大至1μm的脂质体照片。未采用稳定剂的脂质体平均半径为47.2nm，而且采用泡沫作为稳定剂的脂质体的平均半径为 43.3nm。为了计算脂质体的半径，采用了公式1。

式中r表示脂质体的半径，1是从软件nanosurf中获取的脂质体长度，h也是从软件nanosurf 中获取的脂质体的高度。96小时之后拍摄了另外一张AFM照片；拍摄的照片取自未采用稳定剂的样本，具体如图33a以及33b所示，而且平均半径为31.6nm。图34a以及34b示出了采用泡沫作为稳定剂的样本，而且平均半径为43.3nm。

1个月之后，拍摄了采用泡沫稳定化的脂质体以及未采用稳定剂脂质体的AFM照片。对于1个月样本而言，从0至105m进行了完全扫描，然后进行放大，以便获得1个月之后样本的整个图像。图35示出了未采用稳定剂的脂质体样本，图36a、图36b以及图36c示出了采用泡沫作为稳定剂的脂质体，而且平均半径为63.43nm。图37示出了2个月之后，采用泡沫作为稳定剂的脂质体显微照片。2个月之后，脂质体的平均半径为108.3nm。

结论

24小时之后，对未采用稳定剂的脂质体样本进行了获取挑战。24小时标志以及96小时之后拍摄的照片表明脂质体开始变性，而且聚合在一起。1个月标志的时候，对脂质体进行了0至105μm的完全扫描，表明脂质体聚合在一起，因而无法从1个月标志位置获取平均半径。尽管采用RSN 2作为稳定剂的脂质体在24小时之后更容易拍摄照片，而且在24小时之后保持球体形状，但是在96小时标志的时候，脂质体存在某种聚合，不过仍然保持其形状和大小。1个月之后，采用RSN 2作为稳定剂的脂质体实际上聚合在一起，而且平均半径从43.3nm变为63.43nm，不过通过查看完全扫描0-105μm，发现样本仍然具有在溶液中广泛分布的脂质体。2个月之后，脂质体仍然保持其形状，但是大小增加至 103.8nm。可以开展进一步扫描，以查看脂质体保持其大小和形状的具体时间长度。

采用大肠杆菌生产重组蛋白的标准操作实施规程

1、将生产厂商(VectorBuilder.com)提供的重组细菌储备培养物贮存在50：50甘油：水储备溶液之中，然后放入-80℃冷冻箱之中。

2、从冷冻箱中取出的情况下，对细菌菌株进行接种，并且放置在LB氨苄青霉素琼脂平板上，以便令大肠杆菌在37℃条件下彻夜生长成单个菌落。

3、一旦菌落足够大，则提取菌落，然后在小LB氨苄青霉素100mL培养物之中生长。借外力，在37℃条件下令这些培养物生长2天，而且进行晃动，直至光密度为0.6。

4、接下来，采用20mL的溶液接种1L的LB氨苄青霉素介质，溶液源自小培养物，而且放入恒温振荡培养箱之中，温度为37℃，时间为6小时。

5、一旦细菌细胞发生了生长，则通过将IPTG放入培养物之中来表达雷纳舒明蛋白，最终浓度为1 mM，而且在晃动的同时，在室温条件下彻夜保存。

6、一旦完成蛋白表达，则取出大培养物，并且开始蛋白纯化。

蛋白纯化

1、每种蛋白的纯化方法为首先取出1L细菌培养物，然后分入20x50 mL离心管之中。然后，采用10,000rpm的速度，对这些离心管进行20分钟的离心处理。

2、清除上层清液，并且弃用。接下来，将20个离心管中的剩余团块组合成5个试管，然后在-80℃条件下冷冻2天。

3、2天之后，取出样本，并且向每个试管内天加40mL的NPI-10缓冲液。然后，采用细胞破碎仪对试管进行声纳降解。将试管放入冰浴，并且采用30秒开启和1分钟关闭的间隔，采用80％振幅进行超声波处理。

4、声纳降解之后，将样本放入4℃条件下的离心机之中，并且采用12,000rpm的速度运行20 分钟。二次开展这种运行，以确保上层清液中不遗留任何细胞碎片。接下来，取出上层清液并且在4℃条件下彻夜贮存。

5、接下来，采用Novagen His-Bind树脂纯化套件的情况下，对样本进行镍亲和柱纯化，以便仅提取关注的蛋白。本套件可以在每次运行期间最多提取10mg的每种蛋白。

6、这一工艺首先是将2mL的树脂放入柱内，采用重力过滤方式令树脂沉积。接下来，将5mL的电荷缓冲液放入柱内。这样就提供了柱的镍基，由于组氨酸标签，导致蛋白将与镍基结合。一旦完成了电荷缓冲液，则采用3mL的结合缓冲液来清理柱内的所有污染物。

7、然后，将样本提取物(200mL)置于柱上。为确保适当提取，采用了每小时10mL的流速。完成样本提取的情况下，再次进行清洗，以清除柱内的所有污染物。

8、最后，采用洗脱缓冲液从柱内将蛋白提取至6mL的缓冲液之中。然后，取出这一缓冲液，并且进行搅动，直至形成泡沫为止。

9、采用Sartorius Vivaspin 20离心管的情况下，进行二次纯化，以便将溶液的浓度从1mg/mL 增加至10mg/mL。该试管具有10,000分子量截点(MWCO)，从而使得仅超过10,000分子量的蛋白留在溶液之中。从1L发酵剂培养物中获取大约1-1.5ml的蛋白。

10、接下来，提取该溶液，并且彻夜冻干，以便从蛋白中清除所有残留污染物以及溶剂。然后，采用ESI-MS分析蛋白，以确认是否合成了蛋白。

根据条款1，提供了一种合成的同加拉泡蟾泡沫。合成同加拉泡蟾泡沫包括全合成的雷纳舒明蛋白 (RSN)，其中仅合成了RSN蛋白的活性部分，而且有效清除了信号肽(如存在)，还包括糖主链，其中仅合成RSN蛋白活性部分导致适当折叠蛋白，而且允许在合成泡沫中保持表面活性能力，其中合成泡沫在超过10天的时间内保持稳定性，而且不存在表面张力效应导致的任何脱水或者丧失泡沫结构的情况。

根据条款2，条款1的合成同加拉泡蟾泡沫的稳定性最高可达天然同加拉泡蟾泡沫的5倍。

根据条款3，条款1或者条款2的合成同加拉泡蟾泡沫包括雷纳舒明蛋白(RSN)，该蛋白具有六种全合成雷纳舒明蛋白，其中雷纳舒明(RSN)蛋白包括—合成氨基酸序列编号1的雷纳舒明-1(RSN-1)；合成氨基酸序列编号2的雷纳舒明-2(RSN-2)；合成氨基酸序列编号3的雷纳舒明-3(RSN-3)；合成氨基酸序列编号4的雷纳舒明-4(RSN-4)；合成氨基酸序列编号5的雷纳舒明-5(RSN-5)；以及，合成氨基酸序列编号6的雷纳舒明-6(RSN-6)。

根据条款4，条款1-3中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫，其中糖主链包括六种全合成多糖，其中多糖包括4种四糖、1种七庚糖以及1种不可吸收糖，其中的多糖还全部包括至少一个自由羟基，以便通过丝氨酸或者苏氨酸氨基酸与RSN蛋白结合。

根据条款5，条款1-4中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫，其中雷纳舒明蛋白全部包括一个或者多个丝氨酸或者苏氨酸，以便经过F型岩藻糖进行结合。

根据条款6，条款1-5中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫，其中雷纳舒明蛋白属于岩藻糖型蛋白，包括一个或者多个丝氨酸或苏氨酸，在一种多糖的1位置与羟基结合。

根据条款7，条款1-6中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫，其中多糖全包括至少一个自由羟基，通过丝氨酸或者苏氨酸氨基酸与雷纳舒明蛋白结合。

根据条款8，条款1-7中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫，其中雷纳舒明蛋白2(RSN-2)倍用作脂质体包被大麻二醇(CBD)的稳定剂。

根据条款9，条款1-8中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫，其中并未附带任何组氨酸标签的RSN蛋白的分子量如下：RSN-1为11.38kDa，RSN-2为11.11kDa，RSN-3为18.85kDa，RSN-4为19.26kDa， RSN-5为18.73kDa，而且RSN-6为25.69kDa。

根据条款10，条款1-9中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫，其中青蛙泡沫的厚度为85埃。

根据条款11，条款1-10中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫，其中采用大肠杆菌载体来表达RSN蛋白，该大肠杆菌载体包含异丙基II-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)诱发的情况下，亚克隆RSN基因上游的LacO基因启动子，其中亚克隆RSN基因包含一个氨苄青霉素抗性基因。

根据条款12，条款1-11中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫，其中RSN蛋白包括采用镍亲和柱纯化提取专用的组氨酸标签。

根据条款13，提供了一种肺部药物输送成分，其中包括作为表面活性剂的条款1-2中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫。

根据条款14，提供了一种水力压裂法泡沫，其中包括作为表面活性剂的条款1-2中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中RSN蛋白提取芳族化合物以及碳链脂肪族化合物。

根据条款15，提供了一种农药/杀虫剂，其中包括作为表面活性剂的条款1-2中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分。

根据条款16，条款15的农药还包括联苯肼酯。

根据条款17，条款15或者条款16的农药，其中包括作为农药成分的合成同加拉泡蟾泡沫的情况下，5天处理之后，叶片上农药的浓度是并未包括合成同加拉泡蟾泡沫的叶片上农药量的3.6倍，而且其中采用合成同加拉泡蟾泡沫作为农药成分的情况下，10天处理之后，叶片上农药的浓度是并未包括合成同加拉泡蟾泡沫的叶片上农药量的1.2倍。

根据条款18，提供了一种抗菌性，其中包括作为表面活性剂的条款1-2中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分。

根据条款19，提供了条款18中的抗菌药，其中RSN-2杀灭大肠杆菌等细菌，而且RSN-5迟缓大肠杆菌等细菌的生长速率。

根据条款20，条款18或者条款19的抗菌药，其中采用抗菌药来保护和保持活体组织，用于转运。

根据条款21，提供了一种抗菌药，其中包括条款1和3-12任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中合成雷纳舒明蛋白为包括合成氨基酸序列编号2的雷纳舒明-2(RSN-2)以及包括合成氨基酸序列编号5的雷纳舒明-5(RSN-5)。

根据条款22，提供了一种用于食品贮存和运输的泡沫成分，其中包括作为表面活性剂的条款1-2 中任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫、气体以及水载体。

根据条款23，条款22的泡沫成分，其中将该成分用于活体甲壳纲动物的运输。

根据条款24，提供了一种贮存和运输新鲜食品的方法，该方法包括下列步骤：a)将新鲜食品放入适合贮存和运输新鲜食品的容器内；b)根据条款1-12中任一条款提供合成泡沫成分，其中包括从雷纳舒明-1、雷纳舒明-2、雷纳舒明-3、雷纳舒明-4、雷纳舒明-5或雷纳舒明-6清单中选中的食品级别合成表面活化剂；以及c)采用泡沫成分至少部分覆盖新鲜食品。

根据条款1，提供了合成的同加拉泡蟾泡沫，其中包括全合成雷纳舒明蛋白(RSN)，其中仅合成了RSN蛋白的活性部分，而且有效清除了信号肽(如存在)，而且还包括糖主链，其中仅合成了RSN蛋白的活性部分，导致适当折叠蛋白质并且允许在合成泡沫中保留表面活性能力，其中合成泡沫在超过 10天的时间内保持稳定性，而且不存在表面张力效应导致的任何脱水或者丧失泡沫结构的情况。

根据条款2，条款1中的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中雷纳舒明蛋白(RSN)包括六种全合成雷纳舒明蛋白，其中雷纳舒明(RSN)蛋白包括—雷纳舒明-1(RSN-1)，包括合成氨基酸序列编号1；雷纳舒明-2(RSN-2)，包括合成氨基酸序列编号2；雷纳舒明-3(RSN-3)，包括合成氨基酸序列编号3；雷纳舒明-4(RSN-4)，包括合成氨基酸序列编号4；雷纳舒明-5(RSN-5)，包括合成氨基酸序列编号 5；以及，雷纳舒明-6(RSN-6)，包括合成氨基酸序列编号6。

根据条款3，条款1或条款2的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中糖主链包括六种全合成多糖，其中多糖包括4种四糖、1种七庚糖以及1种不可吸收糖，其中多糖还全部包括至少1个自由羟基，以便通过丝氨酸或者苏氨酸氨基酸与RSN蛋白结合。

根据条款4，条款1-3的任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中雷纳舒明蛋白属于岩藻糖型蛋白，包括一个或者多个丝氨酸或苏氨酸，在多糖之一的1位置与羟基结合。

根据条款5，条款1-4的任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中多糖均包括至少一个自由羟基，通过丝氨酸或苏氨酸氨基酸与雷纳舒明蛋白结合。

根据条款6，条款1-5的任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中雷纳舒明蛋白2(RSN-2)作为稳定剂而被用于脂质体包被大麻二醇(CBD)。

根据条款7，条款1-6的任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中未附加组氨酸标签的RSN蛋白的分子量如下：RSN-1为11.38kDa，RSN-2为11.11kDa，RSN-3为18.85kDa，RSN-4为19.26kDa， RSN-5为18.73kDa，而且RSN-6为25.69kDa。

根据条款8，条款1-7的任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中青蛙泡沫的厚度为85埃。

根据条款9，条款1-8的任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中采用大肠杆菌载体来表达RSN蛋白，该大肠杆菌载体包含异丙基II-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)诱发的情况下，亚克隆RSN基因上游的LacO基因启动子，其中亚克隆RSN基因包含一个氨苄青霉素抗性基因。

根据条款10，条款1-9的任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中RSN蛋白包括采用镍亲和柱纯化提取专用的组氨酸标签。

根据条款11，提供了一种肺部药物输送成分，包括作为表面活性剂的条款1-10任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分。

根据条款12，提供了一种水力压裂法泡沫，包括作为表面活性剂的条款1-10任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中RSN蛋白提取芳族化合物以及碳链脂肪族化合物。

根据条款13，提供了一种农药/杀虫剂，包括作为表面活性剂的条款1-10任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分。

根据条款14，提供了条款13的农药，包括联苯肼酯。

根据条款15，提供了条款14的农药，其中包括作为农药成分的合成同加拉泡蟾泡沫的情况下，5 天处理之后，叶片上农药的浓度是并未包括合成同加拉泡蟾泡沫的叶片上农药量的3.6倍，而且其中采用合成同加拉泡蟾泡沫作为农药成分的情况下，10天处理之后，叶片上农药的浓度是并未包括合成同加拉泡蟾泡沫的叶片上农药量的1.2倍。

根据条款16，提供了一种抗菌药，包括作为表面活性剂的条款1-10任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分。

根据条款17，条款16的抗菌药，其中采用抗菌药来保护和保持活体组织，用于转运。

根据条款18，提供了一种抗菌药，包括条款1-10任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中合成雷纳舒明蛋白为包括合成氨基酸序列编号2的雷纳舒明-2(RSN-2)以及包括合成氨基酸序列编号5的雷纳舒明-5(RSN-5)。

根据条款19，提供了一种食品贮存与运输专用泡沫成分，包括作为表面活性剂的条款1-10任一条款的合成同加拉泡蟾泡沫成分、气体以及水载体。

根据条款20，条款19的泡沫成分，其中将该成分用于活体甲壳纲动物的运输。

根据条款21，提供了一种贮存和运输新鲜食品的方法，该方法包括下列步骤：a)将新鲜食品放入适合贮存和运输新鲜食品的容器内；b)根据条款1-12中任一条款提供合成泡沫成分，其中包括从雷纳舒明-1、雷纳舒明-2、雷纳舒明-3、雷纳舒明-4、雷纳舒明-5或雷纳舒明-6清单中选中的食品级别合成表面活化剂；以及c)采用泡沫成分至少部分覆盖新鲜食品。

尽管如上所示阐明和描述了发明的实施例，但是在不超出本发明的实质和范围的情况下，可以进行很多变更。比如，可替代类似大小、电荷以及功能氨基酸。发明的序列以及多糖可能存在变化，发现相应地进行了折叠，而且由于糖类而表现出表面活性剂特性以及持久性，并且寻求各种氨基酸成分的保护作用。相应地，发明的范围并不受限于优选实施例的发明。相反地，应当通过引述下列权利要求而从整体上判断本发明。

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23)D.PAPAHADJOPOULOS；T M ALLEN；A GABIZON；E MAYHEW；K MATTHAYII；S KHUANG； K.-D.LEE；M C WOODLE；D LASIC；C REDEMANN；F J MARTIN Stericallystabilized liposomes: Improvements in pharmacokinetics and antitumortherapeutic efficacy.,88

24)Ahmadi Ashtiani,H.R；Bishe,P.；Lashgari,N.；Nilforoushzadeh,M.A.；Zare,S.Liposomes in Cosmetics. Journal of Skin and Stem Cell 2016,3.

序列表

<110> 百奥密科技公司（Biome Solutions Inc）

<120> 一种合成表面活化剂的成分、方法以及应用

<130> WK21-YSY-CN1-0114

<150> US 16/915,900

<151> 2020-06-29

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 109

<212> PRT

<213> 同加拉泡蟾(Engystomopspustulosus)

<400> 1

Gly Gly Gly Asn Ile Gly Gly Gly Ala Lys Leu Gly Pro Glu Lys Pro

1 5 10 15

Ala Thr Pro Gly Ile Gln Asp Leu Leu Lys Ser Leu Leu Ser Val Leu

20 25 30

Asn Leu Ser Pro Pro Ala Ile Pro Glu Asp Ala Glu Ala Val Ser Tyr

35 40 45

Arg Asp Ala Lys Asn Gly Lys Phe Arg Leu Ile Lys Ile His Leu Gly

50 55 60

Gly Glu Leu Tyr Cys His Val Lys Gln Ile Ala Gly Pro Ile Leu Ala

65 70 75 80

Leu Pro Ile Val Ser Asp Val Val Glu Val Thr Gly Lys Glu Cys Gly

85 90 95

Lys Thr Glu Asp Asp Pro Leu Glu Asp Phe Pro Ile Pro

100 105

<210> 2

<211> 96

<212> PRT

<213> 同加拉泡蟾(Engystomopspustulosus)

<400> 2

Leu Ile Leu Asp Gly Asp Leu Leu Lys Asp Lys Leu Lys Leu Pro Val

1 5 10 15

Ile Asp Asn Leu Phe Gly Lys Glu Leu Leu Asp Lys Phe Gln Asp Asp

20 25 30

Val Lys Asp Lys Tyr Gly Val Asp Thr Lys Asp Leu Lys Ile Leu Lys

35 40 45

Thr Ser Glu Asp Lys Arg Phe Tyr Tyr Val Ser Val Asp Ala Gly Asp

50 55 60

Gly Glu Lys Cys Lys Phe Lys Ile Arg Lys Asp Val Asp Val Pro Lys

65 70 75 80

Met Val Gly Arg Lys Cys Arg Lys Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Tyr

85 90 95

<210> 3

<211> 173

<212> PRT

<213> 同加拉泡蟾(Engystomopspustulosus)

<400> 3

Ile Asp Pro Thr Gly Leu Val Gln Ile Leu Leu Leu Glu Gln Val Val

1 5 10 15

His Lys Ile Pro Pro Gly Asn Ile Asn Leu Ala Arg Thr Gly Ile Ala

20 25 30

Thr Gln Asp Ser Asp Tyr Thr Ala Ser Ala Val Pro Ser Glu Ala Arg

35 40 45

Leu Ala Ile Asp Gly Asn Arg Asn Ser Asp Phe Asn Gln Lys Ser Cys

50 55 60

Ser His Thr Gly Gly Asn Glu Pro Ala Trp Trp Arg Leu Glu Leu Lys

65 70 75 80

Lys Lys Ser Lys Ile Ser Val Val Val Ile Ala Ile Arg Ser Asp Cys

85 90 95

Cys Met Asp Arg Phe Lys Gly Ala Glu Leu Arg Ile Gly Asn Ser Gln

100 105 110

Asp Ala Thr Val Asn Pro Ile Cys Gly Lys Val Ser Ala Val Lys Gly

115 120 125

Ser Asn Tyr Leu Phe Cys Cys Asp Gly Met Glu Gly Lys Tyr Ile Ser

130 135 140

Val Val Ile Pro Asp Arg His Glu Phe Leu Ser Leu Cys Glu Val Glu

145 150 155 160

Val Tyr Gly Ala Lys Pro Ile Glu Gly Thr His Cys Lys

165 170

<210> 4

<211> 174

<212> PRT

<213> 同加拉泡蟾(Engystomopspustulosus)

<400> 4

Asp Arg Asn Leu Ala Leu Asp Gly Arg Ala Thr Met Ser Ser Ile Trp

1 5 10 15

Met Asp Pro Asp Ile Arg Gln Ser Phe Leu Gly Val Ala Met Asn Gly

20 25 30

Ile Asp Gly Asn Thr Asp Ser Val Tyr Phe His Gly Ser Cys Phe His

35 40 45

Thr Gly Leu Asp Ser Pro Ala Trp Tyr Arg Val Asp Leu Leu Arg Thr

50 55 60

Ser Lys Ile Ser Ser Ile Thr Ile Thr Asn Arg Gly Asp Phe Gly Ser

65 70 75 80

Arg Thr Asn Gly Ala Glu Ile Arg Ile Gly Asp Ser Leu Ala Asn Asn

85 90 95

Gly Asn Asn Asn Pro Arg Cys Ala Leu Val Thr Ser Ile Ala Asp Gly

100 105 110

Glu Thr Arg Thr Phe Gln Cys Asn Asn Met Val Gly Arg Tyr Val Asn

115 120 125

Ile Val Leu Thr Gly Lys Thr Glu Phe Leu His Leu Cys Glu Val Gln

130 135 140

Ile Phe Gly Glu Asn Leu Pro Arg Ser Phe Ser Cys Gln Tyr Ser Asn

145 150 155 160

Asp Gly Met Ile Thr Leu Leu Val Ser Thr Arg Phe Met Lys

165 170

<210> 5

<211> 177

<212> PRT

<213> 同加拉泡蟾(Engystomopspustulosus)

<400> 5

Gly Ala Pro Gly Gly Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Leu Asn Ile Leu

1 5 10 15

Gly Ser Val Val His Glu Thr Lys Pro Pro Glu Gly Val Asn Leu Ala

20 25 30

Leu Lys Gly Ile Ala Ser Ser Asp Ser Ile Ala Ser Asn Gly Ser Val

35 40 45

Thr Gly Leu Ala Ala Lys Ala Ile Asp Gly Ile Arg Val Ser Asp Phe

50 55 60

Phe Lys Gly His Cys Ser Leu Thr Asn Gly Leu Asn Asn Pro Thr Trp

65 70 75 80

Trp Lys Val Asp Leu Lys Lys Ser Tyr Lys Ile Ser Ser Val Phe Val

85 90 95

Thr Asn Arg Asp Asp Cys Cys Thr Glu Arg Leu Leu His Ala Glu Ile

100 105 110

Arg Ile Gly Ser Asn Pro Asp His Asn His Asn Pro Ile Cys Ala Glu

115 120 125

Val Lys Thr Val Ala Ser Ser Asn Ile Gly Phe Cys Cys Gly Gly Met

130 135 140

Glu Gly Arg Tyr Val Ser Val Ser Val Pro Arg Lys Glu Gln Leu Ser

145 150 155 160

Leu Cys Glu Val Glu Val Tyr Gly Asp Leu Lys Lys Val Leu His Cys

165 170 175

Ala

<210> 6

<211> 230

<212> PRT

<213> 同加拉泡蟾(Engystomopspustulosus)

<400> 6

Glu Thr Leu Cys Ile Pro Gly Arg Met Lys Gln Leu Asp Ala Gly Ala

1 5 10 15

Gly Arg Val Val Ala Val Lys Ser Asn Gly Asp Val Tyr Gln Leu Leu

20 25 30

Glu Asn Asn Trp Val Gln Ile Pro Gly Lys Leu Ile His Val Thr Val

35 40 45

Gly Pro Ala Gly Leu Trp Gly Val Asn Lys Asp Lys Asn Ile Tyr Lys

50 55 60

Tyr Val Asp Asn Asp Trp Leu Gln Val Asp Gly Leu Leu Asn Gln Ile

65 70 75 80

Asp Ala Gly Gly Asn Arg Phe Val Val Gly Val Asn Asp Asn Glu Asp

85 90 95

Ile Phe Cys Leu Asn Gln Asp Gln Thr Thr Ser Asn Ala Val Lys Leu

100 105 110

Asp Tyr Lys Gly Val Asp Gly Lys Leu Lys Tyr Tyr Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Tyr Gly Ser Trp Gly Val Asn Ala Ala Tyr Asp Ile Phe Tyr Arg Arg

130 135 140

Asn Val His Pro Met Ser Cys Gln Gly Thr Asn Trp Glu Asn Val Glu

145 150 155 160

Gly Lys Leu Val Met Leu Glu Val Ala Glu Asp Gly Ser Val Tyr Gly

165 170 175

Val Asn Tyr Asn Gly His Val Tyr Lys Arg Glu Gly Ile Thr Ala Gly

180 185 190

Asn Pro Met Gly Thr Ser Trp Thr Tyr Leu Lys Val Asp Glu Lys Val

195 200 205

Arg His Val Ser Tyr Asp Arg Gly Val Leu Tyr Val Val Thr Ile Asp

210 215 220

Asp Arg Ile Phe Arg Cys

225 230

Claims (21)

1.合成的同加拉泡蟾泡沫，其包括：

全合成雷纳舒明蛋白(RSN)，

其中仅合成RSN蛋白的活性部分，而且有效清除了信号肽(如存在)，以及

糖主链，

其中仅合成RSN蛋白的活性部分导致适当折叠蛋白而且允许在合成泡沫中保留表面活性能力，

其中合成泡沫在超过10天的时间内保持稳定性，而且不存在表面张力效应导致的任何脱水或者丧失泡沫结构的情况。

2.如权利要求1所述的合成的同加拉泡蟾泡沫，其中雷纳舒明蛋白(RSN)包括六种全合成雷纳舒明蛋白，其中雷纳舒明(RSN)蛋白包括-

雷纳舒明-1(RSN-1)，其包括合成氨基酸序列编号1；

雷纳舒明-2(RSN-2)，其包括合成氨基酸序列编号2；

雷纳舒明-3(RSN-3)，其包括合成氨基酸序列编号3；

雷纳舒明-4(RSN-4)，其包括合成氨基酸序列编号4；

雷纳舒明-5(RSN-5)，其包括合成氨基酸序列编号5；

雷纳舒明-6(RSN-6)，其包括合成氨基酸序列编号6。

3.如权利要求2所述的合成的同加拉泡蟾泡沫，其中糖主链包括六种合成多糖，其中多糖包括4种四糖、1种七庚糖以及1种不可吸收糖，其中多糖还全部包括至少一个自由羟基，通过丝氨酸或者苏氨酸氨基酸与RSN蛋白结合。

4.权利要求3的合成的同加拉泡蟾泡沫，其中雷纳舒明蛋白属于岩藻糖型蛋白，其包括一个或者多个丝氨酸或苏氨酸，在多糖之一的1位置与羟基结合。

5.如权利要求4所述的合成的同加拉泡蟾泡沫，其中多糖全部包括至少一个自由羟基，通过丝氨酸或者苏氨酸氨基酸与雷纳舒明蛋白结合。

6.如权利要求5所述的合成的同加拉泡蟾泡沫，其中雷纳舒明蛋白2(RSN-2)作为稳定剂而倍用于脂质体包被大麻二醇(CBD)。

7.如权利要求3所述的合成的同加拉泡蟾泡沫，未附加组氨酸标签的RSN蛋白的分子量如下：

RSN-1为11.38kDa，

RSN-2为11.11kDa，

RSN-3为18.85kDa，

RSN-4为19.26kDa，

RSN-5为18.73kDa，而且

RSN-6为25.69kDa。

8.如权利要求7所述的合成的同加拉泡蟾泡沫，其中青蛙泡沫的厚度为85埃。

9.如权利要求1所述的合成的同加拉泡蟾泡沫，其中采用大肠杆菌载体来表达RSN蛋白，该大肠杆菌载体包含异丙基II-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)诱发的情况下，亚克隆RSN基因上游的LacO基因启动子，其中亚克隆RSN基因包含一个氨苄青霉素抗性基因。

10.如权利要求1所述的合成的同加拉泡蟾泡沫，其中RSN蛋白包括采用镍亲和柱纯化提取专用的组氨酸标签。

11.一种肺部药物输送成分，其包括作为表面活性剂的权利要求3的合成同加拉泡蟾泡沫。

12.一种水力压裂法泡沫，其包括作为表面活性剂的权利要求3的合成同加拉泡蟾泡沫，其中RSN蛋白提取芳族化合物以及碳链脂肪族化合物。

13.一种农药/杀虫剂，其包括作为表面活性剂的权利要求3的合成同加拉泡蟾泡沫。

14.如权利要求3所述的杀虫剂，其包括联苯肼酯。

15.如权利要求14所述的杀虫剂，其中包括作为农药成分的合成同加拉泡蟾泡沫的情况下，5天处理之后，叶片上农药的浓度是并未包括合成同加拉泡蟾泡沫的叶片上农药量的3.6倍，而且其中采用合成同加拉泡蟾泡沫作为农药成分的情况下，10天处理之后，叶片上农药的浓度是并未包括合成同加拉泡蟾泡沫的叶片上农药量的1.2倍。

16.一种抗菌药，其包括作为表面剂的权利要求3的合成同加拉泡蟾泡沫成分。

17.如权利要求16所述的抗菌药，其中采用抗菌药来保护和保持活体组织，用于转运。

18.一种抗菌药，其包括权利要求1的合成同加拉泡蟾泡沫成分，其中同加拉泡蟾泡沫为包括合成氨基酸序列编号2的雷纳舒明-2(RSN-2)以及包括合成氨基酸序列编号5的雷纳舒明-5(RSN-5)。

19.一种用于食品贮存和运输的泡沫成分，其包括包括作为表面活性剂的权利要求3的合成同加拉泡蟾泡沫、气体以及水载体。

20.如权利要求19所述的泡沫成分，其中将该成分用于活体甲壳纲动物的运输。

21.一种贮存和运输新鲜食品的方法，该方法包括：

a)将新鲜食品放入适合贮存和运输新鲜食品的容器内；

b)如根据权利要求1所述的提供合成泡沫成分，其包括从雷纳舒明-1、雷纳舒明-2、雷纳舒明-3、雷纳舒明-4、雷纳舒明-5或雷纳舒明-6清单中选中的食品级别合成表面活化剂；以及

c)采用泡沫成分至少部分覆盖新鲜食品。

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