CN113134012A - 一种CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物及其制备方法与应用。本发明提供了一种CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物，该复合物将OA包覆在CaO2/Fe3O4复合纳米粒子表面，提高CaO2在体内循环过程中的稳定性并降低其毒性。同时以具有pH敏感性的防水材料OA来提高CaO2的稳定性，克服了CaO2与水的高反应性，以简单、方便、快速的方式构建的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物，使CaO2/Fe3O4系统在体内循环时保持稳定而到达肿瘤部位后，在肿瘤弱酸性环境下释放药物并产生高水平的羟基自由基(∙OH)，从而有效杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。其制备方法简单，条件温和，成本较低。具有良好的临床转化前景。

Description

一种CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤是当今难以治愈，危害人类健康及生命的重要疾病。目前肿瘤的主要治疗方法包括手术切除，化疗，放疗，光动力治疗以及声动力治疗等等。除了手术治疗外，其它的治疗方法均通过产生高水平活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）杀死肿瘤细胞从而抑制肿瘤生长。然而，由于ROS是分子氧被单电子还原后生成的氧代谢产物，肿瘤的缺氧微环境在一定程度上却限制了高水平ROS的产生，使得这些治疗手段达不到最佳疗效。随着纳米材料的不断发展以及材料科学和生物学的不断融合，针对缺氧肿瘤的治疗，开发了ROS介导的新型肿瘤治疗方法-化学动力疗法（Chemodynamic therapy，CDT）。
CDT的原理为通过芬顿反应或类芬顿反应在肿瘤部位产生高活性的羟基自由基（·OH），从而有效杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。·OH作为一种毒性较强的活性氧，会对DNA，蛋白质和脂质造成不可逆的严重氧化损伤，最终诱导细胞凋亡。除了H2O2被亚铁（Fe2+）离子催化生成·OH的经典的芬顿反应外，研究发现其他金属离子，如Cu2+，Mn2+，Co3+，Ce3+，Ru3+，Ti3+等也可以催化芬顿反应。然而，肿瘤部位较低的H2O2浓度（小于100 μM）却限制了通过CDT产生高水平的·OH，从而降低了其治疗效果。过氧化钙（CaO2）作为H2O2的固态前体，其优良的抗菌性能近年来在生物医学领域得到了广泛的应用。但其在肿瘤治疗方面也是否也能表现优异的潜能还没有相关的研究报道，是否能将CaO2纳米粒和Fe3O4纳米粒相结合而产生一种高效的CDT治疗方案是需要进一步研究探讨的难题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物及其制备方法与应用。本发明中将超小粒径Fe3O4纳米粒与CaO2纳米粒相结合后在表面包覆OA，形成具有核壳结构的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物；将作为H2O2来源的CaO2和Fe2+来源的Fe3O4同时运输到肿瘤部位，通过芬顿反应原理在缺氧肿瘤环境中产生高水平的羟基自由基(∙OH)，从而有效杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长，为缺氧肿瘤的治疗提供了新的方法和思路。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物，所述的纳米复合物在CaO2/Fe3O4复合纳米粒子表面上包覆油胺（OA），所述的CaO2/Fe3O4复合纳米粒子中CaO2的粒径为115～175 nm，Fe3O4的粒径小于5 nm。
优选地，所述油胺是同时含有较长疏水链和氨基的顺式油基伯胺，因其具有一定的防水性和pH敏感性，在中性条件下能够防止CaO2跟水的反应从而提高纳米复合物的稳定性，而在弱酸性条件下它通过形成表面活性剂而溶解，释放CaO2/Fe3O4复合纳米粒子。
另一方面，本发明还提供了一种CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
（1）将无水氯化铁和柠檬酸酸钠在一定温度条件下搅拌，溶解于一缩二乙二醇中，加入无水乙酸钠溶解后将混合液转移到聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在高温条件下密闭反应，反应结束后自然冷却至室温，以磁铁吸附的方式用乙醇洗涤，将沉淀分散在去离子水中，得到Fe3O4纳米粒水溶液；
（2）CaCl2和PVP在超声条件下溶解于无水乙醇中，在磁力搅拌条件下加入氨水，分别加入步骤（1）制备的Fe3O4纳米粒水溶液和油胺；滴入H2O2后离心收集产物并用无水乙醇洗涤多次，得到CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物。
进一步地，步骤（1）中所述无水氯化铁、柠檬酸酸钠、一缩二乙二醇的用量比为0.648g：0.48g：40~50mL。
步骤（1）中所述无水氯化铁与无水乙酸钠的用量比为0.648g：1~1.2g。
步骤（1）中所述的一定温度为70～80 ℃。
步骤（1）中所述的高温条件下密闭反应的温度为200~220 ℃，时间为5~6 h。
步骤（2）中所述的CaCl2、 PVP、无水乙醇的用量比为0.12g：0.35g：10~15mL。
步骤（2）中所述的CaCl2与氨水的用量比为0.12g：1~1.5mL。
步骤（2）中所述的CaCl2、Fe3O4纳米粒水溶液、油胺的用量比为0.12g：100 ~120μL：150~160 μL。
步骤（2）中所述的H2O2的用量为滴入后得到具有乳光的浅蓝色溶液为止。
本发明还提供了上述的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物在制备治疗肿瘤药物中的用途。
进一步地，所述的肿瘤为实体瘤，尤其是存在缺氧微环境的实体瘤。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种基于芬顿反应的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物，该复合物将OA包覆在CaO2/Fe3O4复合纳米粒子表面，使具有协同治疗作用的CaO2和Fe3O4结合到同一个纳米复合物中。提高CaO2在体内循环过程中的稳定性并降低其毒性。同时以具有pH敏感性的防水材料OA来提高CaO2的稳定性，克服了CaO2与水的高反应性，以简单、方便、快速的方式构建的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物，使CaO2/Fe3O4系统在体内循环时保持稳定而到达肿瘤部位后，在肿瘤弱酸性环境下释放药物并产生高水平的羟基自由基(∙OH)，从而有效杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。该纳米复合物具有良好的胶体稳定性，生物相容性和肿瘤靶向性，没有明显的毒副作用，性质稳定，易于保存，并且其制备方法简单，条件温和，成本较低。具有良好的临床转化前景。
附图说明
图1是Fe3O4纳米粒和CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的透射电镜图；图中，a为Fe3O4纳米粒，b为CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物；
图2是制备得到的Fe3O4纳米粒和CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的粒径分布图；图中，a为Fe3O4纳米粒，b为CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物；
图3是CaO2/Fe3O4和CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的H2O2释放量结果对比图；图中，a是在中性条件下（pH=7.2~7.4）CaO2/Fe3O4和CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的H2O2产生量，b是在不同pH条件下CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的H2O2产生量；
图4是CaO2/Fe3O4和CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物产生·OH的荧光光谱对比图；图中，a为pH=7.4的中性条件下，b为pH=6.0的弱酸性条件下；
图5是制备得到的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的细胞药物摄取图；
图6是细胞毒性图对比图；
图7是细胞内·OH产生情况荧光对比图；
图8是静脉注射后在不同的时间点各组织/肿瘤Ca2+含量分析图；
图9是肿瘤治疗效果对比图：图中，a是治疗结束时所解剖的肿瘤组织；b是治疗过程中肿瘤体积变化趋势；c是肿瘤抑制率比较曲线；d是治疗过程中小鼠体重变化趋势。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的制备
称取0.648 g无水氯化铁（FeCl3，4 mmol）和0.48 g 柠檬酸酸钠（Na3Cit，1.6mmol）在70℃加热并搅拌的条件下完全溶解于40 mL一缩二乙二醇（DEG）中形成澄清溶液；然后再称取1.0 g无水乙酸钠（NaOAc，12.0 mmol ）溶解在上述澄清溶液中并将全部反应混合液转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在200 ℃条件下密闭反应6 h；反应结束之后，将其自然冷却至室温并通过磁铁吸附的方式用乙醇洗涤3次，得到粒径小于5 nm的Fe3O4纳米粒，将其分散在10 mL去离子水中进行保存。
在超声条件下将0.12 g CaCl2和0.35 g PVP溶解于15 mL无水乙醇中，在磁力搅拌条件下加入1 mL氨水(NH4OH，0.8 M)，再快速加入100 μL上述制备的Fe3O4纳米粒水溶液（5 mg/mL）和150 μL的油胺；用移液枪以0.05 mL/min的速度将100 μL H2O2（1 M）逐滴滴加到上述反应液中，得到具有乳光的浅蓝色溶液；通过离心的方式收集产物（12000 rpm，10min）并用无水乙醇洗涤3次，得到CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物，纳米复合物最终保存在5 mL无水乙醇中。
实施例2：CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的制备
称取0.648 g无水氯化铁（FeCl3，4 mmol）和0.48 g 柠檬酸酸钠（Na3Cit，1.6mmol）在80℃加热并搅拌的条件下完全溶解于50 mL一缩二乙二醇（DEG）中形成澄清溶液；然后再称取1.2 g无水乙酸钠（NaOAc，12.0 mmol ）溶解在上述澄清溶液中并将全部反应混合液转移到100 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在220 ℃条件下密闭反应5h；反应结束之后，将其自然冷却至室温并通过磁铁吸附的方式用乙醇洗涤3次，得到粒径小于5 nm的Fe3O4纳米粒，将其分散在去离子水中进行保存。
在超声条件下将0.12 g CaCl2和0.35 g PVP溶解于10 mL无水乙醇中，在磁力搅拌条件下加入1.5mL氨水(NH4OH，0.8 M)，再快速加入120 μL上述制备的Fe3O4纳米粒水溶液（5 mg/mL）和160 μL的油胺；用移液枪以0.05 mL/min的速度将H2O2（1 M）逐滴滴加到上述反应液中，直至得到具有乳光的浅蓝色溶液；通过离心的方式收集产物（12000 rpm，10min）并用无水乙醇洗涤3次，得到CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物，纳米复合物最终保存在5 mL无水乙醇中。
实施例3：CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的粒径表征
本实施例中对实施例1所制备的Fe3O4纳米粒、实施例2所制备的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的粒径形态进行分析。
分别将Fe3O4纳米粒溶液、CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物溶液滴于铜网上，在空气中干燥约10分钟后用滤纸吸去多余的液体，待样品干燥后置于透射电镜（TEM）下观察。图1是Fe3O4纳米粒和CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的透射电镜图。图中，a为Fe3O4纳米粒，b为CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物；由图1可见，制备得到的Fe3O4纳米粒形态呈球形，粒径均一并小于5nm； 制备的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物形态均比较规则，呈球形，粒径分布均一，可观察到外面包裹的油胺层。
分别将制备得到的Fe3O4纳米粒用去离子水稀释，CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物用无水乙醇稀释至较稀的浓度后，通过动态光散射粒径仪（DLS）检测粒径分布情况。图2是制备得到的Fe3O4纳米粒和CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的粒径分布图；图中，a为Fe3O4纳米粒，b为CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物；由图2可见，制备得到的Fe3O4纳米粒的粒径分布均一（PDI=0.160），平均水合粒径为21.4 nm；CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的粒径分布也较为均一（PDI=0.131），平均水合粒径为120.2 nm。
实施例4：对制备的OA的防水性和pH敏感性考察
本实施例中通过比较实施例1所制备的纳米复合物和未包裹OA的CaO2/Fe3O4所产生的H2O2量来考察OA的防水性, 并在三种不同的pH条件下产生的H2O2量来考察OA的pH敏感性，H2O2的产生量通过高锰酸钾（KMnO4）滴定法确定，具体方法如下：
各称取10 mg CaO2/Fe3O4和CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物分别分散在5 mL去离子水中并在磁力搅拌条件下反应2 h。将反应液离心，上清用酸性KMnO4（1 mM）进行滴定，当上清中出现浅粉色并30 s内不褪色时为滴定终点。最后通过所消耗的酸性KMnO4溶液的量来计算反应产生的H2O2量并两组进行比较，实验重复3次。
分别称取10 mg CaO2/Fe3O4@OA纳米粒三份并将它们分别分散在pH=5.0、pH=6.0和pH=7.4的缓冲溶液（5 mL）中，在磁力搅拌条件下反应2 h，然后将反应液离心，上清用酸性KMnO4（1 mM）进行滴定，当上清中出现浅粉色并30 s内不褪色时为滴定终点。最后通过所消耗的酸性KMnO4溶液的量来计算反应产生的H2O2量并三组进行比较，实验重复3次。图3是CaO2/Fe3O4和CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的H2O2释放量结果对比图；图中，a是在中性条件下（pH=7.2~7.4）CaO2/Fe3O4和CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的H2O2产生量，b是在不同pH条件下CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的H2O2产生量；由图3可见，在中性条件下CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的H2O2含量明显比未包裹的OA的CaO2/Fe3O4的低，两者具有显著的差异性。在中性环境中，CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物具有良好的防水性能。当pH越小时CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物所产生的H2O2含量越高，并且在pH=6.0和pH=7.4之间具有显著性差异，说明制备的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物具有较好的pH敏感特性。
进一步地，以香豆素-3-羧酸（3-CCA）作为荧光探针考察CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物及未未包裹OA的CaO2/Fe3O4在不同pH条件下产生·OH的情况。分别称取10 mg CaO2/Fe3O4和CaO2/Fe3O4@OA纳米粒各两份，将它们分别分散在pH=7.4和pH=6.0的缓冲液中并在各反应液中均加入0.15 mL香豆素-3-羧酸溶液（0.35 M），避光条件下搅拌反应12 h。然后将反应液进行离心，上清用荧光光谱仪扫描(λex=350 nm，λem=450 nm)并记录其荧光光谱。图4是CaO2/Fe3O4和CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物产生·OH的荧光光谱对比图；图中，a为pH=7.4的中性条件下，b为pH=6.0的弱酸性条件下。由图4可见，制备的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物在pH=6.0时所发出荧光比pH=7.4时的强，说明与中性条件相比，在弱酸性条件下CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物能够产生更多的·OH，进一步说明了包覆OA后CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物具有pH敏感特性。
实施例5：CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的体外细胞摄取情况
由于CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物本身不具有荧光性质，本实施例中通过异硫氰酸荧光素（FITC）对CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物进行荧光标记后考察其细胞行为。具体标记方法为：称取5 mg的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物分散于5 mL的FITC溶液（100 µg/mL，溶于乙醇）中，于室温避光条件下搅拌24小时，通过高速离心机（10000 rpm）离心10 min 收集沉淀，并用乙醇洗涤直至上清液无色，以除去未结合的FITC，最终得到CaO2/Fe3O4@OA-FITC复合物，分散于乙醇中备用。
以人体乳腺癌细胞MCF-7（购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所）为模型，观察CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物被肿瘤细胞摄取的情况。取处于对数生长期的MCF-7细胞，经胰蛋白酶消化后，接种至铺有盖玻片的6孔板内，每孔约5×104个细胞。在37℃，5% CO2条件下培养24 h待细胞贴壁后吸去培养液，加入1 mL含有上述制备的CaO2/Fe3O4@OA-FITC复合物（以FITC记10 µg/mL）的DMEM培养基后放入细胞培养箱，继续培养 0.5 h，1 h，2 h，4h，用溶酶体红色荧光（LysoRed）探针（1 µM/L，购自上海翌圣生物科技有限公司）染色30min，用无菌PBS轻缓洗涤后，再用Hoechst 33342（10 µg/mL，购自上海麦克林生化科技有限公司）染色15 min。然后，经无菌PBS轻缓洗涤后，采用 4% 多聚甲醛固定30 min，轻缓洗涤后取出盖玻片，滴加一滴50%的甘油并封片，最后于激光共聚焦显微镜下观察荧光强弱。图5是制备得到的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的细胞药物摄取图。由图5可见，细胞和纳米复合物共孵育1 h后，绿色荧光和红色荧光高度重合，说明CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物以溶酶体途径被细胞摄取。随着孵育时间的延长，绿色荧光（FITC）强度逐渐增强并在2 h后可观察到最强的荧光，可知其摄取方式呈时间依赖性。
实施例6：CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的细胞毒性作用
本实施例中采用MTT法，以Fe3O4组、CaO2组、CaO2/Fe3O4组最为对照考察不同pH条件下（pH=7.4和pH=6.0）CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物对人乳腺癌MCF-7细胞的毒性影响。取对数生长期MCF-7细胞经胰酶消化后，悬浮至DMEM培养液中，然后接种至96孔细胞板中，每孔5×103个细胞。待肿瘤细胞贴壁后，吸出原培养液，每孔加入100 µL含有不同浓度纳米粒的培养液，其浓度依次为0，20，50，100，200，500，1000 µg/mL。继续培养24 h后，吸去原培养液，用PBS轻缓洗涤3次。每孔加入100 µL MTT溶液（1 mg/mL），培养4 h后，去除MTT，每孔再加入200 µL DMSO溶液，振荡10 min。采用酶标仪在570 nm处测定每孔的吸光度，计算细胞存活率。每个浓度设置5个复孔，实验重复3次。每组以同样的条件同样的方法进行操作。图6是细胞毒性图对比图。由图6可见，在各浓度下CaO2/Fe3O4纳米粒均比其他纳米粒对细胞具有更大的毒性，而在各浓度下CaO2/Fe3O4@OA纳米粒在pH=6.0的条件下比pH=7.4产生了更大的毒性，尤其当浓度越高，pH=6.0的条件下的CaO2/Fe3O4@OA纳米粒细胞毒性越为明显，这些结果说明中性条件下的CaO2/Fe3O4@OA纳米粒可以限制减弱CaO2/Fe3O4纳米粒所产生的细胞毒性，且CaO2/Fe3O4@OA纳米粒具有一定的pH敏感性。
实施例7：CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物在细胞内产生·OH的情况
在本实施例中分别以空白培养基（Control）、Fe3O4(40 µg mL-1)、CaO2 (200 µgmL-1)、CaO2/Fe3O4 (200 µg mL-1)、CaO2/Fe3O4@OA (pH=7.4，200 µg mL-1) 和 CaO2/Fe3O4@OA(pH=6.0，200 µg mL-1)组考察CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物与细胞作用后在细胞内·OH的产生情况。取处于对数生长期的MCF-7细胞，经胰蛋白酶消化后，接种至铺有盖玻片的6孔板内，每孔约5×104个细胞。在37 ℃，5% CO2条件下培养24 h待细胞贴壁后吸去培养液，加入1 mL香豆素-3-甲酸（3-CCA）溶液（30 µM，用无血清培养基稀释）并跟细胞作用45 min。用无菌PBS轻缓洗涤后，加入含各组纳米粒的新鲜培养基并跟细胞共孵育2 h。之后，用无菌PBS轻缓洗涤，再用1 mL溶酶体绿色荧光探针（1 µM，LysoGreen）染色30 min。经无菌PBS轻缓洗涤后，再用4% 多聚甲醛固定30 min，轻缓洗涤后取出盖玻片，然后滴加一滴50%的甘油并封片，最后于激光共聚焦显微镜下观察并比较各组蓝色荧光强弱（λex=350，λem=450）。图7是细胞内·OH产生情况荧光对比图；如图7所示，CaO2/Fe3O4组和CaO2/Fe3O4@OA（pH=6.0）组均发出了比其他组更强的蓝色荧光，说明CaO2/Fe3O4纳米系统跟细胞作用后能够产生较高水平的·OH，用OA包裹CaO2/Fe3O4后形成的CaO2/Fe3O4@OA可以有效防止CaO2在体内循环过程中跟水反应，使其在体内循环过程中更加稳定。且也从侧面证明了OA的pH敏感性。
实施例8：CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的体内分布性质
在本实施例对CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的体内分布情况进行考察，确认该纳米复合物能否到达肿瘤部位并在肿瘤内富集，明确CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物是否有治疗作用。Ca元素是该纳米复合物中的主要元素之一，通过检测静脉注射后的不同时间点，各主要组织和肿瘤内Ca元素的含量来考察其体内分布性质，元素含量的测定应用ICP的方法。
（1）肿瘤模型的构建：取对数生长期的 S180 细胞（购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所），经胰蛋白酶消化后用无菌 PBS 制成细胞悬浮液，计数后，细胞悬浮液稀释至细胞浓度为 1×107个/mL。取 0.5 mL 上述细胞悬浮液，通过腹腔注射入 ICR 小鼠体内，待一周后腹水形成，抽出腹水，用无菌 PBS 稀释3倍混匀后，在ICR小鼠的右前肢腋窝处皮下接种100 µL细胞悬浮液。待1-2周后，完成 S180荷瘤小鼠模型的构建。
（2）选取肿瘤体积长至100 mm3左右的ICR小鼠15只（n=3），以50 mg/kg的剂量通过尾静脉注射CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物，同时设定空白组（Control），注射同剂量的生理盐水。然后，在预定时间点（4 h，8 h，12 h，24 h，48 h）将小鼠处死并剖出主要脏器（心，肝，脾，肺，肾）和肿瘤组织，用PBS洗涤干净后进行称重；之后，将各组织进行组织匀浆并用王水消解一周；加热使王水挥发干净，用超纯水稀释至一定浓度之后通过电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）测定各组织溶液中Ca元素的含量。图8是静脉注射后在不同的时间点各组织/肿瘤Ca2+含量分析图；如图8所示，与空白组相比，尾静脉注射CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物后，其在心、肝、肾等组织富集程度较小，在脾和肺组织中具有中等程度的聚集，而在肿瘤中的富集最为明显。一方面，随着时间的延长该纳米复合物缓慢地富集在肿瘤部位并在12h时达到最大值，即为空白组的2.86倍，说明该纳米复合物在肿瘤组织中的富集具有时间依赖性并且具有良好的肿瘤靶向性；另一方面，在注射24 h后其仍能在肿瘤组织中保持较高的浓度，即为空白组的2.30倍，说明该纳米复合物具有良好的肿瘤滞留能力。虽然CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物在心、肺，肾等组织中Ca2+含量较高，但其主要原因是这些组织中Ca2+基础值就比较高，而Ca2+增加的程度（富集程度）明显低于肿瘤组织，因此CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物具有良好的肿瘤靶向性，在其他组织中Ca2+含量的富集不会对其肿瘤靶向性产生明显影响。
实施例9：CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的肿瘤治疗效果
按照实施例8所述的方法构建肿瘤模型。当S180荷瘤小鼠的肿瘤大小接近100 mm3时，将小鼠随机分为5个组（n=4），分别为Saline（空白组）、Fe3O4 组、CaO2 组、CaO2/Fe3O4 组和CaO2/Fe3O4@OA 组。以静脉注射的方式隔天给药，即分别通过尾静脉注射200 µL生理盐水，Fe3O4 组（10 mg kg-1），CaO2组（50 mg kg-1），CaO2/Fe3O4 组（50 mg kg-1），CaO2/Fe3O4@OA组（50 mg kg-1）。给药过程中每2天记录一次小鼠体重和肿瘤大小（肿瘤体积V=（长径×短径2）/2）。经过14天后，将小鼠处死，收集瘤组织，记录其重量并计算肿瘤抑制率。图9是肿瘤治疗效果对比图：图中，a是治疗结束时所解剖的肿瘤组织；b是治疗过程中肿瘤体积变化趋势；c是肿瘤抑制率比较曲线；d是治疗过程中小鼠体重变化趋势。如图9所示，CaO2/Fe3O4@OA组中肿瘤增长明显比其他组缓慢，其肿瘤抑制率达到了80%，明显高于其他组；说明CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物能够显著抑制肿瘤生长；同时各组小鼠体重正常增长，与其他组相比未发现CaO2/Fe3O4@OA组对小鼠体重产生明显影响，说明CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物具有良好的生物相容性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

Claims (10)

1.一种CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物，其特征在于，所述的纳米复合物在CaO2/Fe3O4复合纳米粒子表面上包覆油胺，所述的CaO2/Fe3O4复合纳米粒子中CaO2的粒径为115～175 nm，Fe3O4的粒径小于5 nm。
2.一种CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）将无水氯化铁和柠檬酸酸钠在一定温度条件下搅拌，溶解于一缩二乙二醇中，加入无水乙酸钠溶解后将混合液转移到聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在高温条件下密闭反应，反应结束后自然冷却至室温，以磁铁吸附的方式用乙醇洗涤，将沉淀分散在去离子水中，得到Fe3O4纳米粒水溶液；
（2）CaCl2和PVP在超声条件下溶解于无水乙醇中，在磁力搅拌条件下加入氨水，分别加入步骤（1）制备的Fe3O4纳米粒水溶液和油胺；滴入H2O2后离心收集产物并用无水乙醇洗涤多次，得到CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述无水氯化铁、柠檬酸酸钠、一缩二乙二醇的用量比为0.648g：0.48g：40~50mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述无水氯化铁与无水乙酸钠的用量比为0.648g：1~1.2g。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的一定温度为70～80℃；所述的高温条件下密闭反应的温度为200~220 ℃，时间为5~6 h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的CaCl2、 PVP、无水乙醇的用量比为0.12g：0.35g：10~15mL。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的CaCl2与氨水的用量比为0.12g：1~1.5mL。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的CaCl2、Fe3O4纳米粒水溶液、油胺的用量比为0.12g：100 ~120μL ：150~160 μL。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的H2O2的用量为滴入后得到具有乳光的浅蓝色溶液为止。
10.权利要求1所述的CaO2/Fe3O4@OA纳米复合物在制备治疗肿瘤药物中的用途。
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