CN113144198A

CN113144198A - 诱导癌前病变细胞衰老的组合物和方法

Info

Publication number: CN113144198A
Application number: CN202110391132.1A
Authority: CN
Inventors: 何志颖; 陈文健; 陈苗苗; 卢艳丽; 余朝
Original assignee: Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Current assignee: Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Priority date: 2020-04-16
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-04-12
Also published as: CN113144198B

Abstract

本发明提供CDK抑制剂在制备诱导对象癌前病变细胞衰老的药物中的用途，CDK抑制剂在制备预防或治疗对象癌前病变或癌症的药物中的用途，和CDK抑制剂在制备诱导对象针对衰老细胞的免疫响应的药物中的用途。

Description

诱导癌前病变细胞衰老的组合物和方法

技术领域

本发明涉及通过诱导癌前病变细胞衰老来预防和治疗癌前病变或癌症的组合物和方法。

背景技术

根据2018年CA的统计数据，肝癌是全球范围内第六大致死性癌症。作为严重威胁我国人民身体健康的恶性肿瘤之一，近年来肝癌发病率呈逐年上升趋势。肝癌中的75％-85％为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)，研究 HCC发生发展的机制迫在眉睫。

HCC的发生是一个复杂的病理过程，其进展可以概括为慢性肝病——肝纤维化——肝硬化——HCC四个阶段。70％-80％的HCC病例有肝硬化史，1/3 的肝硬化患者会进展为HCC。HCC的异质性较高，还没有发现占主导地位的致癌原因。对大量HCC样本进行分析统计发现，HCC的驱动突变主要集中在端粒维持、细胞周期控制、WNT-β-连环蛋白、染色体修饰、RTK–RAS–PI3K 及氧化应激等通路。具体到特定基因，30％的HCC有TP53基因缺失、RB1缺失占9％、7％的有CDKN2A基因缺失；7％的HCC有CCND1基因扩增、12％的有MYC基因扩增。HCC发生的早期，患者无明显自觉症状，因症状就医时 HCC基本已进展到中晚期。中晚期HCC患者对化疗药物通常不敏感，因此针对不适合手术切除的患者其治疗手段有限、中位生存期短。致癌突变的多样性与分散性，给抗癌药物的研究带来了难题。

肝硬化到HCC发生的临界阶段又可以分为低级非典型增生结节(low gradedysplastic nodules,LGDN)、高级非典型增生结节(high grade dysplastic nodules,HGDN)、早期HCC和进展性HCC(progressed HCC)。由此可见，非典型增生肝细胞是肝癌最常见的癌前病变形式，在HCC发生前清除肝脏内的异常增殖细胞，有可能实现对癌变病前肝细胞的清除，从而阻止HCC的发生。

正常状态下，肝脏中的肝细胞以很低速率进行着细胞更替。另外，肝细胞的端粒长度在各种成体细胞中位居前列，且部分肝细胞持续表达端粒酶。这两种特性保证了正常情况下肝细胞处于“年轻”状态。但在慢性乙肝、慢性丙肝、酒精性肝病与非酒精性脂肪肝等慢性肝病中，普遍存在着肝细胞衰老的现象。

细胞衰老的最大特征，就是细胞永久的退出细胞周期，进入不分裂的状态，同时在一定程度上保持细胞的功能。细胞衰老被视作细胞内在的抗肿瘤机制，受多重信号通路调控，主导通路是p53-p21、p16-Rb信号通路。肿瘤发生是一个逐步突破衰老细胞机制限制的过程，成瘤前的细胞累积一系列驱动性的癌变因素后，才会最终转化为肿瘤细胞。细胞内原癌基因的激活、抑癌基因的抑制，都能触发细胞衰老，这种衰老又称原癌基因诱导衰老(oncogene induced senescence，OIS)，是肿瘤发生前的抗癌变“屏障”。肿瘤癌变完成后，细胞衰老通过另外的形式发挥抗肿瘤作用：由于细胞衰老的调控通路具有复杂性和冗余性，即使致癌突变突破了导致OIS的防线完成细胞的癌变，肿瘤细胞内的细胞衰老通路依然保留了对其他诱导因素的反应性，治疗措施还能绕过已有致癌突变，诱导肿瘤细胞发生衰老，即治疗诱导的衰老(therapy induced senescence， TIS)。

在HCC领域，诱导肿瘤细胞衰老既是充满研究前景的领域，也是临床上有着巨大理论需求的领域。由于现有HCC化疗药物如索拉非尼、瑞格非尼和卡赞替尼等，都不是特异性诱导HCC衰老的靶向药物。因此，研究细胞衰老在HCC发生发展中的作用，将为HCC的衰老诱导治疗提供新的理论基础，为研究新的靶向药物提供突破口。

发明内容

发明人发现CDK抑制剂能通过诱导癌前病变细胞衰老从而激活免疫系统对衰老细胞的清除机制来预防或治疗疾病，尤其是癌症。

因此，本发明提供一种CDK抑制剂在制备诱导对象的癌前病变细胞衰老的药物中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述癌前病变细胞是对象器官的癌和/或非癌组织的癌前病变细胞。在一个或多个实施方案中，癌前病变细胞处于异常增殖状态。

在一个或多个实施方案中，所述对象是哺乳动物，优选人。

在一个或多个实施方案中，所述器官选自甲状腺、胃、肝、肺、肠、肾、胰、膀胱、生殖器官，优选肝。

在一个或多个实施方案中，所述癌前病变细胞是肝脏癌前病变细胞。

在一个或多个实施方案中，肝脏癌前病变细胞是非G0期肝细胞，即脱离静息状态的肝细胞。

在一个或多个实施方案中，所述癌前病变细胞是肝损伤或肝癌组织中的癌前病变细胞。

在一个或多个实施方案中，肝损伤或肝癌组织中的癌前病变细胞是非典型增生肝细胞和/或腺瘤样增生肝细胞。

在一个或多个实施方案中，CDK抑制剂不损伤肝功能。

在一个或多个实施方案中，对象罹患肝细胞癌的风险降低5倍。

在一个或多个实施方案中，所述CDK是调节细胞G1期和S期的CDK。

在一个或多个实施方案中，CDK抑制剂是CDK4抑制剂和/或CDK6抑制剂。

在一个或多个实施方案中，CDK抑制剂是Palbociclib(PD0332991)、 Ribociclib、Abemaciclib、Trilaciclib、SHR6390、FLX-925，或其异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物。

在一个或多个实施方案中，药学上可接受的盐包括硝酸盐、磺酸盐、盐酸盐、羟乙基磺酸盐。优选盐酸盐、羟乙基磺酸盐。

在一个或多个实施方案中，异构体包括立体异构体、几何异构体、互变异构体。

在一个或多个实施方案中，CDK抑制剂是式I化合物或其异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物或其衍生物：

本发明还提供CDK抑制剂在制备预防或治疗对象的癌前病变或癌症的药物中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述CDK抑制剂使对象中的癌前病变细胞衰老，其中所述癌前病变细胞是对象器官的癌和/或非癌组织的癌前病变细胞。

在一个或多个实施方案中，癌前病变细胞处于异常增殖状态。

在一个或多个实施方案中，所述对象是哺乳动物，优选人。

在一个或多个实施方案中，所述癌前病变是肝脏癌前病变。

在一个或多个实施方案中，肝脏癌前病变是慢性肝损伤、肝细胞非典型增生、腺瘤样增生、肝硬化或肝结节。

在一个或多个实施方案中，所述肝硬化包括病毒性肝硬化和非病毒性肝硬化。

在一个或多个实施方案中，病毒性肝硬化是肝炎如乙型肝炎或丙型肝炎导致的肝硬化。

在一个或多个实施方案中，非病毒性肝硬化是酒精性肝病或非酒精性脂肪肝导致的肝硬化。

在一个或多个实施方案中，所述癌症是肝癌，优选肝细胞癌。

在一个或多个实施方案中，肝脏癌前病变细胞是非典型增生肝细胞和/或腺瘤样增生肝细胞。

在一个或多个实施方案中，预防或治疗对象的癌症包括防止癌症的发生和 /或抑制癌症的发展。

在一个或多个实施方案中，CDK抑制剂不损伤肝功能。

本发明还提供CDK抑制剂在制备诱导对象针对衰老细胞的免疫响应的药物中的用途，其中，CDK抑制剂诱导对象的癌前病变细胞衰老。

在一个或多个实施方案中，所述对象是哺乳动物，优选人。

在一个或多个实施方案中，癌前病变细胞是肝损伤或肝癌组织中的癌前病变细胞，优选非典型增生肝细胞和/或腺瘤样增生肝细胞。

在一个或多个实施方案中，所述免疫响应消除所述衰老细胞。在一个或多个实施方案中，所述免疫响应诱导免疫细胞消除所述衰老细胞。在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞是巨噬细胞。

在一个或多个实施方案中，CDK抑制剂不损伤肝功能。

本发明还提供一种药物组合物或药盒，所述药物组合物或药盒含有CDK 抑制剂和其他的抗癌剂。

在一个或多个实施方案中，所述CDK抑制剂是CDK4抑制剂和/或CDK6 抑制剂。

在一个或多个实施方案中，所述CDK抑制剂是Palbociclib(PD0332991)、Ribociclib、Abemaciclib、Trilaciclib、SHR6390、FLX-925，或其异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物。

在一个或多个实施方案中，所述CDK抑制剂是式I化合物或其异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物或其衍生物：

附图说明

图1显示Fah^-/-小鼠给药前后及对照组的肝组织H&E染色。左：C8+P4 组Fah^-/-小鼠肝组织，中：C8组Fah^-/-小鼠肝组织，右：C12组Fah^-/-小鼠肝组织。标尺长度20μm。

图2显示Fah^-/-小鼠给药前后及对照组的肝组织SA-β-GAL、p21和TUNEL 染色与统计分析。A：Fah^-/-小鼠给药前后及对照组的肝组织SA-β-GAL染色； B：Fah^-/-小鼠给药前后及对照组的肝组织p21免疫组化染色对比(标尺为50 μm)；C：不同给药方案下Fah^-/-小鼠的肝组织TUNEL染色对比；D：Fah^-/-小鼠给药前后及对照组的肝组织SA-β-GAL阳性率与p21阳性率及统计分析。 C8：慢性肝损伤8周，C12：慢性肝损伤12周，C8+P4：慢性肝损伤8周后Palbociclib(PD0332991)给药4周，C8+P8：慢性肝损伤8周后给药8周，C12+P4：慢性肝损伤12周后给药4周；*p<0.05,**p<0.01。

图3显示Fah^-/-小鼠给药前后及对照组的肝脏外观及不同给药时间后HCC 发生率变化。A：Fah^-/-小鼠给药前后及对照组的肝脏(大体观)；B：Fah^-/-小鼠给药前后、不同给药时间及对照组的HCC发生率；C：Fah^-/-小鼠给药前后肝脏肿瘤数量的统计；D：Fah^-/-小鼠给药前后肝脏肿瘤大小的统计。C8：慢性肝损伤8周，C12：慢性肝损伤12周，C8+P4：慢性肝损伤8周后Palbociclib (PD0332991)给药4周；*p<0.05，**p<0.01。

图4显示Fah^-/-小鼠给药前后及对照组的血清肝功能生化检测。ALT谷丙转氨酶、AST谷草转氨酶、ALB白蛋白，TBIL总胆红素；C8：慢性肝损伤8 周，C12：慢性肝损伤12周，C8+P4：慢性肝损伤8周后Palbociclib(PD0332991) 给药4周；*p<0.05。

图5显示慢性肝损伤Fah^-/-小鼠给药后细胞周期被抑制。A：RNA-Seq对 Fah^-/-小鼠给药前后肝脏样本细胞周期相关基因变化的分析；B：Fah^-/-小鼠给药前后肝脏样本细胞周期关键基因P-Rb、CyclinD1的WB验证；C-E：P-Rb、P16、 CyclinD1蛋白在Fah^-/-小鼠给药前后肝脏样本中的差异统计分析；*p<0.05。

图6显示慢性肝损伤下Palbociclib(PD0332991)选择性诱导脱离静息状态的肝细胞(癌前病变细胞)发生细胞衰老。A：MCM2和p21的连续切片染色。Fah^-/-小鼠慢性肝损伤8周后给药4周(C8+P4)的肝组织免疫组织化学染色(标尺为50μm)；B：慢性肝损伤Fah^-/-小鼠0、8、12以及8周后连续灌胃4周Palbociclib(PD0332991)的肝脏组织的癌前病变指标免疫组化染色(标尺为50μm)；C：Fah^-/-小鼠慢性肝损伤8周后给药4周(C8+P4)的肝组织 p21和Lin28A连续切片的免疫组织化学染色(标尺为50μm)；D-G：慢性肝损伤Fah^-/-小鼠0、8、12以及8周后连续灌胃4周Palbociclib(PD0332991) 的肝脏组织的癌前病变指标染色统计。分别用箭头或虚线显示MCM2与p21 以及LIN28A与p21的共染阳性细胞；*p<0.05,**p<0.01。

图7显示在体外实验中Palbociclib(PD0332991)可有效诱导癌前病变细胞衰老。A：慢性肝损伤8周后Fah^-/-小鼠分离的癌前病变肝细胞；B-G：体外癌前病变肝细胞的免疫荧光染色鉴定；H：CCK8检测癌前病变肝细胞体外体外培养加入Palbociclib(PD0332991)时细胞增殖的影响；I：加入2.5μM的 Palbociclib(PD0332991)对癌前病变肝细胞形态与增殖的影响；J：SA-β-Gal 染色鉴定Palbociclib(PD0332991)对癌前病变肝细胞的衰老诱导效果；*p< 0.05,**p<0.01。

图8显示Fah^-/-小鼠给药Palbociclib(PD0332991)后衰老相关分泌表型 SASP发生改变。A：RNA-Seq对Fah^-/-小鼠给药前后肝脏样本衰老相关分泌表型SASP相关基因变化的分析；B：相关差异表达的衰老相关表型因子的 Real-Time PCR验证；C：不同给药时间后肝组织连续切片F4/80与p21的IHC 染色。C8+P4：慢性肝损伤8周后Palbociclib(PD0332991)给药4周；C8+P8：慢性肝损伤8周后给药8周；箭头示p21和F4/80阳性细胞；*p<0.05,**p<0.01。

具体实施方式

现将详细描述本申请某些实施方案。当结合所列实施方案来描述本申请时，应理解的是，所述实施方案不是意在将本申请限于这些实施方案。本领域技术人员将认识到与本申请描述的方法和物质类似或等价的可用于实施本申请的多种方法和物质。本申请不限于所描述的方法和物质。

发明人发现CDK抑制剂，特别是CDK4/6抑制剂可以诱导癌前病变细胞衰老，从而诱导免疫系统清除衰老细胞。这样一方面可以治疗或缓解癌前病变相关疾病，另一方面可以降低由癌前病变细胞引起的癌症的发病风险或抑制癌症的发展，从而预防和治疗癌症。

本发明通过给予CDK抑制剂诱导对象的癌前病变细胞衰老，引发针对衰老细胞的免疫响应，从而预防或治疗对象的癌前病变或癌症。术语“癌症”或 “肿瘤”是指或用于描述哺乳动物中通常以细胞生长失调为特征的生理学状态。本发明的癌症包括已知的实体瘤和血液肿瘤，包括但不限于肝癌、黑素瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴白血病、慢性淋巴白血病、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸癌、软组织肉瘤、原发性巨球蛋白血症、膀胱癌、慢性粒细胞白血病、原发性脑癌、恶性黑素瘤、小细胞肺癌、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌性癌症、绒毛膜癌、蕈樣肉芽腫、头颈癌、骨原性肉瘤、胰腺癌、急性粒细胞白血病、毛细胞白血病、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、泌尿生殖系统肿瘤病、甲状腺癌、食管癌、恶性高钙血症、子宫颈增生症、肾细胞癌、子宫内膜癌、真性红细胞增多症、特发性血小板增多症、肾上腺皮质癌、皮肤癌和前列腺癌等。本文所述“癌前病变细胞”是指继续发展下去能癌变成癌细胞的某些病变的细胞，例如对象器官的癌和/或非癌组织的癌前病变细胞。通常，癌前病变细胞处于异常增殖状态。本文所述器官包括任何可具有癌前病变细胞的器官，例如甲状腺、胃、肝、肺、肠、肾、胰、膀胱、生殖器官。本文所述“癌前病变”包括任何类型的非典型增生。常见的癌前病变包括黏膜白斑、交界痣、慢性萎缩性胃炎、子宫颈慢性炎症、腺瘤性息肉、肝结节、肝损伤、肝细胞非典型增生、腺瘤样增生、肝硬化等。

本文所述“癌前病变肝细胞”或“肝脏癌前病变细胞”是肝脏的癌前病变细胞，包括肝细胞非典型增生肝细胞和/或腺瘤样增生肝细胞。癌前病变肝细胞是一种非G0期肝细胞。正常肝脏中，除了极少数肝细胞增殖以维持最低水平的肝细胞替换之外，肝细胞基本处于具有增殖能力但不增殖的静息状态，这一状态也可称为G0期，该状态的肝细胞不表达细胞周期与细胞增殖相关的标志物。处于这一状态的细胞称为“静息肝细胞”或“G0期肝细胞”。正常肝脏中存在少量“非G0期细胞”，即处在细胞周期中的细胞，在遭遇肝实质的损失或肝细胞的大量死亡后，如慢性肝损伤、肝癌、部分肝切除术后，部分处于 G0期肝细胞可以进入细胞周期，进行增殖以恢复肝实质和肝功能。非G0期肝细胞可以来自正常肝脏、慢性肝损伤的肝脏或癌前病变的肝脏。本发明发现， CDK4/6抑制剂特别是Palbociclib(PD0332991)或其结构类似物可以诱导肝脏癌前病变细胞的衰老，从而诱导免疫系统清除衰老的癌前病变细胞。优选地，本文所述肝脏癌前病变细胞是肝损伤或肝癌组织中的癌前病变细胞。这样一方面可以治疗或缓解肝脏的慢性肝损伤或癌前病变，例如病理性肝损伤、化学性肝损伤，肝脏非典型增生、肝纤维化、各种原因引起的肝硬化、肝细胞坏死；另一方面可以降低由癌前病变细胞引起的肝癌特别是肝细胞癌的发病风险或抑制其发展，从而预防和治疗肝癌。

本文所述“慢性肝损伤”分为病理性肝损伤和化学性肝损伤，包括肝炎病毒感染引起的慢性肝损伤、长期饮酒引起的酒精性肝损害、自身免疫性肝病、先天代谢遗传方面的肝病、药物性肝损伤等。示例性的慢性肝损伤症状包括肝纤维化、肝硬化、肝细胞坏死等。本发明的预防或治疗对象可以具有或不具有慢性肝损伤。例如，在一种示例性预防情况中，具有慢性肝损伤而没有肝癌的对象体内有大量癌前病变细胞，CDK抑制剂可以诱导这些细胞的衰老，从而引发免疫系统清除这些细胞，降低对象发生肝细胞癌的风险。在一种示例性治疗情况中，患有肝癌的对象体内也有大量癌前病变肝细胞，同样地，CDK抑制剂可以诱导这些细胞的衰老，从而引发免疫系统清除这些细胞，抑制对象肝细胞癌的发展。本文所述对象是哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、豚鼠、猴、犬、猫、马、牛、猪和羊，优选人。

术语“预防”是预防性或防止性处置；术语“治疗”是指治疗性处置。二者的目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或障碍例如癌症的生长、发展或扩散。就本申请目的而言，有益或期望的临床结果包括但不限于减轻症状、降低疾病程度、稳定疾病状态(即没有恶化)、延迟或减缓疾病进程、改善或缓和疾病状态及缓解(不论是部分还是全部)，不论是可检测到的还是不可检测到的。“治疗”还可指与在不接受治疗的情况下预期的存活相比使存活得以延长。需要治疗的那些人包括已患有病症或障碍的那些人及易患疾病或病症的那些人或有待预防疾病或病症的那些人。

本文所述的CDK即细胞周期蛋白依赖性激酶，包括CDK1-8，其中CDK3、 CDK4和CDK6调节细胞G1期和S期的进程。因此，本文所述CDK抑制剂优选CDK4和/或CDK6的抑制剂(CDK4/6抑制剂)。示例性的CDK4/6抑制剂是Palbociclib(PD0332991)、Ribociclib、Abemaciclib、Trilaciclib、SHR6390、 FLX-925，或其异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物。在示例性实施例中， CDK4/6抑制剂是Palbociclib(PD0332991)，即6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5- 哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮或其药学上可接受的盐，其结构式如式I所示。本文中，CDK抑制剂使癌前病变细胞衰老但不损伤器官功能。

本发明公开的化合物或其药学上可接受的盐可以包括一个或多个非对称中心，因此会存在对映异构体、非对映异构体以及其它可以被定义的立体异构体形式，根据立体化学可分为(R)-或(S)-、用于氨基酸的(D)-或(L)-。本发明意为包括所有这些可能的异构体，以及外消旋形式和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以通过手性合成子或手性试剂制备，或用通常的技术如使用手性柱的高效液相来分离制备。当本发明所述的化合物含有烯族双键或其它几何不对称中心时，除非另有说明，则其意为该化合物包括E和Z几何异构体。同样地，所有的互变异构体也包括在内。

在一些实施方案中，本发明的CDK抑制剂还包括Palbociclib的衍生物。与式I结构相比，该衍生物：(1)环戊基被替换成环丙基、环丁基或环己基，和/或(2)8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮上的甲基可被替换成C_2-4烷基，和/或(3) 具有一个或多个(例如1-3个)选自羟基、卤素、C_1-4烷基的取代基。例如， Palbociclib的哌嗪环可被1-3选自羟基、卤素、C_1-4烷基的取代基取代，取代可发生在4位的N上；优选地，取代可以是单烷基取代、二烷基取代或三烷基取代，如3,5-二C_1-4烷基取代或3,4,5-三C_1-4烷基。任选地或进一步地，Palbociclib的吡啶环也可被1-3个选自羟基、卤素、C_1-4烷基的取代基取代。任选地或进一步地，Palbociclib的环戊基或该位置上的环烷基可被1-3个选自羟基、卤素、 C_1-4烷基的取代基取代。

本文所述“药学上可接受的盐”包括酸式盐和碱式盐。

“药学上可接受的酸式盐”是指可保持游离碱的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。该类盐可由无机酸构成，例如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及类似的酸。该类盐还可由有机酸构成，例如但不限于乙酸、二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基磺酸、1,2-乙二磺酸、乙烷磺酸、羟乙基磺酸、蚁酸、延胡索酸(fiimaric acid)、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、羟基乙酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲烷磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、2-萘磺酸、1-萘酚-2-甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸及类似酸。

“药学上可接受的碱式盐”是指可保持游离酸的生物活性和性质的盐，该类盐不会出现不理想的生物活性或其它方面的变化。这些盐通过向游离酸中加入无机碱或有机碱制成。通过无机碱得到的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐及类似盐。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐以及镁盐。通过有机碱得到的盐包括但不限于一级、二级、三级铵盐，取代的胺包括天然取代的胺、环胺以及碱性离子交换树脂，例如氨气、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、N,N'-双苄基乙撑二胺、乙二胺、葡萄糖胺、甲葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、缓血酸胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚酰胺树脂以及类似结构。优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

在一个或多个实施方案中，药学上可接受的盐包括硝酸盐、磺酸盐、盐酸盐、羟乙基磺酸盐。在一个或多个实施方案中，CDK4/6抑制剂是Palbociclib (PD0332991)的盐酸盐和/或羟乙基磺酸盐。药学上可接受的盐可通过本领域可用的任何合适方法来制备。例如，用无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸等或有机酸例如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羟乙酸、水杨酸、吡喃糖基酸例如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸、α-羟基酸例如柠檬酸或酒石酸、氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸、芳族酸例如苯甲酸或肉桂酸、磺酸例如对甲苯磺酸或乙磺酸等对游离碱进行处理。

通常结晶会产生所公开化合物的溶剂化产物。当在本文中使用时，术语“溶剂合物”是指一种包含了一种或多种本文化合物分子与一种或多种溶剂分子的聚合物。溶剂可能是水，此时溶剂化物可能是水合物。可选地，溶剂还可能是有机溶剂。因此，本文化合物可以作为水合物存在，包括单水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物及类似结构，还可作为相应的溶剂化产物存在。本发明公开的化合物可以是真正的溶剂化物，而在其它情况下，本发明公开的化合物也可以是仅保有一部分水，或者是保有水与一些溶剂的混合物。

本文的CDK抑制剂可包含在药物组合物中，该药物组合物中还含有药学上可接受的辅料。本文中，“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体、稀释剂和/或赋形剂，包括但不限于：pH 调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。本领域知晓常用给药方式、剂型、剂量等时所需的辅料。

本发明包括CDK抑制剂或药物组合物在治疗或预防癌症例如肝癌中的用途。本发明还涉及治疗或预防癌症的方法。该方法包括向有需要的受试对象施用治疗有效量的本文所述的CDK抑制剂或药物组合物。本发明还涉及治疗或预防癌症的试剂盒，该试剂盒包含本文所述的CDK抑制剂或药物组合物。本发明还涉及本文所述的CDK抑制剂或药物组合物在制备用于治疗或预防癌症的试剂盒中的应用。

具体而言，“有效量”指的是对人或者动物能够产生治疗功能的，并且能够被动物和人所接受的注射量。例如，口服Palbociclib(PD0332991)胶囊的剂量可以是75mg/人/天、100mg/人/天、125mg/人/天或以上。

本发明中药物的给药方式可以包括但是并不限制于皮下注射、经皮注射、植入、局部给药、肌肉注射、缓释给药和口服等。本领域技术人员知晓在不同给药方式、剂量、给药部位等情况下将药物给予对象所需的其他试剂。例如敷料、溶剂(如水)等。

本发明还提供一种药物组合物或药盒，所述药物组合物或药盒含有CDK 抑制剂和其他的抗癌剂。所述CDK抑制剂任选如前文任一实施方案所述。所述其他的抗癌剂可以是本领域已知的用于癌症治疗的各种抗癌剂，包括但不限于顺铂、丝裂霉素C、博莱霉素、卡铂、喜树碱、伊立替康、托泊替康、阿霉素、甲基羟基玫瑰树碱、依托泊甙、5-氮杂胞苷、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、5-氟-2'-去氧尿苷、氟达拉滨、帕尼单抗、赫赛汀、美罗华、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、索拉非尼、舒尼替尼、尼罗替尼、达沙替尼、帕唑帕尼等。

还提供的是一种诱导癌前病变细胞衰老或治疗或预防本文所述的各种疾病的方法，所述方法包括给予需要的对象有效量的本文所述的CDK抑制剂或其药物组合物。还提供的是用于诱导癌前病变细胞衰老或治疗或预防前文所述的各种疾病的CDK抑制剂，尤其是本文所述的各种CDK抑制剂。

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

本发明的优点：

1、模拟了慢性肝损伤下诱导HCC的小鼠模型：已发表的研究大多使用体外细胞实验及裸鼠荷瘤实验，缺失了肝脏损伤背景、免疫系统和组织微环境改变等三种因素，选择更加理想的动物模型具有重要意义。酪氨酸是一种重要的非必需氨基酸，它是多种神经递质、激素、色素的前体。酪氨酸代谢的不同缺陷可以产生70多种不同疾病，如苯丙酮酸尿症、尿黑酸尿症、枫糖尿症。酪氨酸的分解代谢主要在肝脏进行，这一通路的缺陷会导致3种不同类型的高酪氨酸血症。其中，最为严重的是常染色体隐性遗传的遗传性Ⅰ型高酪氨酸血症 (HT-1)，由延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase,FAH) 缺陷引起。这一缺陷会导致酪氨酸代谢通路中最后一步中断，导致马来酰乙酰乙酸、延胡索酰乙酰乙酸以及其旁路代谢产物琥珀酰乙酰和琥珀酰丙酮蓄积，这些代谢产物直接损伤肝细胞，并间接损伤肾功能。HT-1常见临床表现包括肝功能异常直至肝衰竭，以及很高的肝癌发生率，约30％的患者早在3岁内发生肝癌。2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮，简称NTBC，是4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-Hydroxyphenylpyruvatedioxygenase，HPPD，又名α- 酮异己酸盐双加氧酶)特异抑制剂，可以在通路上游彻底阻断酪氨酸代谢，防止下游有毒代谢产物的生成，从而挽救患者，使得患者的表型恢复正常。1993 年，Grompe等人通过敲除FAH基因建立了FAH基因剔除小鼠(简称Fah^-/-小鼠)，是模拟遗传性I型酪氨酸血症(tyrosinemia type I,HT1)建立的小鼠模型。Fah^-/-小鼠发生的肝癌具有人HCC常见的突变类型，Fah^-/-小鼠肝癌中约80％基因组变异与人HCC一致，是模拟人HCC的理想模型(Endig J,et al.Cancer Cell 2016；30(2):308-323)。

2、在慢性肝损伤下非特异的诱导肝细胞衰老抑制了HCC的发生：利用 Fah^-/-小鼠模型，通过控制NTBC给药，可以简便的诱导小鼠急性或慢性肝损伤：完全停止NTBC给药会导致肝细胞内有毒代谢产物迅速蓄积，造成急性肝损伤；降低NTBC给药量(例如添加2.5％治疗剂量)会导致酪氨酸代谢不完全阻断，肝细胞内产生低水平的有毒代谢产物，造成慢性肝损伤，随着损伤积累导致肝癌发生。发明人前期工作发现，急性肝损伤的Fah^-/-小鼠肝细胞广泛发生衰老， HCC发生率低；慢性肝损伤下肝细胞不发生衰老，但12周后100％发生HCC。维持Fah^-/-小鼠持续8周的慢性肝损伤后，再诱导4周的急性肝损伤会导致肝细胞出现衰老，诱导免疫细胞清除衰老的肝细胞，最终显著抑制HCC的发生。

3、利用Palbociclib(PD0332991)选择性的诱导癌前病变肝细胞的衰老，抑制HCC的发生同时不损伤肝功能：诱导急性肝损伤对Fah^-/-小鼠的肝功能产生明显损伤，类似加重肝损伤诱导肝细胞衰老的方式并不适用于临床治疗。因此，考虑到后期临床应用的实现形式，以及人类慢性肝脏疾病的复杂性，这一诱导方式需要具有相当的可操作性和特异性，并且要考虑到与现有的治疗方式联合应用。现有诱导细胞衰老的方式主要为诱导DNA损伤、诱导活性自由基(reactive oxygen species，ROS)和抑制细胞周期等方式。其中，前两者主要以抗癌药物和辐照的形式实现，应用上风险极大且操作困难，抑制细胞周期成为相对安全的方法。

实施例

1.1实验材料

1.1.1小鼠

本实验采用了129S4背景的Fah^-/-小鼠，为确保实验前小鼠肝脏内没有衰老细胞，所有分组均采用8周龄小鼠。实验小鼠饲养于SPF动物房(specific pathogen free)。本实验涉及的小鼠，均严格遵循了实验动物管理的相关规定和伦理准则，实验动物的饲养和动物实验已申请伦理审查并获得所在研究机构伦理委员会的批准。

1.1.2耗材及试剂

L-乳酸钠60％溶液：购自国药集团化学试剂有限公司，货号为 XW08675612，沃凯试剂生产；

Palbociclib(PD-0332991)：购自美国LC laboratory，货号为P-7766；

Palbociclib(PD0332991)灌胃溶液：取80mL含18.75μg/L NTBC的无菌水和0.934g L-乳酸钠60％溶液，混匀后用浓盐酸调节pH＝4.0，然后加入 0.9g PD-0332991，充分溶解后，用含18.75μg/L NTBC的无菌水定容至100mL，分装冻存于-20℃，灌胃前解冻并冷藏避光保存；

抗体列表如下：

抗原	厂商	货号	稀释比	应用
					γ-H2AX(phosphor S139)	CST	9718T	1:250	IHC
p21	Proteintech	10355-1-AP	1:800	IHC
					p21	Abcam	ab188224	1:500	IHC
F4/80(D2S9R)	CST	70076T	1:400	IHC
					HGF	Abcam	ab83760	1:500	IHC
Goat anti-Rabbit IgG	Merck-Millipore	AP132P	1:800	IHC
					Lin28A	Abcam	ab155542	1:800	IHC

1.2实验过程

1.2.1动物实验

1.2.1.1小鼠饲养及给药方案

小鼠为129S4背景的Fah^-/-小鼠，SPF动物房饲养，昼夜节律为0800-2000，饲料为通用SPF大小鼠繁育饲料，饮水中添加治疗剂量(7.5mg/L)NTBC，小鼠自由饮水及取食；

为保证开始实验时肝脏内没有自然衰老的细胞，所有小鼠应在8周周龄、体重达标(雄鼠25g以上，雌鼠20g以上)时随机分入各组；

C8组：饮水改为添加2.5％治疗剂量(18.75μg/L)NTBC的无菌水，其他条件不变，每周称重记录一次，8周后处死，取血清和肝组织，共8只小鼠；

C12组：饮水改为添加2.5％治疗剂量NTBC的无菌水，其他条件不变，每周称重记录一次，12周后处死，取血清和肝组织，共8只小鼠；

C16组：饮水改为添加2.5％治疗剂量NTBC的无菌水，其他条件不变，每周称重记录一次，16周后处死，取血清和肝组织，共8只小鼠；

C8+P4组：饮水改为添加2.5％治疗剂量NTBC的无菌水，其他条件不变，每周称重记录一次，8周后开始每日称重以Palbociclib(PD0332991)灌胃，再 4周后处死，取血清和肝组织，共12只小鼠；

C8+P8组：饮水改为添加2.5％治疗剂量NTBC的无菌水，其他条件不变，每周称重记录一次，8周后开始每日称重以PD-0332991灌胃，再8周后处死，取血清和肝组织，共8只小鼠；

C12+P4组：饮水改为添加2.5％治疗剂量NTBC的无菌水，其他条件不变，每周称重记录一次，12周后开始每日称重以Palbociclib(PD0332991)灌胃，再4周后处死，取血清和肝组织，共6只小鼠；

1.2.1.2组织收集、处理及检测方法

眼眶后静脉窦收集Fah^-/-小鼠血液，冷藏过夜后离心，收集血清并-80℃冻存；脱颈处死小鼠后，以T形切口打开腹腔，将小鼠的肝脏整体摘出，除去胆囊、肝脏附着的血管及结缔组织，用生理盐水洗净并放入平皿中，拍照留存。随后迅速将肝脏切块，分别液氮冻存、4％PFA固定24小时、OCT冷冻包埋。对于C12+P4组的Fah^-/-小鼠，须分离若干HCC结节与癌旁组织，单独液氮冻存。

1.2.2细胞生物学实验

1.2.2.1免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)

(1)石蜡包埋与切片

固定：取一个15mL离心管，倒入20倍组织块体积的4％PFA，将现取的小鼠肝组织切成黄豆大小方块后放入，放入后轻轻摇动数次，使组织块充分分散，将离心管静置24h。然后倒出4％PFA，加入70％酒精清洗3遍后，加 70％酒精长期保存。

脱水：取若干包埋筐并用2B铅笔写明标本信息，从离心管中挑选形状合适的组织块放入包埋筐中，放入梯度酒精(酒精浓度依次为70％-80％-95％- 100％-100％)中进行脱水。

透明：将包埋筐从酒精中取出、沥干，依次放入3罐二甲苯中，各浸泡 15分钟，脱去组织块内的酒精。

浸蜡：将包埋筐从二甲苯中取出、沥干，依次放入3罐65℃石蜡中，各浸泡30分钟、30分钟和1小时，脱去组织块内的二甲苯。

包埋：将包埋筐从石蜡中夹出，取出组织放入模具中，注入石蜡，并盖上包埋筐筐底，初步冷却后放入4℃冷藏15分钟，再转入-20℃冷冻半小时，使模具与石蜡充分冷却。随后取出，在室温下剥除模具，修整蜡块，储存备用。

切片：打开摊片机和烘片机，各调至40℃，向摊片机中加自来水，将蜡块夹于切片机上，调整切片厚度(实验所用为2μm)，连续进行切片，切下的切片带应至少4片连续，不建议超过15片连续。将切片带轻轻放入摊片机水槽中，利用水的表面张力，将切片展平，然后用防脱载玻片轻轻捞出所需切片，在烘片机上放置过夜烤干水分。

烤片：将烘片机温度调至60℃，加热载玻片35分钟。

脱蜡：将载玻片放在不锈钢玻片架上，依次放入二甲苯①、二甲苯②和二甲苯酒精(1：1体积稀释)中，利用二甲苯与石蜡混溶脱去切片上的石蜡。

复水：将载玻片依次在梯度酒精中浸泡，脱去切片中的二甲苯，让水分逐渐浸入切片中。

(2)切片染色

从水中取出载玻片，甩去多余水滴，用免疫组化笔画圈各个组织切片，然后放回水中，按抗体需求决定是否进行修复；

修复：准备一个干净的修复盒，按抗体需要配制200mL抗原修复液(柠檬酸或EDTA修复液)，将载玻片放入后，放入高压锅内，按液体消毒模式用 125℃消毒5分钟。消毒完成后取出修复盒，静置降温至室温，也可以泡在冷水中降温。然后取出载玻片放入湿盒，用PBST清洗3遍，每遍间隔5分钟，洗尽切片上残留的修复液成分。

灭活：用移液枪向切片上滴加100μL过氧化氢消毒液，避光室温孵育15 分钟，然后用PBST清洗3遍，每遍间隔5分钟，洗尽切片上残留的过氧化氢消毒液成分。

封闭：用移液枪向切片上滴加50μL体积的5％BSA溶液，室温孵育30 分钟。可根据染色效果调整BSA溶液浓度、滴加体积和孵育时间。

一抗孵育：用5％BSA溶液稀释一抗为一抗稀释液，用吸引器吸去切片上的BSA溶液(不可清洗)后滴加50μL体积的一抗稀释液，用移液枪轻轻吹打数下，然后将湿盒放入4℃过夜。

二抗孵育：将湿盒从冷藏室取出，静置复温半小时，用5％BSA溶液稀释二抗为二抗稀释液。用吸引器吸去切片上的一抗稀释液，用PBST清洗3遍，每遍间隔5分钟，洗尽切片上游离的一抗，用吸引器吸去切片上的PBST后滴加50μL体积的二抗稀释液，用移液枪轻轻吹打数下，然后将湿盒放入37℃干燥恒温箱孵育30分钟。

显色：将湿盒从干燥恒温箱取出，静置复温半小时后用PBST清洗3遍，每遍间隔5分钟，洗尽切片上游离的二抗，准备半玻璃缸自来水用于终止显色。按每个载玻片100μL体积的量配制好DAB显色液，用吸引器吸去切片上的 PBST后滴加少量(充分浸泡切片即可)DAB显色液，待显色至合适程度后在玻璃缸中涮洗载玻片，终止DAB显色。显色合适程度需根据不同抗体进行摸索。

复染：将洗净的载玻片从自来水中取出，用力甩掉载玻片上的水滴，迅速用巴氏滴管滴加一滴苏木素染液，左右轻轻倾斜载玻片数次，使染液与切片充分接触后静置5到10分钟。复染时间和苏木素的选择依据最终效果进行调节，太浅则改用Mayer苏木素或延长复染时间。静置完成后，用流水冲洗载玻片5 到15分钟(不可直冲切片)。

脱水：50％酒精，1分钟--70％酒精，1分钟--80％酒精，1分钟--95％酒精，1分钟--100％酒精，2分钟--100％酒精，2分钟--二甲苯酒精，1分钟--二甲苯 ②，1分钟--二甲苯①，1分钟。

树胶封片：将载玻片从二甲苯中取出，用棉签木棍沾取两滴中性树胶，滴加在组织切片上，迅速轻柔的盖上盖玻片，避免盖玻片下出现气泡，在通风橱内晾干12小时后显微镜下观察，观察完成后收纳到切片盒中长期保存。

甘油封片：对于不需要长期保存的切片，可以在复染完成后，滴加PBS 稀释的30％甘油1滴，盖上盖玻片后直接观察，冷藏可保存一周。

(3)H&E染色

固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片、脱蜡和复水的过程与免疫组化的一致，复水完成后不需要修复，直接进行复染，复染的操作也与免疫组化的一致。后续步骤如下：

50％酒精，1分钟--70％酒精，1分钟--80％酒精，1分钟--95％酒精，1分钟--伊红染色--95％酒精清洗--100％酒精，2分钟--100％酒精，2分钟--二甲苯酒精，1分钟--二甲苯②，1分钟--二甲苯①，1分钟--树胶封片、显微镜观察、保存。

1.2.2.2衰老相关β半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-GAL)染色

OCT包埋：取塑料OCT包埋框一个，用记号笔写上样品编号，滴入一滴 OCT包埋剂备用。将现取的小鼠肝组织切成黄豆大小方块，用眼科镊子轻轻托起，放入包埋框内，稍稍调整组织位置后，再次滴加几滴OCT包埋剂直至浸没肝组织。将包埋框放入-20℃或-80℃冰箱中冷冻(不可直接放入液氮中降温)；

冰冻切片：打开冰冻切片机，预先降温至-20℃，在组织固定座上滴加一滴OCT，迅速将OCT包埋的组织块放上粘牢，等待2分钟。切片厚度为5μm，将切片吸附在载玻片上，迅速用免疫组化笔画圈。画圈后把载玻片放入湿盒内，用衰老相关β半乳糖苷酶染色试剂盒内的固定液固定5分钟，然后用PBS清洗 5遍，每遍间隔5分钟，充分洗去固定液成分。

SA-β-GAL染色：按说明书配制好染色液，用吸引器吸去PBS后用移液枪滴加50μL体积的染色液，湿盒放入干燥恒温箱内37℃孵育过夜。恒温箱要求无CO₂。

清洗：用PBS清洗5遍，每遍间隔5分钟，充分洗去染色液。

甘油封片：滴加PBS稀释的30％甘油1滴，盖上盖玻片后直接观察，冷藏可保存3天。

1.2.3统计分析

本实验所列统计数据均表示为平均数±标准差(mean±SD)，根据计量性数据是否符合正态分布或方差齐性，分别进行参数检验和非参数检验。所用软件为IBM SPSSStatistics 22，以p<0.05作为统计学显著差异的判断标准。

1.3实验结果

1.3.1 Palbociclib(PD0332991)给药诱导慢性肝损伤下部分肝细胞发生衰老

随机挑选8周龄的SPF级Fah^-/-小鼠，将其转入18.75μg/L NTBC(2.5％治疗剂量)喂养8周，以诱导慢性肝损伤。然后随机分为三组，分别对Fah^-/-小鼠Palbociclib(PD0332991)灌胃给药4周(命名为C8+P4组)或8周(命名为C8+P8组)。各组含义如下，C8：慢性肝损伤8周，C12：慢性肝损伤12 周，C8+P4：慢性肝损伤8周后Palbociclib(PD0332991)给药4周，C8+P8：慢性肝损伤8周后Palbociclib(PD0332991)给药8周，C12+P4：慢性肝损伤12周后Palbociclib(PD0332991)给药4周。具体方案：小鼠每日称重后，C8+P4 组和C8+P8组Palbociclib(PD0332991)按150mg/Kg剂量进行每日灌胃给药，而对照组不灌胃(命名为C12组)，但三组均持续保持慢性肝损伤的诱导，给药周期结束后处死全部小鼠，收取血清、肝组织和部分小鼠的小肠进行后续实验。

首先，我们用H&E染色观察了肝组织显微结构的变化：与C12组小鼠相比，C8+P4组Fah^-/-小鼠肝组织结构相似。表现为肝小叶结构正常，肝细胞的条索状结构清晰，未见显著的肝细胞多核化、肿胀、炎症坏死灶和脂肪变等病理变化。但C8+P4组小鼠的肝组织中，有一定比例的显著增大的肝细胞区块状分布。这种增大的肝细胞未见于C12组Fah^-/-小鼠的肝组织中(图1)。从前期实验和已有文献的结果看，细胞衰老的标志之一是细胞体积的肥大，肝细胞损伤后也会表现出细胞的“水肿”，单纯用H&E染色难以区分两种原因导致的类似表型，为此我们用免疫组化染色进一步进行了染色与鉴别。

对Fah^-/-小鼠肝组织的冰冻切片进行SA-β-Gal染色后，我们发现C8+P4 组Fah^-/-小鼠肝组织中SA-β-Gal阳性区域显著大于C12和C8组Fah^-/-小鼠(图 2，A)。免疫组化染色显示C8+P4组小鼠p21阳性的肝细胞核数量明显多于 C12和C8组Fah^-/-小鼠(20.07％vs 3.10％,20.07％vs 4.19％,p<0.05)。随后我们统计了p21核阳性占比与SA-β-GAL阳性面积占比，对二者进行t检验显示，Palbociclib(PD0332991)诱导肝细胞衰老的差异具有显著性(11.57％vs 0.67％,11.57％vs 0.61％,p<0.01，图2，D)。

通过连续切片并进行H&E和p21免疫组化染色，我们发现Fah^-/-小鼠肝组织内p21阳性细胞与H&E染色切片中增大的细胞定位相同，据此我们认为，肝细胞的衰老导致了肝细胞的增大结果(图2，B)。由于有文献表明Palbociclib (PD0332991)能诱导肝癌细胞系发生凋亡，我们对各组小鼠的肝组织进行了 TUNEL染色以判断肝细胞凋亡的情况，并用小肠作为阳性对照。结果显示，不同灌药方案处理后的Fah^-/-小鼠的肝组织均没有出现凋亡肝细胞(图2，C)。

1.3.2 Palbociclib(PD0332991)给药降低了慢性肝损伤下Fah^-/-小鼠HCC 发生率

C8+P4组Fah^-/-小鼠肝脏从整体上观察，颜色呈深红略偏棕色，整体颜色均一，表面光滑无破损或凹凸，触碰时易于弯曲、质地柔软，肝脏边缘锐利。肉眼直接观察下，有16.67％的Fah^-/-小鼠(2/12)肝脏发生如小米粒大小的HCC 结节(直径约2mm)，其他小鼠肝脏上无可见的结节(图3，A)。在前期实验中我们已经发现，慢性肝损伤12周后，肝组织中肉眼可见的HCC结节只占所有HCC病灶的一部分，H&E染色镜下观察可在不同的切面观察到HCC微型癌灶。C8+P4组Fah^-/-小鼠肝组织H&E染色结果显示，表面肉眼未见HCC 结节的肝组织，切片镜下检查也未见微型HCC癌灶，说明微型HCC灶点的存在可以排除，肉眼观察下的16.67％的HCC发生率为实际的HCC发生率。

同时，为了观察Palbociclib(PD0332991)长期应用下Fah^-/-小鼠的变化，我们延长给药到8周。C8+P8组Fah^-/-小鼠肝脏与C8+P4组的外观基本一致，也呈现出正常肝脏外观(大体照片未展示)。肉眼检查下HCC发生率为25％ (2/8)。同样经过H&E染色进一步检查后，也排除了肉眼不可见的微型HCC 癌灶的存在。发现相同慢性肝损伤诱导时长下的Fah^-/-小鼠(C12组与C16组) HCC发生率均为100％，而C8+P4组经给药Palbociclib(PD0332991)四周后， HCC发生率总体从100％下降至20％，肿瘤数量与肿瘤大小显著减少(图3， B-D)。

1.3.3 Palbociclib(PD0332991)给药不影响慢性肝损伤下Fah^-/-小鼠肝功能

相比于通过急性肝损伤诱导肝细胞衰老，用Palbociclib(PD0332991)诱导肝细胞衰老的预期优点之一，就是可以避免诱导急性肝损伤导致的肝功能损伤，从而减少对Fah^-/-小鼠的影响，降低死亡率。根据Palbociclib(PD0332991) 的已有文献及临床试验报告，这一小分子抑制剂安全性高，没有影响肝功能的副作用的报道。但是已有动物数据来自非肝损伤动物模型，人体数据不涉及肝损伤状态下的变化，没有关于肝病患者用药反应的报道。为了探索慢性肝损伤下PD-0332991对Fah^-/-小鼠肝功能的影响，我们收集了C8+P4组、C8组和C12 组Fah^-/-小鼠血清，分析了小鼠的肝功能状态。我们采用常用的血清生化检测中的肝功四项(谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST、白蛋白ALB和总胆红素 TBIL)作为小鼠肝功能的评价标准。AST和ALT为肝细胞损伤的指标，ALB 为肝细胞蛋白合成功能的指标，TBIL为肝细胞物质代谢功能的指标。血清生化分析结果显示，C8+P4组、C8组和C12组三组小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶和血清白蛋白均无显著差异(图4)，这一结果说明慢性肝损伤8周后 Palbociclib(PD0332991)给药4周对小鼠的肝功能没有产生影响。此外，C12 组相对C8组的总胆红素明显偏高，但给药四周的小鼠(C8+P4组)总胆红素相对C8并没有增加。前期的实验结果表明，慢性肝损伤8周和12周的Fah^-/-小鼠肝功能没有差异，即慢性肝损伤在HCC发生前与HCC早期不影响肝功能，结合前期实验的这一结论，我们认为Palbociclib(PD0332991)不影响Fah^-/-小鼠的肝功能。

1.3.4 Palbociclib(PD0332991)通过抑制细胞周期发挥抑癌作用

我们进一步分析了诱导细胞衰老抑制细胞周期的作用。分别取Fah^-/-小鼠慢性肝损伤下C12组、C8+P4组肝脏标本各3例，通过表达谱基因芯片分析发现C8+P4组中细胞周期信号通路及其相关基因表达显著被抑制(图 5，A)。在细胞增殖过程中，细胞周期素D(Cyclin D)与CDK4/6形成的复合物能够磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)。Rb的磷酸化可释放其在未被磷酸化的状态下紧密结合的转录因子E2F，E2F激活进一步转录推动细胞周期通过R点并从G1期进展到S期。已有文献报道CDK4/6抑制剂靶向抑制CDK4/6与ATP结合位点，从而抑制CDK4/6与CyclinD1形成复合物这一过程。通过切断上游生长信号阻止细胞G1期至S期的转换。利用 Western Blot对C12周、C8+P4周的肝脏样本进行验证分析发现，C8+P4 组小鼠的磷酸化Rb蛋白显著下降，细胞周期素蛋白CyclinD1表达下降， CDK4/6细胞周期信号通路受到抑制，衰老指标P16等表达显著上升(图5， B-E)。

1.3.5发生衰老的肝细胞是癌前病变的肝细胞

正常肝脏中，除了极少数肝细胞增殖以维持最低水平的肝细胞替换之外，肝细胞基本处于具有增殖能力但不增殖的状态，即处于G0期，这一状态的肝细胞不表达细胞周期与细胞增殖相关的标志物。在遭遇肝实质的损失或肝细胞的大量死亡后，如部分肝切除术后，部分处于G0期肝细胞可以进入细胞周期，进行增殖以恢复肝实质和肝功能。

在前期实验中，我们已经证实慢性肝损伤下绝大多数肝细胞处于G0期，少数脱离G0期的增殖肝细胞是原癌基因激活驱动的异常增殖。Palbociclib (PD0332991)特异性作用于CDK4/6，而CDK4/6在G0期细胞中不表达。据此我们可以推断，PD-0332991诱导衰老的肝细胞可能是处于癌前病变的肝细胞。为了验证这一推测，明确Palbociclib(PD0332991)给药后细胞衰老与细胞增殖之间是否存在关联，我们对Fah^-/-小鼠肝组织内增殖肝细胞与衰老的关联进行了分析。

经典的增殖细胞标志物Ki67存在于整个细胞周期，但在G1期表达量并不高，且一旦细胞脱离增殖状态就会消失，Palbociclib(PD0332991)将细胞阻滞在G1期，又能诱导细胞衰老，用Ki67做标志物可能会造成漏检。因此，我们选用了MCM2来识别增殖与非增殖的肝细胞，MCM2是DNA复制起始复合物的组成成分，入核组装在复制起始位点后发挥允许DNA复制的作用。MCM2 只在进入细胞周期的细胞核内组装，在整个细胞周期中都稳定存在于细胞核内，比Ki67更加适合检测Palbociclib(PD0332991)的作用模式。LIN28A在肝细胞的癌前病变阶段，介导了胞内IL-6通路的异常改变，是区别正常肝细胞和癌前病变肝细胞的标志物之一。结合MCM2与LIN28A，我们可以鉴别慢性肝损伤的肝组织内哪些肝细胞发生了癌前病变，且脱离了G0期，从而对 Palbociclib(PD0332991)产生了敏感性。

我们对慢性损伤0周(C0)、8周(C8)、12周(C12)及慢性损伤8 周后给予4周Palbociclib(C8+P4)的小鼠肝脏组织进行MCM2联合p21连续切片免疫组化染色，结果表明绝大多数MCM2阳性细胞均为p21阳性细胞。考虑到p21的变化在发生时间上先于细胞周期相关因子的活化，只有部分异常增殖的肝细胞能进展到MCM2核内组装，因此p21阳性率高于MCM2可以认为符合预期(图6，A)。这一结果说明，Palbociclib(PD0332991)选择性的诱导了肝脏中脱离G0期的肝细胞的衰老，对静息状态的肝细胞不产生细胞衰老的诱导作用，而慢性肝损伤下脱离G0期的肝细胞主要是进入异常增殖状态的癌前病变细胞。

我们继续用更多的癌前病变相关标志物全面检测慢性损伤0周、8周、12 周及慢性损伤8周后给予4周Palbociclib小鼠的肝脏组织样本的癌前病变状态，通过对AFP、Ki67、PCNA、p-STAT3、Lin28A等多标志物的免疫组化染色检测癌前病变肝细胞的发生。结果表明，肝脏癌前病变的指标AFP、Ki67、PCNA、 pSTAT3和Lin28A在慢性损伤Fah^-/-小鼠0周时呈阴性表达，而在8周时呈部分阳性表达，表明慢性损伤8周的小鼠开始出现癌前病变细胞，并随着慢性损伤的进程在慢性损伤12周时癌前病变细胞比例明显增多，而Palbociclib处理组的癌前病变程度得到了有效的抑制，癌前病变细胞比例显著减少(图6，B、 D-G)。Lin28A可有效作为癌前病变肝细胞的单指标，通过p21联合Lin28A 进行连续切片染色，我们发现部分Lin28A阳性细胞均为p21阳性细胞(图6， C)，再次验证Palbociclib可诱导癌前病变的肝细胞发生衰老。

进一步对Palbociclib可诱导癌前病变肝细胞发生衰老进行体外相关实验验证。利用酶解法我们从慢性损伤8周的Fah^-/-小鼠肝脏中分离癌前病变细胞。正常肝脏利用胶原酶灌注法获得原代肝细胞时细胞呈单个细胞悬液状态，非典型增生肝细胞是肝癌最常见的癌前病变形式，非典型增生肝细胞对胶原酶的耐受性高于正常肝组织，在同一肝脏中，当正常肝细胞基本分离后，非典型增生肝细胞依然呈现团块状(图7，A)。我们用此方法对慢性损伤条件下的肝脏进行灌注，将获得的肝细胞分别进行100μm和40μm滤网两次过滤。第二次过滤后留在滤网上层的肝细胞多数为癌前病变细胞。过滤分离后的癌前病变肝细胞在铺有胶原的F12 Advance培养基中继续培养，一般2小时后细胞贴壁展开，呈砖块状。

通过免疫荧光染色检测AFP、SOX9、CK19、CD44、Epcam和Alb等癌前病变细胞的标志物，我们发现癌前病变肝细胞(DH)表达AFP、SOX9、CK19、 CD44、Epcam等标志物，且阳性比例显著高于正常肝细胞(PH)(图7，B-F)。不加一抗的对照(Control)组的癌前病变细胞各项标志物呈阴性表达，大部分的癌前病变细胞(DH)和正常肝细胞(PH)的肝细胞指标Alb都呈阳性表达 (图7，G)。

对体外培养的癌前病变细胞及正常肝细胞进行Palbociclib衰老诱导处理4 天，通过CCK8细胞增殖检测实验，结果表明癌前病变细胞的增殖快于正常肝细胞，而加入Palbociclib后可有效抑制肝细胞增殖，对癌前病变细胞的抑制效果显著优于正常肝细胞(图7，H-I)。同时，Palbociclib处理后癌前病变细胞 (DH)衰老标志物SA-β-gal染色的比例显著增加(图7，J)。

通过以上研究，我们证明慢性损伤条件下Palbociclib通过有效诱导癌前病变细胞的衰老，进而抑制肝癌发生。

1.3.6诱导癌前病变肝细胞的衰老可激活免疫监控从而抑制肝癌发生

作为细胞内固有的重要抗肿瘤机制，细胞衰老可以阻断恶变细胞的增殖，使得恶变细胞无法形成赘生灶，并通过诱导免疫系统特异性识别与清除，将恶变细胞从组织中去除，最终达到抑制肿瘤的效果。现有研究表明，肝细胞发生细胞衰老后，会发生分泌表型上的变化，分泌多种SASP的因子，这些因子能激活免疫系统，介导免疫细胞对衰老的肝细胞进行清除。我们对慢性损伤12 周及8周后给药Palbociclib 4周的小鼠肝脏样本进行了RNA-Seq测序，发现给药组小鼠肝脏中多种衰老相关分泌表型因子发生变化，后利用荧光实时定量 PCR检测到趋化因子CCL2在给药组中变化最为显著(图8，A-B)。前期实验中我们发现，通过诱导急性肝损伤促使肝细胞发生衰老后，HCC的发生率显著下降。衰老的肝细胞分泌CCL2，招募血液中的单核细胞，浸润至衰老细胞旁，并成熟为巨噬细胞，巨噬细胞最终执行对衰老肝细胞的特异性免疫清除。在这一基础上，我们用巨噬细胞标志物F4/80对巨噬细胞的分布情况进行了分析。免疫组化结果显示，Palbociclib(PD0332991)给药后，C8+P4组Fah^-/-小鼠肝组织p21阳性细胞周围普遍分布有浸润的巨噬细胞(图8)。这一结果显示，Palbociclib(PD0332991)给药诱导的肝细胞衰老类似于急性肝损伤，都是由巨噬细胞执行的衰老细胞清除，再次证实了细胞衰老后通过免疫监控清除衰老细胞能降低HCC发生率。

Claims

1.CDK抑制剂在制备诱导对象的癌前病变细胞衰老的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途具有选自以下的一个或多个特征：

所述癌前病变细胞是对象器官的癌和/或非癌组织的癌前病变细胞；优选地，所述器官选自甲状腺、胃、肝、肺、肠、肾、胰、膀胱、生殖器官，更优选肝；

所述对象是哺乳动物，优选人。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述癌前病变细胞是肝损伤、肝细胞非典型增生、腺瘤样增生、肝硬化、肝结节或肝癌组织中的癌前病变细胞；优选地，所述癌前病变细胞是非典型增生肝细胞和/或腺瘤样增生肝细胞。

4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述CDK抑制剂是CDK4抑制剂和/或CDK6抑制剂；优选地，CDK抑制剂是Palbociclib、Ribociclib、Abemaciclib、Trilaciclib、SHR6390、FLX-925，或其异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物。

5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述CDK抑制剂是下式I化合物或其异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物或衍生物：

6.CDK抑制剂在制备预防或治疗对象的癌前病变或癌症的药物中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述癌前病变为黏膜白斑、交界痣、慢性萎缩性胃炎、子宫颈慢性炎症、腺瘤性息肉和肝脏癌前病变；

所述癌症是肝癌，优选肝细胞癌。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述癌前病变是肝脏癌前病变，优选慢性肝损伤、肝细胞非典型增生、腺瘤样增生、肝硬化或肝结节。

9.如权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述CDK抑制剂是CDK4抑制剂和/或CDK6抑制剂；

优选地，CDK抑制剂是Palbociclib、Ribociclib、Abemaciclib、Trilaciclib、SHR6390、FLX-925，或其异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物；

更优选地，所述CDK抑制剂是式I化合物或其异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物或其衍生物：

10.一种药物组合物或药盒，其特征在于，所述药物组合物或药盒含有CDK抑制剂和其他的抗癌剂；

优选地，所述CDK抑制剂是CDK4抑制剂和/或CDK6抑制剂，

更优选地，所述CDK抑制剂是Palbociclib、Ribociclib、Abemaciclib、Trilaciclib、SHR6390、FLX-925，或其异构体、药学上可接受的盐或溶剂合物，