CN113087661A - 一种2’，6’-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了如式I所示的2^，，6^，‑双吡啶取代大麻二酚醚类化合物及其制备方法和用途，其是一种新的化合物，通过合成获得，且通过细胞实验发现，该化合物具有较好的抗肿瘤细胞增殖活性，尤其在肺癌细胞中，抑制肿瘤细胞增殖效果明显。且通过本发明方法得到的该化合物纯度高，稳定性好，且具备良好的生物活性。并且同吉西他滨联合使用时，抑制肿瘤细胞增殖效果更加明显。

Description

一种2’，6’-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物及其制备方法和 用途

技术领域

本发明涉及一类药物化合物，具体涉及一种2’，6’-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物及其制备方法和用途。

背景技术

不同的生活习惯和环境因素等原因导致癌症的发生率逐渐升高，成为人类中最严重的疾病之一。单药化疗法作为临床上常用的肿瘤治疗手段目前已经不能达到杀死肿瘤细胞的目的。为了达到治疗效果，联合用药已成为化疗中最常用的方法，同时联合用药治疗还能产生最佳组合剂量使副作用最小化。

吉西他滨(Gemcitabine)是一种嘧啶核苷类似物，其主要代谢物在细胞内掺入DNA，主要作用于G1/S期。常用于局部晚期(Ⅲ期)和已经有转移(Ⅳ期)的非小细胞肺癌作为一线应用或晚期胰腺癌患者在氟尿嘧啶类失败后作为二线用药。但大量的临床医学显示吉西他滨也存在一些副作用：主要体现为骨髓抑制、血小板减少、白细胞下降等现象，甚至有些患者的消化系统也会产生副作用，如腹泻、口腔炎等，引起发烧、发热、头痛、食欲不振等等现象。甚至对于少数患者的肝肾功能也有一定的影响，对其过敏的患者还会出现皮疹、呼吸困难等副作用。

大麻二酚类是植物中一类非常重要的次级代谢产物,作为原料广泛应用于药品、食品和化妆品中,具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗疟、促进透皮吸收等活性，具有广阔的开发与应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过合成而得的具有抑制肿瘤细胞活性作用的化合物。

本发明的另一个目的是提供制备该类化合物的方法。

本发明的再一个目的是提供该化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的再一个目的是提供该化合物和吉西他滨联用在制备抗肿瘤药物上的用途。

有鉴于此，本发明的目的之一是获得了一类化合物，该类化合物可用以制备抗肿瘤药物，该化合物通过合成获得。

本发明为实现其目的采用的技术方案是：

如式I所示的2’，6’-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物或其立体异构体或其前药或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；

其中，R¹、R²分别独立选自：

1)氢、羟基、卤素；

2)任选被取代的C1-C6烷氧基酰基、羟基酰基、酰卤基、任选被取代的 C6-C10芳醚基酰基、任选被取代的杂芳醚基酰基，其取代基选自：卤素原子、氨基、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6含氟烷基；

3)酰氨基或一个或两个氮上任选被取代的氨基酰基，取代基选自C1-C6 烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6含氟烷基、C3-C7环烷基；

4)芳氨基酰基或杂芳氨基酰基，其中的芳基或杂芳基任选地被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C3含氟烷基、C3-C6环烷基、卤素、氨基、羟基、任选被取代的杂环基取代。

作为本发明的优选方案，R¹选自:

R²优选自：-H,-COOMe。

除非特殊说明，上述基团和取代基具有药物化学领域的普通含义。

需要说明的是，C1-C6含氧烷基是指C1-C6烷基骨架被一个或多个C1-C6 烷氧基取代所成的基团，例如甲氧基乙基，甲氧基乙氧基甲基等。

术语"芳基"是指C6-10的单-、二-或多-碳环烃，其具有任选地进一步通过单键彼此稠合或连接的1至2个环系统，其中所述碳环中至少一个是“芳族的”，其中术语“芳族的”是指完全共轭的π-电子键系统。芳基环可以任选地进一步稠合或连接于芳族的和非芳族的碳环和杂环的环。所述芳基的非限制性的实例是苯基、α-或β-萘基。

术语"杂芳基"是指芳族的杂环，通常为具有1至3个选自N、O或S的杂原子的5-至8-元的杂环；杂芳基环可以任选地进一步稠合或连接于芳族和非芳族的碳环和杂环。所述杂芳基的非限制性的实例为例，如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噻噁唑基、吡咯基、苯基-吡咯基、呋喃基、苯基-呋喃基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、噻吩基、苯并噻吩基、异二氢吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、1,2,3- 三唑基、1-苯基-1,2,3-三唑基、2,3-二氢吲哚基、2,3-二氢苯并呋喃基、2,3- 二氢苯并噻吩基、苯并吡喃基、2,3-二氢苯并噁嗪基、2,3-二氢喹喔啉基等。

术语“杂环基”(也称作“杂环烷基”)指的是3-、4-、5-、6-和7-元饱和或部分不饱和碳环，其中一个或多个碳原子被杂原子例如氮、氧和硫替代。杂环基的非限制性实例是，例如吡喃、吡咯烷、吡咯啉、咪唑啉、咪唑烷、吡唑烷、吡唑啉、噻唑啉、噻唑烷、二氢呋喃、四氢呋喃、1,3-二氧戊环、哌啶、哌嗪、吗啉、吗啡啉基、四氢吡咯基、硫吗啉基等。

术语“任选被取代的杂环基”指的是上述“杂环基”被一个或多个“C1-C6 烷基”、“C1-C3烷基”、“C3-C6环烷基”等取代。

术语“C1-C6烷基”指的是任意的含有1－6个碳原子的直链或支链基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、叔戊基、正己基等。

本发明的目的是由以下技术方案进一步达到的，上述通式为I的化合物与一定物质的量的酸(如等物质的量)成药学上可接受的盐，其中所述药学上可接受的盐为无机酸盐或有机酸盐，其中，所述无机酸盐为盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐或磷酸盐，所述有机酸盐为甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐；优选地，所述烷基磺酸盐为甲基磺酸盐或乙基磺酸盐；所述芳基磺酸盐为苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。

本发明的目的是由以下技术方案进一步达到的，本发明提供一种制备通式为I的化合物及其盐的方法，其特点是包括如下步骤：

玻璃反应瓶，加入底物CBD、氯代物、溶剂DMF，混合均匀后除氧，加入 Cs₂CO₃，然后将反应瓶置于100℃油浴中至反应完毕；置于冰水浴中，往体系加入1N HCl调pH至3～5,乙醚分液萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗以及无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经反相制备得目标化合物。反应路线如下所示：

其中R¹、R²如前面所定义。

为了更好的实现本发明，上柱层析洗脱体系为正己烷：乙酸乙酯＝2：1 等梯度洗脱；反相制备洗脱体系为乙腈：水＝4：1等梯度洗脱。

本发明还提供了式I所示化合物在制备抗肿瘤药物上的用途。

为了更好的实现本发明，所述肿瘤为肺癌。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包括活性成分和药学上可接受的辅料，所述活性成分包括式I所示化合物。

为了更好的实现本发明，所述抗肿瘤药物包括但不限于肿瘤细胞增殖抑制剂。

本发明还提供了式I所示化合物和吉西他滨联用在制备抗肿瘤药物上的用途。即一种含有吉西他滨的抗肿瘤药物组合，同时给药作用于肺癌细胞时，吉西他滨和酚萜类化合物式Ⅰ之间的质量浓度比为0.083：1至0.25：1。

本发明的有益效果是：本发明提供了如式I所示的2’，6’-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物，其是一种新的化合物，通过合成获得，且通过细胞实验发现，该化合物具有较好的抗肿瘤细胞增殖活性，尤其在肺癌细胞中，抑制肿瘤细胞增殖效果明显。且通过本发明方法得到的该化合物纯度高，稳定性好，且具备良好的生物活性。并且同吉西他滨联合使用时，抑制肿瘤细胞增殖效果更加明显。

附图说明

图1显示为式I-4所示化合物同吉西他滨联用对A549存活率的影响(CCK8 法)；

图2显示为式I-4所示化合物同吉西他滨联用对A549存活率的影响(CCK8 法)；

图3显示为式I-4所示化合物同吉西他滨联用对A549迁移的影响；

图4显示为式I-4所示化合物同吉西他滨联用对A549克隆形成的影响；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

具体实施例化合物汇总表(Table 1)：

合成实验部分

就如下涉及的实施例而言，使用本文所述的方法或本领域众所周知的其它方法合成本发明的化合物。

通用纯化和分析方法：

在硅胶GF254预涂覆板(merck)上进行薄层色谱。在中压下经硅胶 (300-400目，Greagent)进行柱色谱分离。成分通过UV光(254nm)和通过碘蒸气、碱性KMnO₄溶液(KMnO₄：K₂CO₃：NaOH：H₂O＝1.5g：10g：0.125g： 200ml)磷钼酸溶液(10g磷钼酸+200ml乙醇)显影。必要时，将化合物通过 HPLC纳谱分析(Chromcore 8-120C18,8um,10×250mm)柱纯化，流动相为乙腈/H₂O(70％～100％),流速：10ml/min。

将1H-NMR谱在400MHz操作的Bruker Avance 400谱仪(对于1H而言) 进行记录。将四甲基硅烷信号用作参比。化学位移以百万分率(ppm)进行报道且偶合常数(J)以Hz计。以下缩写用于峰裂分:s＝单；br.s.＝宽信号；d＝双； t＝三；m＝多重；dd＝双双。

电喷雾(ESI)质谱经Finnigan LCQ离子阱获得。

试剂纯化参考Purification of Laboratory Chemicals(Perrin,D.D.,Armarego, W.L.F.and Perrins Eds,D.R.；Pergamon Press:Oxford,1980)一书进行。石油醚是60-90℃馏分、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷均为分析纯。

实施例1：

化合物I-1合成步骤如下：

取10mL反应瓶，依次加入CBD(100mg，0.32mmol)、氯代物(108.6mg， 0.64mmol)，溶剂DMF(1mL)，混合均匀后除氧，加入Cs₂CO₃(207.2mg， 0.64mmol),置于100℃油浴中，反应24h，TLC检测反应完毕，冷却至室温，置于冰水浴中，往体系加入1N HCl调pH至3～5,乙醚分液萃取，合并有机相，饱和碳酸氢钠洗一次，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析分离(200～300目硅胶；正己烷：乙酸乙酯＝2：1)得到粗品，在用(300～400 目硅胶；正己烷：丙酮＝2：1)得目标化合物(15mg，产率6.7％)。¹H NMR (400MHz,CDCl₃)δ7.78(s,4H),6.77(s,2H),4.89(s,1H),4.46(s,2H),4.02(s, 12H),3.68(d,J＝9.5Hz,1H),2.83–2.72(m,1H),2.67–2.54(m,2H),1.95–

1.74(m,2H),1.71–1.60(m,2H),1.58–1.45(m,2H),1.31(s,3H),1.30–1.24 (m,4H),1.03(s,3H),0.86(t,J＝6.8Hz,3H).MS(ESI)m/z:701[M+H]⁺.

实施例2：

化合物I-2合成步骤参考实施例1，得目标化物I-2(16mg，产率5％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.60(d,J＝5.6Hz,2H),7.63(s,2H),6.92(d,J＝ 3.3Hz,2H),6.72(s,2H),5.37–5.28(m,2H),4.90(s,1H),4.50(s,1H),4.47(s, 1H),3.67(d,J＝8.9Hz,1H),2.81–2.69(m,1H),2.55(t,J＝7.6Hz,2H),2.00– 1.77(m,2H),1.73–1.47(m,4H),1.57(s,3H),1.42(d,J＝6.2Hz,12H),1.34– 1.21(m,4H),1.13(s,3H),0.86(t,J＝6.8Hz,3H).MS(ESI)m/z:641[M+H]⁺.

实施例3：

化合物I-3合成步骤参考实施例1，得目标化物I-3(11.4mg，5.3％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.59(d,J＝5.6Hz,2H),7.63(s,2H),6.93(d,J＝3.3 Hz,2H),6.73(s,2H),4.89(s,1H),4.49(s,1H),4.47(s,1H),4.41(t,J＝6.9Hz, 4H),3.68(d,J＝10.4Hz,1H),2.82–2.71(m,1H),2.55(t,J＝7.6Hz,2H),1.98– 1.74(m,6H),1.71–1.59(m,2H),1.57–1.51(m,2H),1.50-1.43(m,4H),1.42(s, 3H),1.34–1.26(m,4H),1.12(s,3H),0.97(t,J＝7.4Hz,6H),0.87(t,J＝6.8Hz, 3H).MS(ESI)m/z:669[M+H]⁺.

实施例4：

化合物I-4合成步骤参考实施例1，得目标化物I-4(52mg，产率30％)。¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.42(d,J＝5.8Hz,2H),8.34(brs,2H),7.79(s, 2H),7.04–6.94(m,2H),6.74(s,2H),4.86(s,1H),4.51(s,1H),4.47(s,1H),3.70 –3.58(m,1H),3.05(s,3H),3.03(s,3H),2.80–2.69(m,1H),2.59–2.51(m,2H), 1.95–1.75(m,2H),1.75–1.63(m,2H),1.62–1.50(m,2H),1.45(s,3H),1.34– 1.22(m,4H),1.07(s,3H),0.87(t,J＝6.8Hz,3H).MS(ESI)m/z:583[M+H]⁺.

实施例5：

化合物I-5合成步骤参考实施例1，得目标化物I-5(41.6mg，产率20％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.38(d,J＝5.6Hz,2H),8.04(t,J＝5.9Hz, 2H),7.72(s,2H),6.88(dd,J＝5.6,2.5Hz,2H),6.71(s,2H),4.88(s,1H),4.52(s, 1H),4.47(s,1H),3.64(d,J＝10.5Hz,1H),3.46(q,J＝6.9Hz,4H),2.83–2.71 (m,1H),2.53(t,J＝7.6Hz,2H),1.99–1.86(m,1H),1.84–1.73(m,1H),1.68– 1.60(m,4H),1.58–1.50(m,4H),1.47(s,3H),1.44–1.36(m,4H),1.32–1.25 (m,4H),1.08(s,3H),0.96(t,J＝7.3Hz,6H),0.86(t,J＝6.8Hz,3H).MS(ESI) m/z:667[M+H]⁺.

实施例6：

化合物I-6合成步骤参考实施例1，得目标化物I-6(51mg，产率22％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.41(d,J＝5.7Hz,2H),6.97(s,2H),6.79–6.68 (m,4H),4.89(s,1H),4.50(s,1H),4.46(s,1H),3.91–3.77(m,2H),3.68(d,J＝ 9.0Hz,1H),3.59–3.45(m,2H),2.84–2.72(m,1H),2.53(t,J＝7.6Hz,2H), 2.02–1.77(m,2H),1.72–1.61(m,4H),1.60(s,3H),1.55(d,J＝6.6Hz,12H), 1.48(s,3H),1.34–1.23(m,4H),1.17(d,J＝5.9Hz,12H),0.87(t,J＝6.9Hz, 3H).MS(ESI)m/z:723[M+H]⁺.

实施例7：

化合物I-7合成步骤参考实施例1，得目标化物I-7(73mg,31％)。¹H NMR (400MHz,CDCl₃)δ8.43–8.31(m,4H),7.76(s,2H),7.43–7.25(m,10H),6.89 (dd,J＝5.6,2.5Hz,2H),6.72(s,2H),4.90(s,1H),4.66(d,J＝6.1Hz,4H),4.53 (s,1H),4.48(s,1H),3.65(d,J＝8.9Hz,1H),2.82–2.71(m,1H),2.54(t,J＝7.6 Hz,2H),2.01–1.87(m,1H),1.86–1.75(m,1H),1.71–1.64(m,1H),1.60– 1.51(m,3H),1.47(s,3H),1.35–1.22(m,4H),1.10(s,3H),0.87(t,J＝6.8Hz, 3H).MS(ESI)m/z:735[M+H]⁺.

实施例8：

测定2，6，-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物抗肿瘤细胞增殖活性的影响：

(1)CKK8比色法检测各化合物对肿瘤细胞存活性能的影响

取对数生长期人肺癌细胞(A549)，用DMEM培养液配制适宜浓度细胞悬液，细胞密度约70000个/mL(即每100μL培养液中约含7000个细胞)，以每孔100μL细胞悬液将细胞接种于96孔板，37℃培养箱中培养至细胞贴壁。以DMSO为溶剂分别配制浓度20mg/mL的式I-1～I-7所示化合物溶液和顺铂、吉西他滨化合物溶液，实验时用培养液稀释至所需工作浓度。96孔板弃培养液后，实验组分别加入工作浓度为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μ g/mL、40μg/mL的待测化合物溶液100μL，空白对照组加入培养液100μL，阳性对照组加入同样浓度的抗肿瘤药物顺铂(DDP)、吉西他滨溶液100μL，将96孔板放置培养箱中24h后用CCK8试剂检测细胞存活率，96孔板继续放置培养箱中48h后用MTT试剂检测细胞存活率，实验重复3次取平均值。通过GraphPad Prism软件绘制剂量抑制曲线，并计算出化合物对两株肿瘤细胞的IC₅₀值，结果如表1所示。

表1.化合物I-1～I-7对肺癌细胞A549增殖IC₅₀

联合用药抗肿瘤细胞增殖活性的测定方法：

(1)CKK8比色法检测联合用药对肿瘤细胞存活性能的影响

取对数生长期人肺癌细胞(A549)，用DMEM培养液配制适宜浓度细胞悬液，细胞密度约50000个/mL(即每100μL培养液中约含5000个细胞)，以每孔100μL细胞悬液将细胞接种于96孔板，37℃培养箱中培养至细胞贴壁。以DMSO为溶剂分别配制浓度20mg/mL的式I-1～I-7所示化合物溶液和吉西他滨化合物溶液，实验时用培养液稀释至所需工作浓度。本实验检测中联合用药的药物浓度设置是以组合中单个药物IC₅₀的比值为参照，按比值对两个药物进行固定浓度比的联合用药，实验组中除空白对照组外，各有五组联药浓度，同时设置相应浓度的单药作为对照。96孔板弃培养液后，单药组分别加入工作浓度为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL 的吉西他滨溶液100μL；另一单药组加入工作浓度为2.5μg/mL、5μg/mL、 10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL的式I-1～I-7所示化合物溶液100μL，联药组含吉西他滨和式I-1～I-7所示化合物溶液100μL，联药的工作浓度为 (0.625μg/mL+2.5μg/mL)、(1.25μg/mL+5μg/mL)(2.5μg/mL+10μg/mL)、 (5μg/mL+20μg/mL)、(10μg/mL+30μg/mL)；将96孔板继续放置培养箱中 48h后用CCK8试剂检测细胞存活率，实验重复3次取平均值。协同指数参考金式公式计算Q值，通过Q值判断两种药物联合使用后的治疗效果，如果Q 在0.85-1.15之间为单纯相加(+)，在1.15-20之间为增强(++)，Q>20为显著增强(+++)，在0.85-0.55之间为拮抗，Q<0.55为明显拮抗(--)；根据生物实验大约有15％的误差，将效应相加的Q值扩展为0.85-1.15；Q>1.15即为协同作用。

与对照组相比，随着式I-4所示化合物及吉西他滨的浓度增加，人肺癌细胞A549的存活率越低，当两药联合使用时，与同样浓度单药组相比，联药组细胞存活率更低，说明联药对人肺癌细胞A549存活性能的抑制作用越强。通过Q值计算，说明吉西他滨和式Ⅰ-4化合物联用作用A549细胞48h时，对A549细胞有协同抑制作用，结果如图1所示。

(2)CCK8比色法检测联合用药对肿瘤细胞存活性能的影响

细胞铺板方法同上，本实验中联合用药浓度设置根据(1)中实验结果，设置单一浓度式Ⅰ-4化合物与浓度梯度吉西他滨联用。单药组加固定浓度2 μg/mL的吉西他滨溶液100μL,另一单药组加工作浓度为2.5μg/mL、5μ g/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL的式I-4所示化合物溶液100μL；联药组含式I-4所示化合物吉西他滨溶液100μL，联药的工作浓度为(2μg/mL+5 μg/mL)、(2μg/mL+5μg/mL)(2μg/mL+5μg/mL)、(2μg/mL+5μg/mL)、(2 μg/mL+5μg/mL)；将96孔板继续放置培养箱中48h后用CCK8试剂检测细胞存活率，实验重复3次取平均值，协同指数计算同上。

结果如图2所示，与对照组相比，随着式I-4所示化合物浓度的增加，人肺癌细胞(A549)的存活率越低，不同浓度的式I-4与2μg/mL吉西他滨联用时，对A549细胞抑制率更高。通过Q值计算，说明低浓度式Ⅰ-4化合物同吉西他滨联用作用A549细胞48h时，对A549细胞有协同抑制作用。

(3)细胞划痕实验检测联合用药对肿瘤细胞迁移性能的影响

取对数生长期人肺癌细胞(A549)，用DMEM培养液配制适宜浓度细胞悬液，细胞密度约200000个/mL，以每孔1mL细胞悬液将细胞接种于24孔板， 37℃培养箱中培养至细胞贴壁。以DMSO为溶剂配制浓度20mg/mL的式I-4 所示化合物溶液，实验时用培养液稀释至所需工作浓度。24孔板弃培养液后，用200μL的枪头沿着孔中央作直划痕，用PBS轻轻洗去划痕产生的细胞团，实验组中单药组分别加入工作浓度为2μg/mL的吉西他滨溶液1mL、5μg/mL 的式I-4化合物溶液1mL、联药组加入含2μg/mL吉西他滨和5μg/mL的式 I化合物溶液1mL，空白对照组加入培养液1mL；拍照并记录0h、24h、 48h各孔的划痕宽度并计算每孔平均值，最后计算平均划痕修复率，实验重复3次取平均值，组间使用T-test分析差异显著性，P＜0.05有统计学意义。

划痕修复率(％)＝(0小时划痕面积-Nh划痕面积)/0小时划痕面积*100

结果如图3所示，划痕实验结果表明，与对照组相比，低浓度式I-4所示化合物及低浓度吉西他滨均能抑制A549细胞的迁移作用，两药联合时，划痕修复率比单药组更低，说明两种药物联用时，能显著抑制A549细胞迁移能力。

(4)细胞克隆形成实验检测联药对肿瘤细胞增殖的影响

取对数生长期人肺癌细胞(A549)，用DMEM培养液配制适宜浓度细胞悬液，细胞密度约300个/mL(即每1mL培养液中约含300个细胞)，以每孔3mL 细胞悬液将细胞接种于6孔板，37℃培养箱中培养至细胞贴壁。以DMSO为溶剂配制浓度20mg/mL的式I-4所示化合物溶液，实验时用培养液稀释至所需工作浓度。6孔板弃培养液后，实验组中单药组分别加入工作浓度为2μg/mL 的吉西他滨溶液3mL、5μg/mL的式I-4化合物溶液3mL、联药组加入含2 μg/mL吉西他滨和5μg/mL的式I-4化合物溶液3mL，空白对照组加入培养液3mL；，将6孔板继续放置培养箱中，每2-3天更换新鲜的培养液或含药物的培养液，持续培养一周左右，持续观察细胞形态，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃培养液，用PBS小心浸洗2次，加入4％多聚甲醛 (PFA)1mL固定细胞30min。弃PFA后每孔加入1mL 0.1％的结晶紫染色30min，超纯水洗去染色液，6孔板晾干后拍照(图5)并计算克隆形成率，组间使用T-test分析差异显著性，P＜0.05有统计学意义。

结果如图4所示，与对照组相比，低浓度式I-4所示化合物及低浓度吉西他滨均能抑制A549细胞的克隆形成，两药联合时，克隆形成率比单药组更低，说明两种药物联用时，对A549增殖具有显著的协同抑制作用。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (10)

1.如式I所示的2’，6’-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物或其立体异构体或其前药或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物；

其中，R¹、R²分别独立选自：

1)氢、羟基、卤素；

2)任选被取代的C1-C6烷氧基酰基、羟基酰基、酰卤基、任选被取代的C6-C10芳醚基酰基、任选被取代的杂芳醚基酰基，其取代基选自：卤素原子、氨基、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6含氟烷基；

3)酰氨基或一个或两个氮上任选被取代的氨基酰基，取代基选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6含氟烷基、C3-C7环烷基；

4)芳氨基酰基或杂芳氨基酰基，其中的芳基或杂芳基任选地被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C3含氟烷基、C3-C6环烷基、卤素、氨基、羟基、任选被取代的杂环基取代。

2.根据权利要求1所述的如式I所示的2’，6’-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物或其立体异构体或其前药或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的溶剂合物，其特征在于，

其中，R¹选自:

R²优选自：-H,-COOMe。

3.如式I所示的2’，6’-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

玻璃反应瓶，加入底物CBD、氯代物、溶剂DMF，混合均匀后除氧，加入Cs₂CO₃，然后将反应瓶置于100℃油浴中至反应完毕；置于冰水浴中，往体系加入1N HCl调pH至3～5,乙醚分液萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗以及无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经反相制备得目标化合物；

反应通用合成路线如下所示：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，上柱层析洗脱体系为正己烷：乙酸乙酯＝2：1等梯度洗脱；反相制备洗脱体系为乙腈：水＝4：1等梯度洗脱。

5.如式I所示的2’，6’-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物在制备抗肿瘤药物上的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为肺癌。

7.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包括活性成分和药学上可接受的辅料，所述活性成分包括如式I所示的2’，6’-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物。

8.根据权利要求7所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括但不限于肿瘤细胞增殖抑制剂。

9.如式I所示的2’，6’-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物和吉西他滨联用在制备抗肿瘤药物上的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，同时给药时，且吉西他滨和如式I所示的2’，6’-双吡啶取代大麻二酚醚类化合物之间的质量浓度比为0.083：1至0.25：1。

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