CN113145188B - 血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开生物医学检测领域中的血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片及方法，将血样和红细胞裂解液分别同时滴入血样进样口和红细胞裂解液进样口中，分别冲入ph为7.8的磷酸缓冲液，使血样和红细胞裂解液在细胞裂解区中混合反应，释放其中的血红蛋白，向亚硝酸盐进样口加入亚硝酸盐溶液并冲入ph为7.8的磷酸缓冲液，使亚硝酸盐溶液与过滤后的反应液在血红蛋白氧化区混合反应，反应液中的亚铁血红蛋白转化为高铁血红蛋白；在电泳分离区中，血红蛋白分离，在电解池中测量工作电极与辅助电极之间的衰减电流产生的时间和衰减电流的大小来定性及定量检测血红蛋白；本发明将血液中血红蛋白的提取、分离和检测集成在一块微流控芯片上。

Description

血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片及方法

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，具体是血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片，用于对人体血液中血红蛋白进行快速检测与分析，从而对人体血液健康进行评估。

背景技术

人体血液的健康状况对人体健康有着很大的影响，而血液中血红蛋白的检测是设评估血液健康的重要部分。目前常见的检测方法有很多，比如说盐酸比色法和电化学检测等方法，前者的原理是血液与盐酸作用后，释放出血红蛋白，血红蛋白被酸化后变为褐色的盐酸高铁血红蛋白，与标准色柱相比，便可测出其含量，但其难以进行定性检测，所用材料也难以重复使用，且其所用试剂容易造成公害。后者的原理是在三电极系统的工作电极上修饰亚甲蓝等氧化还原剂，当血红蛋白在电极表面与亚甲蓝发生反应时，电子会从待测物和电极之间进行传递，从而产生电流，通过测量电流间接测量血红蛋白，但这种方法也难以对血红蛋白进行定性检测，且预处理较为复杂。典型的血红蛋白检测如中国专利号为201822090530.6，名称为“血红蛋白检测仪”，其不能直接检测血液中血红蛋白，预处理较为复杂，且不能同时进行定性、定量检测。

发明内容

本发明的目的在于解决现有血液中血红蛋白检测存在的问题，提供一种血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片及其检测方法，可以同时进行血红蛋白定性、定量检测，预处理简单，能重复使用。

本发明所述的血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片采用的技术方案是：最上层为玻璃盖片，第二层为PDMS膜，第三层为主体芯片，最下为玻璃底片，玻璃盖片、PDMS膜和主体芯片的左侧上开有血样进样口、红细胞裂解液进样口和亚硝酸盐溶液进样口，三个进样口从上至下贯通玻璃盖片和PDMS膜，主体芯片上的血样进样口和红细胞裂解液进样口各通过弧形管道分别连接细胞裂解区的入口，血样进样口与细胞裂解区之间的弧形管道中间连接第一气体阀，红细胞裂解液进样口与细胞裂解区之间的弧形管道中间连接第二气体阀；细胞裂解区的出口通过串联的横向直管道和第一S管道连接过滤区的入口，所述的横直管道处设有第一气体泵，所述的第一S管道的出口端设有第三气体阀；过滤区的出口通过梯形出样管道连接血红蛋白氧化区的一个入口，血红蛋白氧化区的另一入口通过另一段横向直管道与亚硝酸盐溶液进样口相连接，所述的梯形出样管道处设有第二气体泵，在所述的另一段横向直管道与血红蛋白氧化区相连处设有单向导通阀；血红蛋白氧化区的出口通过第二S管道与右方的延缓池的入口相连，血红蛋白氧化区的出口处设有第四气体阀，延缓池的出口通过L型管道连接右方的电泳分离区的入口，所述的L型管道中间设有第五气体阀，电泳分离区的出口通过梯形管道与电解池的入口相连，电解池的出口连接反应液排除口，在电解池内部，从入口向出口依次排列着参比电极、辅助电极和工作电极；所述的第二S管道的正上方、正下方设有面对面对应布置阴极活性碳电极和阳极活性炭电极；在所述的电泳分离区左侧处的正下方和正下方且于玻璃底片上分别设有阴极电泳电极和阳极电泳电极。

采用所述微流控芯片自动分离、定性及定量检测血红蛋白的方法采用的技术方案是包括以下步骤：

步骤（1）：将血样和红细胞裂解液分别同时滴入血样进样口和红细胞裂解液进样口中，控制第一气体阀、第二气体阀和第一气体泵同时打开，向血样进样口和红细胞裂解液进样口中分别冲入ph为7.8的磷酸缓冲液，使血样和红细胞裂解液在细胞裂解区中混合反应，将红细胞裂解，释放其中的血红蛋白，并在第一气体泵的推动下流入第一S管道中继续充分裂解；

步骤（2）：打开第三气体阀，反应液进入过滤区过滤，向亚硝酸盐进样口加入亚硝酸盐溶液并冲入ph为7.8的磷酸缓冲液，使亚硝酸盐溶液与过滤后的反应液在血红蛋白氧化区混合反应，反应液中的亚铁血红蛋白转化为高铁血红蛋白；

步骤（3）：打开第四气体阀、第二气体泵和第五气体阀，通过第二气体泵的推动，反应液流过第二S管道，多余的亚硝酸盐被吸附去除后进入延缓池，在延缓池聚集后，反应液进入电泳分离区，在电泳分离区中，血红蛋白分离，先后流出电泳分离区进入电解池；

步骤（4）：在电解池中，通过电化学工作站测量工作电极与辅助电极之间的衰减电流产生的时间和衰减电流的大小来定性及定量检测血红蛋白。

本发明与已有方法和技术相比，具有如下优点：

1.本发明实现了对血液中不同种类血红蛋白进行自动分离，并进行定性和定量检测。

2.本发明所需预处理简单，只需对血液进行简单稀释，省去提取血红蛋白的步骤。

3.本发明将血液中血红蛋白的提取、分离和检测集成在一块微流控芯片上，实现了低成本，便携化快速检测。

4.本发明将气体泵、气体阀和电极检测等需要多层不同材料的结构集成设计在一个四层芯片上，大大降低了制作难度。

5.本发明所需的检测样本和试剂很少，可以大大节省血样和检测试剂的用量。

6.本发明基于玻璃基微流控芯片，将各个功能区块分开，且过滤区滤纸可以更换，从而可实现循环使用，大大节约成倍。

7.本发明各部分操作自动化，可以解放多余人力，物力。

附图说明

图1为本发明一种血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片的结构分解示意图；

图2为图1中主体芯片c的结构俯视图；

图3为图2中关联部件与主体芯片c的装配结构图；

图4为图3的仰视图；

图5为图4的俯视图；

图6为图3中气体阀的安装结构放大图，以第一气体阀2为例；

图7为图6中气体阀的结构放大图；

图8是图3中过滤区12的放大的俯视图；

图9是图3中过滤区12装配后的放大的仰视图；

图10是图9的左视图；

图11是图3中单向导通阀11装配后的放大图；

图12是图3中电解池10的内部结构放大图。

附图中各部件的序号和名称：

a.玻璃盖片；b. PDMS膜；c.主体芯片；d.玻璃底片；f.第一S管道；g.第二S管道；

1.血样进样口；2.第一气体阀；3.红细胞裂解液进样口；4.亚硝酸盐溶液进样口；5.第一气体泵；6.血红蛋白氧化区；7.亚硝酸盐去除区；8.电泳分离区；9.反应液排除口；10.电解池；11.单向导通阀；12.过滤区；13.第二气体阀；14.第三气体阀；15.第四气体阀；16.第二气体泵；17.第五气体阀；18.细胞裂解区；19.延缓池；20.可取出盖片； 21.气体阀上气体进出管；22.气体阀上气体通道；23.气体阀对应流体通道；111.单向导通阀上凸起；112.单向导通阀所在处的流体通道；113.单向导通阀下凸起；121.滤纸；122.下层过滤通道；123.PDMS拦截阀；125.圆木棒；126.上层过滤通道；72.阴极活性炭电极；73.阴极活性炭电极接出线；74.阳极活性炭电极接出线；75.阳极活性炭电极；81.阴极电泳电极；82.阳极电泳电极；84.阴极电泳电极接出线；85.阳极电泳电极接出线；101.工作电极；102.辅助电极；103.参比电极；105.工作电极接出线；106.辅助电极接出线；107.参比电极接出线。

具体实施方式

参见图1，本发明一种血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片是由从上至下的四层组成的长方体，最上面第一层为玻璃盖片a，其总体厚度为1.5mm，第二层为PDMS膜b，其总体厚度为300微米，第三层为主体芯片c，其总体厚度为2.5mm，最下面第四层为玻璃底片d，其总体厚度为1.5mm。四层的长和宽的尺寸都为30mm*85mm，通过环氧树脂上下粘合在一起。沿长方体微流控芯片的长度方向为左、右方向。

在第一层玻璃盖片a、第二层PDMS膜b和主体芯片c的左侧上开有血样进样口1、红细胞裂解液进样口3和亚硝酸盐溶液进样口4，这三个进样口的半径均为1.5mm，且从上至下贯通玻璃盖片a和PDMS膜b。血样进样口1和红细胞裂解液进样口3沿宽度方向在同一直线上，两者相距15mm。亚硝酸盐溶液进样口4在红细胞裂解液进样口3的右侧，通过血样进样口1加入血样，通过红细胞裂解液进样口3加入红细胞裂解液，通过亚硝酸盐溶液进样口4加入亚硝酸盐溶液。

参见图2的主体芯片c，主体芯片c上的血样进样口1和红细胞裂解液进样口3深度均为0.5mm的圆形凹槽，不贯通主体芯片c。两进样口的右侧是细胞裂解区18，细胞裂解区18为圆形凹槽，半径为2mm，大于两进样口的半径，深度和两进样口的深度相同，为0.5mm。细胞裂解区18的入口各通过弧形管道分别与血样进样口1和红细胞裂解液进样口3连接，弧形管道为宽为2mm，深0.5mm的矩形凹槽。加入的血样和红细胞裂解液，通过弧形管道汇聚到细胞裂解区18内，便于血样细胞发生裂解反应，形成红细胞裂解液和血样混合的反应液。

细胞裂解区18的右侧出口通过串联的一段横向直管道和第一S管道f连接过滤区12的入口。横向直管道为宽2mm，深0.5mm的矩形凹槽，与主体芯片c的长边相平行。第一S管道f位于横向直管道的右侧，为宽2mm，深0.5mm的S型凹槽。当反应液流入第一S管道f时，由于第一S管道f的弯道设计，可以延缓反应液的流动速度，从而让血细胞充分裂解。

过滤区12的出口和入口面对面，出口和入口靠近主体芯片c的长边两侧，过滤区12的出口通过一个梯形出样管道连接血红蛋白氧化区6的一个入口，梯形出样管道的管道口从过滤区12至血红蛋白氧化区6是逐渐缩小，梯形出样管道和主体芯片c的短边相平行。梯形出样管道是底边为4mm，顶边为2mm，深为1mm的梯形凹槽。血红蛋白氧化区6为半径为2mm，深为1mm的圆形凹槽。血红蛋白氧化区6的另一个入口通过另一段横向直管道与亚硝酸盐溶液进样口4相连接，亚硝酸盐溶液进样口4相对血红蛋白氧化区6更加靠近红细胞裂解液进样口3，位于红细胞裂解液进样口3和血红蛋白氧化区6之间。亚硝酸盐溶液进样口4为半径1.5mm，深1mm的圆形凹槽，与血红蛋白氧化区6平行，其间的另一段横向直管道的长为1.5cm，在另一段横向直管道与血红蛋白氧化区6相连处有单向导通阀11，通过单向导通阀11使亚硝酸盐溶液只能从亚硝酸盐溶液进样口4向血红蛋白氧化区6中流动，防止反应液流入血红蛋白氧化区6时，反应液流向亚硝酸盐溶液进样口4中。当红细胞裂解液和血样混合的反应液流入血红蛋白氧化区6时，向亚硝酸盐溶液进样口4中加入亚硝酸盐溶液，使亚硝酸盐溶液、红细胞裂解液和血样三者在血红蛋白氧化区6内混合并发生氧化还原反应，使氧化还原反应液中的亚铁血红蛋白转化为高铁血红蛋白。

血红蛋白氧化区6的出口通过第二S管道g与延缓池19的入口相连，第二S管道g为宽为2mm，深1mm的连续的两个S型凹槽，第二S管道g所占区域沿主体芯片c长度方向的直线长为2.5cm，沿主体芯片c宽度度方向的直线宽为2.6cm。延缓池19在第二S管道g的右侧，延缓池19为半径为3mm，深1mm的圆形凹槽。延缓池19的出口通过L型管道连接电泳分离区8入口，电泳分离区8位于延缓池19的右方，这段L型管道为宽2mm，深1mm的矩形凹槽。当反应液流到延缓池19时，由于延缓池19可以存储一些反应液，从而延缓反应液流入电泳分离区8的时间，所以可以使反应液聚集，然后一起进入电泳分离区8，从而更好地分离出反应液中不同种类的血红蛋白。电泳分离区8为长3cm，宽6mm，深1mm的矩形凹槽。电泳分离区8的出口在右端，它的出口管道是梯形管道，梯形管道为左侧宽4mm、右侧宽2mm的梯形凹槽，梯形管道通过一段直管道与电解池10的右端的入口相连，这一直管道为宽2mm，深1mm的矩形凹槽。电解池10为长1.2cm，宽0.8cm，深1.5mm的矩形凹槽，和电泳分离区8平行布置。电解池10内部，从左的入口向右的出口依次排列着参比电极、辅助电极和工作电极，电解池10的出口在左端，电泳分离后的反应液流入电解池10后，通过检测相关数据就可以分析出结果。电解池10的出口与一L型管道9相连，L型管道为宽2mm，深1.5mm的L型凹槽，连接反应液排除口9，反应液排出主体芯片c上。

参见图3，在主体芯片c上的血样进样口1与细胞裂解区18之间的弧形管道中间连接第一气体阀2，红细胞裂解液进样口3与细胞裂解区18之间的弧形管道中间连接第二气体阀13。再结合图6和图7所示的第一气体阀2的结构，第一气体阀2和第二气体阀13的结构完全相同，以第一气体阀2为例，其由气体阀上气体进出管21、气体阀上气体通道22、气体阀对应流体通道23组成。气体阀上气体进出管21位于气体通道22上部，其通过与其直径相当的圆孔连接气体阀上气体通道22，气体阀上气体进出管21由聚四氯乙烯管制成的，直径为1.5mm，高为0.8cm。再结合图4和图5，其中，气体阀上气体进出管21设在玻璃盖片a上部，并且高出玻璃盖片a上表面，用环氧树脂竖直粘在玻璃盖片a上对应圆孔位置。气体阀上气体通道22贴在PDMS膜b上；气体阀对应流体通道23和主体芯片c上弧形管道形成一体。气体阀上气体通道22与气体阀对应流体通道23垂直，气体阀上气体进出管21向上穿过玻璃盖片a与PDMS膜b上的气体阀上气体通道22相连。血样进样口1与细胞裂解区18之加入的血样和红细胞裂解液，通过控制第一气体阀2和第二气体阀13同时打开来控制这两种液体同时汇聚到细胞裂解区18，便于血样细胞发生裂解反应。工作时，气体阀上气体进出管21通过软管与工作气源相连，采用氮气作为工作气源，在气源与气体阀上气体进出管21之间用一个三通阀进行工作气路控制。工作气路根据芯片中反应液反应的时间顺序控制芯片中各个气体阀导通与关闭的时间。当三通阀开启时,气源向气体阀上气体通道22充气,泵膜发生向下的形变液流通道被截断；三通阀关闭后, 气体阀上气体通道22中的气体被排出,致动力撤销，泵膜恢复形变，流体通道重新导通。

参见图3，细胞裂解区18右侧的横直管道处设有第一气体泵5，第一气体泵5由三个相同气体阀相隔1mm排列组成，这三个气体阀中的单个气体阀的结构和第一气体阀2的结构相同。通过第一气体泵5的工作，推动红细胞裂解液和血样混合的反应液向右流动。第一S管道f的出口端处设有第三气体阀14，第三气体阀14的结构和第一气体阀2的结构相同，通过控制第三气体阀14来控制反应液进入过滤区12时间。过滤区12出口的梯形出样管中间处设有第二气体泵16，第二气体泵16的结构和第一气体泵5的结构相同，通过第二气体泵16推动反应液后续流动。血红蛋白氧化区6的出口处设有第四气体阀15，第四气体阀15和第一气体泵5的结构相同，第四气体阀15用来控制反应液流出血红蛋白氧化区6的时间，从而使反应液中的亚铁血红蛋白充分转化为高铁血红蛋白。在主体芯片c上的延缓池19和电泳分离区8相连的L型管道中间有第五气体阀17，第五气体阀17和第一气体泵5的结构相同，用来控制反应液进入电泳分离区8的时间。

对于第一气体泵5和第二气体泵16，在气源与芯片之间用三个三通阀进行工作气路控制，按微泵致动程序编写气动微泵控制程序,并通过并口信号功率放大接口电路控制三通阀的开关，当三通阀开启时,气源向气体通道充气,泵膜发生向下的形变，液流通道被截断；三通阀关闭后,气体通道中的气体被排出，致动力撤销，泵膜恢复形变，流体通道重新导通。气体泵在工作时，驱动部分由三个平行排列的开关阀构成，通过阀的依次下压促使泵膜依次顺序下压来实现对液流的驱动。

结合图8、图9和图10所示的过滤区12结构，过滤区12的内部设有滤纸121，上方是可取出盖片20。可取出盖片20为过滤区12位置的正上方且在玻璃该片a和PDMS膜b上切割出的矩形片，粘合装在玻璃该片a和PDMS膜b上。当红细胞裂解液和血样混合的反应液流入过滤区12时，其内部的滤纸121可以滤去血细胞裂解后反应液中白细胞和细胞膜等大颗粒物质，从而净化反应液，便于后续检测。

滤纸121水平布置在过滤区12中间，将过滤区12分隔成上下两层通道，分别是上层过滤通道126和下层过滤通道122，过滤区12的上面为可取出盖片20，可取出盖片20覆盖在上层过滤通道126上方，其大小比上层过滤通道126略大。过滤区12中的上层过滤通道126的长度、宽度和深度大于下层过滤通道122对应的长度、宽度和深度。上层过滤通道126连通过滤区12的入口，下层过滤通道122连通过滤区12的出口，即所述的梯形出样管道。滤纸121的厚度大约为0.2mm，紧靠过滤区12的入口，滤纸121两侧用环氧树脂粘在上层过滤通道126底部侧壁上。反应液从过滤区12的入口流入过滤区12中的上层过滤通道126，透过滤纸121进入下层过滤通道122，再从下层过滤通道122流进梯形出样管道，从梯形出样管道流出，从而达到滤去白细胞和细胞膜等大颗粒物质的目的。

在可取出盖片20的下表面向下伸出一个凸起，位于上层过滤通道126中，构成PDMS拦截阀123，如图10，PDMS拦截阀123的横切截面为直角三角形，由于是三角凸起，所以不易发生形变，其作用是使反应液在进入上层过滤通道126中时，只能向下通过滤纸121进入下层过滤通道122中，不能从上层过滤通道126流出。

可取出盖片20由盖片上层和盖片下层组成，盖片上层是玻璃盖片，其厚度为1.5mm，盖片下层是PDMS膜，其厚度为300微米，两者之间用环氧树脂上下粘合固定。在可取出盖片20的上表面的正上方固定连接一个圆木棒125，圆木棒125插在可取出盖片20的中央，用环氧树脂粘在圆木棒对应的插口处，与可取出盖片20组成一体。圆木棒125作为可取出盖片20的把手，便于将可取出盖片20取出，从而更换滤纸121，以提高芯片可重复使用次数。

参见图3、图4和图5所示，主题芯片c上第二S管道g的正上方、正下方设置阴极活性碳电极72、阳极活性炭电极75，阴极活性碳电极72和阳极活性炭电极75上下面对面对应布置，本发明在第二S管道g的正上方设置阴极活性碳电极72，在第二S管道g的正下方设置阳极活性炭电极75。由第二S管道g和第二S管道g对应的阴极活性碳电极72、阳极活性炭电极75共同组成亚硝酸盐去除区7。阴极活性碳电极72和阳极活性炭电极75沿芯片的宽度走向设置，和芯片的宽边平行。一个阴极活性碳电极72和阳极活性炭电极75组成一对电极，共有4对电极，四对电极长短一致结构相同。阴极活性碳电极72设在玻璃盖片a上所开的对应于第二S管道g位置的凹槽处，阳极活性炭电极75设在玻璃底片d上所开的对应于第二S管道g位置的凹槽处。反应液进入亚硝酸盐去除区7后，通过活性炭吸附，可以祛除反应液中剩余的亚硝酸盐。各个阴极活性碳电极72并联后共同连接到阴极活性炭电极接出线73，各个阳极活性炭电极75并联后共同连接到阳极活性炭电极接出线74。阴极活性炭电极接出线73和阳极活性炭电极接出线74与恒压源电路相连，控制各对活性炭电极间的电压稳定在1.6V，通过活性炭电极对硝酸根/亚硝酸根离子有选择性地吸附的特点，去除反应液剩余的亚硝酸盐。

参见图3、图4和图5所示的电泳分离区8，在主题芯片c上的电泳分离区8为长3cm，宽6mm，深1mm的矩形凹槽，呈横向放置。电泳分离区8的左侧处的正下方，于玻璃底片d上设有阴极电泳电极81，电泳分离区8的右侧处的正下方，于玻璃底片d上设有阳极电泳电极82。阴极电泳电极81位于玻璃底片d中对应于电泳分离区8左侧始端的凹槽中，阳极电泳电极82位于玻璃底片d中对应电泳分离区8右侧末端的凹槽中。阴极电泳电极81和阳极电泳电极82大小一致，厚度为0.5mm，宽2mm，长5mm，两电极的材质为碳电极。阴极电泳电极接出线84和阳极电泳电极接出线85都穿过玻璃底片的d，将它们与恒压源电路相连，控制两电极间的电压为100V，当反应液进入电泳分离区8中后，由于血红蛋白的等电点大多小于7，所以在ph为7.8的磷酸缓冲液中会向阳极运动，而不同血红蛋白具有不同的等电点，所以他们在电泳池中速度也不相同，从而根据速度的不同，将不同种类的血红蛋白分离。

参见图3和图11所示的单向导通阀11，单向导通阀11由单向导通阀上凸起111和单向导通阀下凸起113组成，上凸起111在PDMS膜b的下部，其凸起的长度为0.8mm，厚0.2mm，宽度与单向导通阀所在处的流体通道112的宽度相当。单向导通阀下凸起113在主体芯片c上的管道上，位于单项导通阀上凸起111的左下方，其高度为0.5mm，厚为0.3mm，宽度与单向导通阀所在处的流体通道112的宽度相当，由这两个凸起构成了单向导通阀，当液体从左向右流动时，由于上部的单向导通阀上凸起111较软，液体可以从左向右流过，而当液体从右向左流时，单向导通阀上凸起111发生形变时会接触到单向导通阀下凸起113被阻挡，所以液体无法流过。

参见图3、图4和图12所示的电解池10，电解池10为长1.2cm，宽0.8cm，深1.5mm的矩形凹槽。参比电极103、辅助电极102、工作电极101从左向右依次竖向排列在电解池10，它们之间两两相距3mm。参比电极103与辅助电极102大小一致，都是厚0.5mm，高1.5mm，长5mm，工作电极101高1.5mm，长5mm，由于有其他材料修饰，厚度略厚一点。参比电极103材质为AgCI，辅助电极102材质为玻碳，工作电极101材质为玻碳，工作电极101上用亚甲蓝和电活性单体N-乙烯基咔唑(VCz)组成的混合溶液采用循环伏安法修饰。三个电极用环氧树脂竖立粘合在电解池10的底部的凹槽中，底部的凹槽深度都为0.3mm。参比电极接出线107、辅助电极接出线106、工作电极接出线105穿过主体芯片c和玻璃底片d与电化学工作站相连，保持工作电极101和参比电极103之间的电压恒定, 测量工作电极101与辅助电极102之间的响应电流。检测时，在工作电极101和参比电极103之间施加一个阶跃电位，当多股分离出的反应液流入电解池10后，在不同的时间工作电极101与辅助电极102之间会先后产生衰减电流，根据衰减电流产生的时间可以判断是那种血红蛋白，根据衰减电流的大小可以得知血红蛋白的多少。可以先对大量正常血样检测，设定一个标准值。再将检测结果与标准值对比，从而对检测结果进行评估。

参见图1-12，本发明实现检测的方法如下：

预处理：人工控制本发明芯片周围环境温度为5摄氏度左右，准备好需要检测的血样，将其稀释10倍，准备充足的ph为7.8的磷酸缓冲液，准备好适量的红细胞裂解液和20mmol/L的亚硝酸盐溶液。将本发明芯片中的各个气体泵与气体阀与工作气源相连，并保持各个气体阀和气体泵关闭。将阴极活性炭电极接出线73和阳极活性炭电极接出线74恒压源电路相连，控制各对活性炭电极间的电压稳定在1.6V。将阴极电泳电极接出线84与阳极电泳电极接出线85与恒压源电路相连，控制两电极间的电压为100V。将参比电极接出线107、辅助电极接出线106、工作电极接出线105分别与电化学工作站相连，在工作电极101和参比电极103之间施加一个阶跃电位，并保持其电压恒定。根据反应的时间顺序编写气体阀和气体泵的控制程序。然后按以下步骤检测：

步骤1: 人工将适量稀释10倍后的血样和适量红细胞裂解液分别同时滴入血样进样口1和红细胞裂解液进样口3中，同时启动控制程序，控制第一气体阀2、第二气体阀13和第一气体泵5同时打开，然后向血样进样口1和红细胞裂解液进样口3中分别冲入适量ph为7.8的磷酸缓冲液。使血样和红细胞裂解液在细胞裂解区18混合发生反应，将红细胞裂解，从而释放其中的血红蛋白，并在第一气体泵5的推动下流入右侧第一S管道f，在第一S管道f中，血样细胞继续充分裂解。

步骤2：到设置的时间后，本发明设定10分钟后，打开第三气体阀14，反应液进入过滤区12，发生过滤，当反应液流出过滤区12后即将进入血红蛋白氧化区6时，此时，人工向亚硝酸盐进样口4加入适量亚硝酸盐溶液，并冲入适量ph为7.8的磷酸缓冲液，使亚硝酸盐溶液与过滤后的反应液在血红蛋白氧化区6混合发生反应，使反应液中的亚铁血红蛋白转化为高铁血红蛋白。

步骤3：到设置的时间后，本发明设定12分钟后，反应液中的亚铁血红蛋白充分转化为高铁血红蛋白，此时打开第四气体阀15、第二气体泵16和第五气体阀17，反应液进入第二S管道g，在亚硝酸盐去除区7，通过第二气体泵16的推动，反应液流过亚硝酸盐去除区7，反应液中多余的亚硝酸盐被吸附去除。反应液流出亚硝酸盐去除区7后进入延缓池19，在延缓池19聚集后，反应液进入电泳分离区8，在电泳分离区8中，不同等电点的血红蛋白分离，先后流出电泳分离区8进入电解池10。

步骤4：不同血红蛋白先后进入电解池10后，人工通过电化学工作站测量记录工作电极101与辅助电极102之间的衰减电流产生的时间和衰减电流的大小，根据衰减电流产生的时间可以判断是哪种血红蛋白，根据衰减电流的大小可以得知血红蛋白的多少，完成定性及定量检测。

步骤5：反应结束，关闭气体泵和气体阀的控制程序，将气体泵与气体阀与工作气源分离，将各电极连接线与工作电路分离，将芯片清理干净。

Claims (10)

1.一种血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片，最上层为玻璃盖片（a），第二层为PDMS膜（b），第三层为主体芯片（c），最下为玻璃底片（d），其特征是：玻璃盖片（a）、PDMS膜（b）和主体芯片（c）的左侧上开有血样进样口（1）、红细胞裂解液进样口（3）和亚硝酸盐溶液进样口（4），三个进样口从上至下贯通玻璃盖片（a）和PDMS膜（b），其特征是：主体芯片（c）上的血样进样口（1）和红细胞裂解液进样口（3）各通过弧形管道分别连接细胞裂解区（18）的入口，血样进样口（1）与细胞裂解区（18）之间的弧形管道中间连接第一气体阀（2），红细胞裂解液进样口（3）与细胞裂解区（18）之间的弧形管道中间连接第二气体阀（13）；细胞裂解区（18）的出口通过串联的横向直管道和第一S管道（f）连接过滤区（12）的入口，所述的横向直管道处设有第一气体泵（5），所述的第一S管道（f）的出口端设有第三气体阀（14）；过滤区（12）的出口通过梯形出样管道连接血红蛋白氧化区（6）的一个入口，血红蛋白氧化区（6）的另一入口通过另一段横向直管道与亚硝酸盐溶液进样口（4）相连接，所述的梯形出样管道处设有第二气体泵（16），在所述的另一段横向直管道与血红蛋白氧化区（6）相连处设有单向导通阀（11）；血红蛋白氧化区（6）的出口通过第二S管道（g）与右方的延缓池（19）的入口相连，血红蛋白氧化区（6）的出口处设有第四气体阀（15），延缓池（19）的出口通过L型管道连接右方的电泳分离区（8）的入口，所述的L型管道中间设有第五气体阀（17），电泳分离区（8）的出口通过梯形管道与电解池（10）的入口相连，电解池（10）的出口连接反应液排除口（9），在电解池（10）内部，从入口向出口依次排列着参比电极（103）、辅助电极（102）和工作电极（101）；所述的第二S管道（g）的正上方、正下方设有面对面对应布置阴极活性碳电极（72）和阳极活性炭电极（75）；在所述的电泳分离区（8）左侧处的正下方和正下方且于玻璃底片（d）上分别设有阴极电泳电极（81）和阳极电泳电极（82）。

2.根据权利要求1所述的血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片，其特征是：第一气体泵（5）和第二气体泵（16）均由三个相同的气体阀间隔排列组成，三个气体阀均与第一、第二、第三、第四气体阀（2、13、14、15）的结构相同，第一、第二、第三、第四气体阀（2、13、14、15）这四个气体阀的结构完全相同，每个气体阀均由气体阀上气体进出管（21）、气体阀上气体通道（22）、气体阀对应流体通道（23）组成，气体阀上气体通道（22）贴在PDMS膜（b）上，气体阀上气体进出管（21）向上穿过玻璃盖片（a）且与气体阀上气体通道（22）相连，气体阀对应流体通道（23）和主体芯片（c）的管道形成一体，气体阀上气体通道（22）与气体阀对应流体通道（23）垂直。

3.根据权利要求1所述的血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片，其特征是：过滤区（12）的内部设有水平布置在过滤区（12）中间的滤纸（121），滤纸（121）将过滤区（12）分隔成上层过滤通道（126）和下层过滤通道（122）；可取出盖片（20）覆盖在上层过滤通道（126）上方，可取出盖片（20）为过滤区（12）位置的正上方且在玻璃该片（a）和PDMS膜（b）上切割且粘合出的矩形片，下层过滤通道（122）连通过滤区（12）的出口，上层过滤通道（126）连通过滤区（12）的入口。

4.根据权利要求3所述的血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片，其特征是：可取出盖片（20）由盖片上层和盖片下层组成，盖片上层是玻璃盖片层，盖片下层是PDMS膜层，可取出盖片（20）的下表面向下凸起一个位于上层过滤通道（126）中的PDMS拦截阀（123）；可取出盖片（20）的上表面的正上方固定连接一个圆木棒（125）。

5.根据权利要求1所述的血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片，其特征是：阴极活性碳电极（72）设在玻璃盖片（a）上所开的对应于第二S管道（g）位置的凹槽处，阳极活性炭电极（75）设在玻璃底片（d）上所开的对应于第二S管道（g）位置的凹槽处，一个阴极活性碳电极（72）和一个阳极活性炭电极（75）组成一对电极，共有结构相同的四对电极，各个阴极活性碳电极（72）并联后共同连接到阴极活性炭电极接出线（73），各个阳极活性炭电极（75）并联后共同连接到阳极活性炭电极接出线（74），阴极活性炭电极接出线（73）和阳极活性炭电极接出线（74）与恒压源电路相连。

6.根据权利要求1所述的血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片，其特征是：阴极电泳电极（81）和阳极电泳电极（82）均位于玻璃底片（d）中对应于电泳分离区（8）的凹槽中，阴极电泳电极（81）和阳极电泳电极（82）的大小一致，阴极电泳电极接出线（84）和阳极电泳电极接出线（85）都穿过玻璃底片的（d）与恒压源电路相连。

7.根据权利要求1所述的血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片，其特征是：所述的单向导通阀（11）由单向导通阀上凸起（111）和单向导通阀下凸起（113）组成，单向导通阀上凸起（111）在PDMS膜（b）的下部，单向导通阀下凸起（113）在主体芯片（c）上的管道上，位于单向导通阀上凸起（111）的左下方，液体只可从左向右流过。

8.根据权利要求1所述的血红蛋白自动分离、定性及定量检测的微流控芯片，其特征是：参比电极（103）材质为AgCl ，辅助电极（102）材质为玻碳，工作电极（101）材质为玻碳，工作电极（101）上用亚甲蓝和电活性单体N-乙烯基咔唑组成的混合溶液采用循环伏安法修饰，三个电极的接出线穿过主体芯片（c）和玻璃底片（d）与电化学工作站相连，保持工作电极（101）和参比电极（103）之间的电压恒定, 测量工作电极（101）与辅助电极（102）之间的响应电流。

9.一种采用权利要求1所述微流控芯片自动分离、定性及定量检测血红蛋白的方法，其特征是包括以下步骤：

步骤（1）：将血样和红细胞裂解液分别同时滴入血样进样口（1）和红细胞裂解液进样口（3）中，控制第一气体阀（2）、第二气体阀（13）和第一气体泵（5）同时打开，向血样进样口（1）和红细胞裂解液进样口（3）中分别冲入pH值为7.8的磷酸缓冲液，使血样和红细胞裂解液在细胞裂解区（18）中混合反应，将红细胞裂解，释放其中的血红蛋白，并在第一气体泵（5）的推动下流入第一S管道（f）中继续充分裂解；

步骤（2）：打开第三气体阀（14），反应液进入过滤区（12）过滤，向亚硝酸盐进样口（4）加入亚硝酸盐溶液并冲入pH 为7.8的磷酸缓冲液，使亚硝酸盐溶液与过滤后的反应液在血红蛋白氧化区（6）混合反应，反应液中的亚铁血红蛋白转化为高铁血红蛋白；

步骤（3）：打开第四气体阀（15）、第二气体泵（16）和第五气体阀（17），通过第二气体泵（16）的推动，反应液流过第二S管道（g），多余的亚硝酸盐被吸附去除后进入延缓池（19），在延缓池（19）聚集后，反应液进入电泳分离区（8），在电泳分离区（8）中，血红蛋白分离，先后流出电泳分离区（8）进入电解池（10）；

步骤（4）：在电解池（10）中，通过电化学工作站测量工作电极（101）与辅助电极（102）之间的衰减电流产生的时间和衰减电流的大小来定性及定量检测血红蛋白。

10.根据权利要求9所述的自动分离、定性及定量检测血红蛋白的方法，其特征是：在步骤（1）之前，将阴极活性炭电极和阳极活性炭电极的接出线与一个恒压源电路相连，将阴极电泳电极和阳极电泳电极的接出线与另一个恒压源电路相连，将参比电极、辅助电极和工作电极的接出线分别与电化学工作站相连，在工作电极和参比电极之间施加阶跃电位并保持其电压恒定。

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