CN113072634A - 一种胞膜瞬时受体电位c6通道免疫原性短肽及其疫苗和抗心室纤维化的制药应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性短肽及其疫苗和抗心室纤维化的制药应用，属于生物医药技术领域，本发明设计、构建、合成的短肽GF8‑001，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，该短肽GF8‑001与载体蛋白KLH通过戊二醛耦联法耦联成为肽段半抗原‑偶联蛋白(即全抗原：治疗性短肽GF8‑001)并辅以福氏佐剂可诱导机体产生针对TRP6的持久且滴度水平很高的目的抗体。在体以及离体水平上检验该目的抗体均能有效阻遏心室成纤维细胞上的TRPC6通道、抑制心室成纤维细胞的胞浆钙内流、从而显著抑制心室成纤维细胞的增殖、阻止心室肌纤维化、改善心室重构。

Description

一种胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性短肽及其疫苗和抗心 室纤维化的制药应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性短肽及其疫苗和抗心室纤维化的制药应用。

背景技术

心室纤维化是心肌梗死、心肌病、心律失常等各种心脏疾病发生发展中共有的病理变化过程，是左心室重塑的重要病理表现之一，其可以加重心功能衰竭、诱发恶性心律失常，危及患者生命(Díez Javier,J Am Coll Cardiol,2020,75:2204-2218)。在心室纤维化的发生、发展过程中，成纤维细胞过度的增殖、迁移至损伤局部，转化为心脏肌成纤维细胞，功能随之发生显著变化，其胞膜上的瞬时受体电位(TRP)通道表达水平显著升高并且分泌大量细胞外基质与胶原蛋白，加重心室纤维化与心力衰竭，最终累及心功能、引起患者死亡(Ikeda Kenichi,Cell Calcium,2013,54:213-25)。目前缺乏针对心室纤维化的特效治疗药物。临床上逆转左心室重塑的主要治疗药物仍然是ACEI、ARBs、ARNI、β受体阻滞剂以及安体舒通等(Greene Stephen J,J Am Coll Cardiol,2019,73:2365-2383)。虽然上述药物在改善心室重塑的过程中能够部分程度的缓解心室纤维化，但是因为这些药物并非单一针对心室纤维化治疗的特异性药物，其对左室纤维化的治疗靶点选择特异性差，导致临床上针对心肌纤维化的治疗效果欠佳(Vazir Ali,Eur Heart J,2019,40:960-966)。尽管当前心血管内科联合使用各类药物治疗心肌纤维化，每年仍有大量患者因为心室纤维化的发生、发展诱发终末期心衰而死亡(Hashimoto Hisayuki,Nat Rev Cardiol,2018,15:585-600)。心室纤维化已经成为当前患者心源性死亡的重要原因，成为危及患者生命的世界性难题(González Arantxa,J Am Coll Cardiol,2018,71:1696-1706)。因此，针对心室纤维化的治疗，积极探索不依赖于传统药物、具有靶点特异性的全新途径变得迫在眉睫。

当前，国内、国外针对心室纤维化的新型药物研发有多个中心在进行，但他们大多研发的是化学类药物(Santos-Gallego Carlos G,JACC Cardiovasc Imaging,2020)。化药的靶点选择性通常较差，即使有一定的靶向选择性，也罕有化学药物能够识别同一个通道家族中的不同成员，比如TRPC3与TRPC6。而治疗性短肽则有这方面的优势，其能够有针对性的与通道蛋白的特异性家族成员相结合来发挥抗心室纤维化的作用。不同于传统药物，治疗性短肽主要针对诱发心室纤维化的特异性靶点，因此具有组织特异性好、疗效持续时间长、并发症少等优点。当前，针对肺动脉高压的特异性治疗性短肽：肺动脉高压ET_A受体治疗性短肽以及难治性高血压的治疗短肽：抗AT₁受体胞外肽段短肽、L型钙通道治疗性短肽均已研制成功并准备开展I期临床试验(Dai Yong,J Am Coll Cardiol,2019,73:2567-2580；Chen Xiao,Hypertension,2013,61:408-16)。这说明针对疾病特异性靶点的治疗性短肽有可能成为临床疑难疾病的全新治疗手段。

但是，目前尚无任何构建治疗性短肽抗心室纤维化的研究报道及其相关的发明专利。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性短肽及其疫苗和抗心室纤维化的制药应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性短肽，该短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：661Gly-Ala-Lys-Gln-Asn-Glu-Ala-Phe 668。

本发明公开了一种胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性载体疫苗，该疫苗由权利要求1所述的短肽与载体耦联而成。

优选地，该疫苗由上述的短肽与血蓝蛋白KLH通过戊二醛耦联法耦联成的具有完全抗原特征的载体疫苗，即短肽半抗原GF8-001-耦联载体蛋白，又称为治疗性短肽GF8-001。

本发明还公开了上述的胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性短肽或上述的胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性载体疫苗在制备抗心室纤维化药物中的应用。

优选地，所述的药物为抑制心室成纤维细胞的增殖、阻止心室肌纤维化、改善心室重构的药物。

进一步优选地，所述的药物为通过阻遏心室成纤维细胞上的TRPC6通道、阻断心室成纤维细胞的胞浆钙内流，从而抑制心室成纤维细胞的增殖、阻止心室肌纤维化、改善心室重构的药物。

进一步优选地，所述的药物为抑制心室成纤维细胞分泌的TGF-β1、MMP-2、MMP-9、TNF-α或IL-1β的药物。

优选地，所述的药物为通过抑制促炎性因子、促纤维化因子的释放反馈性的改善心脏功能与缓解左室重构的药物。

本发明还公开了一种抗心室纤维化的药物，由权利上述的胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性载体疫苗添加药学上可接受的辅料制成。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明设计、构建、合成的短肽GF8-001，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：661Gly-Ala-Lys-Gln-Asn-Glu-Ala-Phe 668。该短肽GF8-001与载体蛋白KLH通过戊二醛耦联法耦联成为肽段半抗原-耦联蛋白(即全抗原：治疗性短肽GF8-001)并辅以福氏佐剂可诱导机体产生针对TRP6的持久且滴度水平很高的目的抗体。在体以及离体水平上检验该目的抗体均能有效阻遏心室成纤维细胞上的TRPC6通道、抑制心室成纤维细胞的胞浆钙内流、从而显著抑制心室成纤维细胞的增殖、阻止心室肌纤维化、改善心室重构。

更重要的是，GF8-001治疗性短肽产生的目的抗体对大动脉、肾脏、脑组织、肝脏、肺部、脾脏等重要靶器官无免疫损伤。本发明的治疗性短肽不但能够特异性的针对心室成纤维细胞胞膜上的TRPC6通道、通过封闭TRPC6通道向胞内的钙内流从而抑制心室成纤维细胞的增殖、迁移、向肌成纤维细胞的转化，降低细胞外基质的合成，达到有效缓解心室纤维化的目的。而且短肽GF8-001作为只有8个氨基酸的短肽，其合成成本低，制备和纯化简单、快捷，与普通蛋白质载体的耦联效率高，辅以佐剂即可刺激机体产生特异性的针对TRPC6通道且在体应用安全的目的抗体。因此，GF8-001治疗性短肽应用于治疗心室纤维化，未来前景广阔。

附图说明

图1为TRPC6通道的蛋白结构示意图；其中，a为TRPC6通道蛋白空间结构侧面示意图；b为S5-S6筛孔区域的空间结构以及相邻的氨基酸残基全景示意图；c为采用垂直示意图显示通透钙离子的筛孔区域半径；d为TRPC6通道蛋白跨膜区域的中心截面空间结构示意图；e为d翻转90°后的空间结构示意图；

图2为免疫印迹实验评估GF8-001治疗性短肽的目的抗体与心室成纤维细胞TRPC6通道的结合情况结果图；

图3为激光共聚焦显微镜分析GF8-001短肽的目的抗体(绿色荧光)与TRPC6的结合情况结果图；

图4为本发明钙内流实验的评估结果图；其中，(a)为ET-1干预；(b)为Ang II干预；

图5为激光共聚焦显微镜检测GF8-001短肽的目的抗体能够在离体水平抑制心室成纤维细胞的增殖与迁移结果；

图6为图5的统计结果图；

图7为针对TRPC6的GF8-001短肽的目的抗体抑制血管紧张素II诱发的心室成纤维细胞TGF-β1、MMP-2、MMP-9表达结果图；其中，(a)为TGF-β1；(b)为MMP-2；(c)为MMP-9；

图8为GF8-001短肽能够在离体水平有效降低血管紧张素II刺激引发的心室成纤维细胞炎性因子的mRNA表达；其中，(a)为TNF-α；(b)为IL-1β；

图9为GF8-001治疗性短肽能够有效缓解病理刺激诱发的心脏重塑，改善心脏功能；其中，(a)为左室收缩末期内径；(b)为左室舒张末期内径；(c)为左室射血分数；(d)为左室短轴缩短率；

图10为各组小鼠心室纤维化的面积占心室总面积的百分比；

图11为通过偏振光评估通过天狼星红染色的各组小鼠心室纤维化的面积和程度、I型胶原纤维和III型胶原纤维的分布；

图12为GF8-001治疗性短肽能够减轻病理刺激诱发的心室单核细胞以及淋巴细胞的浸润结果；

图13为GF8-001治疗性短肽能够有效逆转病理刺激诱发的心室IL-1β表达水平；

图14为GF8-001治疗性短肽能够有效逆转病理刺激诱发的心室TNF-α表达水平；

图15为免疫组化法评估心脏内巨噬细胞及炎性细胞浸润的实验结果；

图16为免疫组化法评估肾脏内巨噬细胞及炎性细胞浸润的实验结果；

图17为免疫组化法评估肺内巨噬细胞及炎性细胞浸润的实验结果；。

图18为免疫组化法评估肝脏内巨噬细胞及炎性细胞浸润的实验结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

本发明提供了一种用于治疗心脏纤维化的短肽：GF8-001，其氨基酸序列为：Gly-Ala-Lys-Gln-Asn-Glu-Ala-Phe。通过对TRPC6电位通道的氨基酸序列及其结构域、重要位点进行分析，并结合IEDB、PIR软件进行赋值、评估、打分以及FFAS软件评分、综合PDB晶体的分辨率通过模板进行模拟、利用AutoDock Vina软件将TRPC6的模拟蛋白晶体结构PDB转换为PDBQT文件并采用PyRx软件对TRPC6通道上可能存在的具备重要生物学功能的配体结合位点进行筛选后初筛出理想的短肽序列，并且针对该短肽进行体外筛选，最终确认治疗心室纤维化的短肽所针对的最佳抗原表位为：TRPC6 EC3环的661GAKQNEAF668氨基酸序列(如SEQ ID NO.1：661Gly-Ala-Lys-Gln-Asn-Glu-Ala-Phe 668)。

该短肽与载体KLH通过戊二醛耦联法能够高效的耦联成为肽段半抗原—耦联蛋白(完全抗原：GF8-001治疗性短肽)，GF8-001治疗性短肽协同福氏佐剂即可刺激机体产生高效价且作用持久的目的抗体。该治疗性短肽免疫Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠可显著缓解血管紧张素II、压力负荷、糖尿病等病理刺激诱发的Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠心脏纤维化，并且能够减轻Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠的左室重构，改善SpragueDawley大鼠、BALB/C小鼠的心脏功能。通过后续的远期在体研究发现GF8-001治疗性短肽对Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠重要靶器官远期亦无免疫损伤。GF8-001治疗性短肽的在体研究初步揭示：GF8-001治疗性短肽在体应用具有安全性。

离体水平上发现：GF8-001治疗性短肽产生的目的抗体能够特异性的结合心室成纤维细胞胞膜上的TRPC6，通过封闭TRPC6通道有效抑制心室成纤维细胞胞浆的钙内流、改善病理刺激诱发的心室成纤维细胞的增殖与迁移。

进一步的研究揭示：GF8-001治疗性短肽所产生的目的抗体还能够有效降低心室成纤维细胞分泌的TGF-β1、MMP-2、MMP-9、TNF-α、IL-1β等细胞因子和蛋白酶，从而进一步延缓心室纤维化的发生、发展。

通过上述的在体以及离体结果均表明：GF8-001治疗性短肽不但能够有效改善Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠的心室纤维化；且其具有合成与纯化的方法方便、快捷，与KLH蛋白耦联容易且效率高，耦联后纯化获取的完全抗原经福氏佐剂协同可高效的刺激机体产生抗体、其目的抗体的组织特异性强、靶点针对性好、不会其他重要靶器官造成损伤、在体应用的安全性好等临床应用优点。

下面结合具体的实施步骤、实施方法以及研究的部分结果是对本发明做出进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、针对TRPC6的短肽设计原则：该抗原表位设计原则要求具有1.良好亲水性2.处于通道蛋白表面3.尽量选择靠近蛋白的N、C两端4.保证该序列不形成α-螺旋5.序列长度在8-20个氨基残基之间为宜。抗原表位预测思路：1.亲水性2.可及性3.抗原性4.可塑性5.电荷分布平衡6.二级结构预测方案7.同源比对。

2、针对TRPC6短肽的设计、构建与合成

首先分析TRPC6的氨基酸序列(Accession:NP_004612.2；GI:5730102)

msqspafgpr rgssprgaag aaarrnesqd yllmdselge dgcpqaplpcygyypcfrgsdnrlahrrqt vlrekgrrla nrgpaymfsd rstslsieee rfldaaeygnipvvrkmleechslnvncvd ymgqnalqla vanehleite lllkkenlsr vgdalllaiskgyvriveailshpafaegk rlatspsqse lqqddfyayd edgtrfshdv tpiilaahcq eyeivhtllrkgarierphd yfckcndcnq kqkhdsfshs rsrinaykgl aspaylslss edpvmtalelsnelavlaniekefkndykk lsmqckdfvv glldlcrnte eveailngdv etlqsgdhgrpnlsrlklai kyevkkfvahpncqqqllsi wyenlsglrq qtmavkflvv lavaiglpflaliywfapcs kmgkimrgpf mkfvahaasftiflgllvmn aadrfegtkl lpnetstdnakqlfrmktsc fswmemliis wvigmiwaec keiwtqgpkeylfelwnmld fgmlaifaasfiarfmafwh askaqsiida ndtlkdltkv tlgdnvkyyn larikwdpsdpqiiseglyaiavvlsfsri ayilpanesf gplqislgrt vkdifkfmvi fimvfvafmigmfnlysyyigakqneaftt veesfktlfw aifglsevks vvinynhkfi enigyv lygvynvtmvivllnmliaminss fqeieddadv ewkfaraklw fsyfeegrtl pvpfnlvpspkslfylllklkkwiselfqg hkkgfqedae mnkineekkl gilgshedls klsldkkqvghnkqpsirssedfhlnsfnn pprqyqkimk rlikryvlqa qidkesdevn egelkeikqdisslryelleeksqntedla elirelgekl smepnqeetn r(如SEQ ID NO.8所示)

对TRPC6的分子结构进行分析，根据短肽设计原则以及TRPC6的结构域特点初步选择13组氨基酸序列作为针对TRPC6的短肽设计靶点：ANK1:97-126；ANK2:132-161；ANK3:163-189；ANK4：218-247；TM1:439-459；TM2:488-508；TM3:522-542；TM4:593-613；TM5:637-657；TM6:707-727；E1:460-487；E2:543-592；E3:658-706。我们基于生物信息学技术，分别根据IEDB(Immune Epitope Database)以及PIR(The protein Inforamtion Resource)软件对上述氨基酸序列进行分析并且打分。

基于上述13组氨基酸序列进行抗原表位的亲水性预测，结果发现：TRPC6 E3环上的658-678(yyigakqneafttveesfktl，如SEQ ID NO.9所示)共21个氨基酸序列的亲水性预测结果理想，初步符合抗原表位的亲水性要求。据此对上述21个氨基酸序列做抗原表位亲水性筛选的进一步分析以优化肽段，经过进一步抗原表位亲水性筛选优化后获得的肽段为IGAKQNEAFTT(如SEQ ID NO.10所示)，该肽段包括11个氨基酸。继续对这11个氨基酸序列进行分析，采用线性表位预测法，对短肽进一步评估：对TRPC6胞外E3段P环的β转角进行预测以及评价，又对TRPC6胞外E3段的Ploop进行可及性预测及评估，对可及性预测的各组备选肽段进行评估。

综合以上氨基酸序列抗原表位的亲水性预测、线性表位预测、胞外E3段P环的β转角评价、胞外E3段的P loop可及性评判并对可及性预测的各组备选肽段进行全面分析以及筛选后认为：肽段GAKQNEAF通过第一轮的筛选，可能成为针对TRPC6的理想治疗性短肽序列。

接下来采用同源类比分析对GAKQNEAF短肽序列进行同源性匹配，结果发现：TRPC6的GAKQNEAF短肽序列在小鼠、人等哺乳动物具有同源性。同时，GAKQNEAF短肽所对应的氨基酸序列及其临近序列具有高度的进化保守性，暗示该序列可能具有重要的生物学功能。

进一步将GAKQNEAF进行序列匹配，发现三组GAKQNEAF均为hTRPC6。为进一步校验GAKQNEAF这一短肽序列的同源性与匹配程度，将GAKQNEAF拆分为GAKQN与AKQNE两段，分别进行匹配分析：GAKQN序列的匹配结果、AKQNE序列的匹配结果以及匹配的序列所对应氨基酸发挥的生物学功能。

经过上述一系列的预测、分析、评估与筛选，最终确定：661GAKQNEAF668氨基酸序列有希望成为针对TRPC6通道的理想短肽序列。

接下来对GAKQNEAF氨基酸序列结合配体的能力以及作为“受体”的TRPC6通道上的GAKQNEAF氨基酸序列与配体结合后可能具备的生物学功能进行预测与评估。

首先根据短肽序列的相似性、结合FFAS软件评分、综合PDB晶体的分辨率进行评估，尽量选择与传统型瞬时感受器电位通道6(TRPC6)序列一致性高的PDB结构作为TRPC6序列的模板。综合同源性、氨基酸残基数目的相似程度以及FFAS评分，专利申报团队最后选择Vanilloid瞬时感受器电位通道1蛋白的PDB(PDB ID:5IRX)作为传统型瞬时感受器电位通道6(TRPC6)的蛋白晶体结构模板。作为TRPC6蛋白质结构模板的Vanilloid瞬时感受器电位通道1蛋白的低温电镜结构示意图如文献报道的结果(师迪婧,生理科学进展,2014,45(6):401-409)，利用AutoDock Vina软件，以Vanilloid瞬时感受器电位通道1蛋白结构作为模板，将TRPC6的模拟蛋白晶体结构PDB转换为PDBQT文件，并将TRPC6设置为受体，采用PyRx软件对可能存在的具备重要生物学功能的配体结合位点进行筛选，参考的文献资料与申报人筛选的结果均显示：与TRPC6“受体”相结合的“配体”中，所有具备高度的受体亲和力、能够与“受体”TRPC6发生强相互作用且具有重要生物学功能的“配体”都落入“受体”TRPC6的8个疏水“口袋”内(王雪莹，空军军医大学硕士学位论文，R695，615，公开)。通过筛选与参考相应文献后确定这8个重要的疏水“口袋”分别为：2号口袋、3号口袋、10号口袋、13号口袋、18号口袋、19号口袋、31号口袋、32号口袋(王雪莹，空军军医大学硕士学位论文，R695，615，公开)。因此，推测：“受体”TRPC6上涵盖在这些疏水“口袋”内的氨基酸序列可能就是高度作用于TRPC6、具备重要生物学功能的配体结合TRPC6上的特异性氨基酸序列。进一步对TRPC6上8个疏水“口袋”内的氨基酸以及周围氨基酸数目以及残基进行汇总评估，结果发现：18号口袋内及其周边所包含的氨基酸残基为661-663；665-667；669；670。更加重要的是：前述通过IEDB(Immune Epitope Database)以及PIR(The protein Inforamtion Resource)生物信息学软件筛选出的短肽序列：661GAKQNEAF668完美的落入“受体”TRPC6上能够紧密与“配体”结合、可能发挥重要生物学功能的18号“疏水”口袋中(内容参见：王雪莹，空军军医大学硕士学位论文，R695，615，公开)。

为进一步确认TRPC6上的661GAKQNEAF668氨基酸序列与“配体”结合后是否可能具备重要生物学功能，参考采用冷冻电镜技术解析出的TRPC6通道蛋白的晶体结构(TangQinglin,Cell Res,2018,28:746-755)。通过分析TRPC6通道蛋白的冷冻电镜晶体结构，发现：筛选的661GAKQNEAF668氨基酸序列毗邻TRPC6通道蛋白选择性内流钙离子的筛孔区域正上方的E687氨基酸位点，且氨基酸残基之间存在重要的相互影响。这强烈暗示：TRPC6 E3环的661GAKQNEAF668氨基酸序列是“配体”紧密结合“受体”TRPC6并且能够阻遏钙离子通过TRPC6 S5-S6筛孔区域内流至胞浆内的重要氨基酸序列，结构示意图如图1所示。

本发明所选择短肽的氨基酸序列为：Gly-Ala-Lys-Gln-Asn-Glu-Ala-Phe(GAKQNEAF)。采用动态固相合成法，利用多肽合成仪合成抗原短肽并采用层析法以及高压液相色谱提纯法对合成的短肽进行提纯以及后续的肽段纯度分析。纯度分析显示合成短肽的纯度>91％。本发明所合成并纯化后获得的短肽编号为：GF8-001，其氨基酸序列为：Gly-Ala-Lys-Gln-Asn-Glu-Ala-Phe。。

将合成并且提纯后的GF8-001短肽与载体KLH通过戊二醛耦联法进行耦联，耦联成为肽段半抗原—偶联蛋白。耦联的方法如下：

1)将动态固相合成并且纯化获得的短肽GF8-001，按1:1的体积溶于pH＝8.9的1X硼酸缓冲液。2)按照多肽与血蓝蛋白KLH的物质量之比为1：9的比例在完全溶解短肽GF8-001的硼酸缓冲液中加入KLH。3)低速振荡缓冲液，震荡的同时缓慢加入新鲜配制的0.35％的戊二醛缓冲液，共加入戊二醛缓冲液1ml。在37℃水浴孵育3小时，一边孵育一边缓慢转动烧杯以使试剂充分混匀。4)孵育完成后，向缓冲液中加入1mol/L的甘油0.5ml左右以充分封闭溶液中未发生反应、残存的戊二醛。在37度环境中封闭1小时。5)将封闭后的溶液加入预处理过的透析袋中，并且将该透析袋完全浸没于pH＝8.6的硼酸缓冲液中，将透析袋和缓冲液放入4℃冰箱中过夜透析，注意过夜透析的过程需要更换pH＝8.6的硼酸缓冲液3次。6)经过透析过夜后所得液体即为耦联获得的肽段半抗原—偶联蛋白(完全抗原：GF8-001治疗性短肽)，评估耦联效率显示GF8-001短肽与载体蛋白KLH采用戊二醛偶联法制备成肽段半抗原—偶联蛋白，其具有良好的耦联效率，耦联效率≥92％。将该完全抗原分装进入EP管中，放置于-70℃冰箱中长期备用。

接下来通过包被含有抗原决定簇TRPC6胞外第三环段(EC3)GAKQNEAF序列的短肽片段、制作用于抗体滴度测定的96孔板。将GF8-001短肽包被用于ELISA实验的96孔板的操作步骤如下：

1)先配制短肽包被液:碳酸钠0.75g+碳酸氢钠1.45g，加入500ml单蒸水，调节PH＝9.6。2)GF8-001短肽(1mg)加入40μlDMSO中，完全溶解后瞬离溶解液。3)加入60μl硼酸，配制成10mg/ml的体系1。4)再次瞬离。5)称取20mgBSA加入4ml硼酸中，配制成5mg/ml的体系2。6)将体系1中溶液取出20μl。7)将体系2中溶液取出160μl。8)配成体系3(180μl)。9)配制体系4(戊二醛体系)1ml：988μl硼酸+12μl戊二醛(25％)。10)将体系4取出180μl加入体系3中，形成体系5(360μl)。11)体系5在37度温箱中孵育2小时，每隔20分钟摇晃一次。12)配制体系6(甘氨酸体系)：配制1mol/L的甘氨酸体系10m(称取0.75g甘氨酸加入10ml双蒸水中)。13)将体系6取出40μl加入体系5中，形成体系7(400μl)。14)体系7在37度温箱中孵育30分钟。15)体系7中加入20ml包备液，形成体系8。16)96孔板每孔加入100μl体系，体系7可以包备两个96孔板。17)放入湿润的饭盒中，4度孵育过夜。18)第二天进行封闭，配制封闭液，封闭液的配方为：0.4g BSA加入24mlPBST中，配制成2％浓度的BSA封闭液，将该封闭液加入96孔板中，每孔各加120μl的封闭液。19)96孔板放入湿润的饭盒中，37度温箱中孵育90分钟。20)用PBST冲洗96孔板3遍。21)待其干燥。22)封膜做上标记后放置于4度冰箱中长期保存。

随后将该治疗性短肽疫苗采用分时(共四次给予免疫)、多点皮下注射的方法免疫新西兰实验兔：分别在第1、15、30、45天于颈部等多部位皮下注射免疫新西兰兔。免疫新西兰兔的具体方法如下：

1)将通过载体蛋白KLH采用戊二醛耦联法耦联合成的完全抗原(GF8-001治疗性短肽)750μg与不完全福氏佐剂按1：1的体积混合并加入10ml的注射器内。注意通过反复推拉连接注射器的三通管以充分混匀以及乳化GF8-001治疗性短肽与完全福氏佐剂的混合物，直至乳化到混合液混匀且不散开为宜，乳化充分后免疫新西兰兔。2)分别在兔子颈部，后背，腿部以及臀部等部位皮下进行多点注射进行免疫。3)于初次免疫新西兰兔后第15天、30天、45天分别进行加强免疫，共计免疫4次。加强免疫方法时将GF8-001治疗性短肽500μg与不完全福氏佐剂按1：1的体积混合并加入5ml的注射器，充分混匀并乳化后多点注射新西兰兔。免疫注射的部位同前。4)GF8-001治疗性短肽(完全抗原)免疫新西兰兔期间，从新西兰兔的耳缘静脉中抽取2ml左右的静脉血，经过离心后留血清。使用专利申报团队包被GF8-001短肽的96孔板，采用ELISA法分别于第6、12、18、24、30、36、42、48、54、60天测定并且评估新西兰兔血液中针对TRPC6 EC3 GAKQNEAF治疗性短肽的抗体滴度水平，结果显示基于GF8-001治疗性短肽(完全抗原)辅以佐剂免疫新西兰兔能够产生滴度水平很高且滴度持久的目的抗体，如表1所示。

表1皮下免疫新西兰兔的目的抗体滴度随时间变化测定结果

6)2月后将经GF8-001治疗性短肽免疫的新西兰兔全部处死，离心后收集血清，获取并纯化抗体。

3.抗体的获取与纯化：采用GF8-001短肽与载体KLH耦联后的完全抗原免疫新西兰兔，2月后处死新西兰兔、取血，再经盐析法以及亲和沉析法获取提纯后的目的抗体。前期制作以及孵育透析袋的流程如下：

1)剪裁透析袋，将其剪裁成12—15cm左右的小段；2)将剪裁后的透析袋浸入预处理溶液中，该溶液含有2％—3％碳酸氢钠以及1mmol/L EDTA，将其煮沸15分钟左右；3)用无菌的蒸馏水反复冲洗透析袋内部，冲洗3-5次左右，将透析袋内部冲洗干净为止；4)再次将透析袋浸入1mmol/L的EDTA溶液中煮沸15分钟；5)冷却后将透析袋浸没入生理盐水中；将其放置于4℃冰箱中备用。6)每次透析袋使用前，需要将其用蒸馏水再反复冲洗内部3-5次。

随后通过盐析法(利用饱和硫酸铵)提取抗体的方法如下：

1)免疫新西兰兔四次后将其处死，将获取的血清以2000rpm/min离心20分钟—30分钟，取上清以弃去纤维蛋白。2)将获取的血清按1:1:2的体积加入分别加入生理盐水和饱和的硫酸铵溶液，配置成为50％硫酸铵溶液。4度环境下孵育过夜以充分沉淀。孵育结束后再次以2000rpm/min离心20分钟—30分钟。弃去上清。3)加入30ml生理盐水反复吹打以使得沉淀充分溶解，向沉淀和生理盐水的混悬液中加入20ml的饱和硫酸铵溶液。溶液中硫酸铵的浓度为40％，再次置入4度环境中孵育过夜以充分沉淀。孵育结束后以2000rpm/min离心20分钟—30分钟。弃去上清，保留沉淀。4)加入30ml生理盐水缓慢吹打以使沉淀充分溶解，向混悬液中加入15ml的饱和硫酸铵溶液。溶液中硫酸铵的浓度为33.3％。重复3)中的孵育过夜以及离心、保留沉淀等操作。5)将4)中的实验步骤重复一次。向收集的沉淀中加入0.5ml左右的1XPBS缓冲液，充分震荡以完全溶解沉淀。向溶解后的混悬液装入申报者制作并且预处理过的透析袋中(透析袋的预处理方法同前)，将透析袋完全浸入1X PBS缓冲液中，于4℃环境中静置透析20-30小时(注意：静置透析的过程中需要换液3—5次)。6)静置透析结束后，透析袋中即可收集到针对TRPC6胞外第三环段(EC3)GAKQNEAF治疗性短肽GF8-001的目的抗体。

进一步通过亲和层析法纯化该目的抗体，纯化的方法如下：

1)将盐析后的目的抗体通过美国BIO-RAD公司生产的层析仪，采用亲和层析法通过Protein A层析柱进行层析以充分去除粗提的目的抗体中残留的离子和除其它种类的杂质Immunoglobulin。2)将层析后的抗体装入预处理过的透析袋中(透析袋的预处理方式同前)，在4度环境中将其放入1X PBS缓冲液中透析18-24小时，期间注意更换透析液3-5次。3)最后通过Millipore Centriplus 10000超滤浓缩目的抗体以获得纯度以及浓度更高的目的抗体。4)再将该目的抗体与过量的短肽GF8-001相孵育，获取治疗性短肽GF8-001的中和化的抗体。

4.离体水平确认治疗性短肽GF8-001目的抗体的特异性、有效性

首先利用乳鼠心室成纤维细胞与心室肌细胞贴壁时间的不同，采用酶解联合差速贴壁法分离、培养、鉴定乳鼠心室成纤维细胞，具体方法如下：

1)取1-3天龄的乳鼠，在无菌工作台中小心取出左心室，用剪刀将乳鼠左心室尽量剪碎。2)按1:1比例配置胰酶和1型胶原酶，将其作为酶解液。在37度的恒温水浴槽中采用分次酶解法分8次、每次6分钟左右逐渐消化—冲悬—消化乳鼠左心室，直至心室肌碎片消失。3)用完全培养基充分中和消化液。4)采用离心法将中和后的消化液予以离心，注意控制离心的速度与离心的时间，避免对乳鼠心室成纤维细胞造成损伤。5)丢弃上清，再次用完全培养基小心的将沉淀吹打为悬液。6)将冲悬后的液体过滤，随后种植于25CM²的细胞培养瓶中。将种植后的细胞培养瓶放入37度细胞培养孵育箱中静置、孵育。7)利用差速贴壁的原理，细胞培养瓶中的乳鼠心室成纤维细胞先贴壁，乳鼠原代心室肌贴壁时间晚。因此，静置30分钟，弃去上清液，贴壁的细胞即为乳鼠心室成纤维细胞。

通过免疫荧光法与免疫印迹法评估治疗性短肽GF8-001的目的抗体与心室成纤维细胞TRPC6通道的结合情况。实验步骤如下：

1)弃去细胞培养瓶中的完全细胞培养基，用预冷后的PBS反复洗涤细胞培养瓶多次，弃去沉渣。加入碧云天公司的蛋白提取试剂盒中提供的强RIPA蛋白质裂解液以及PMSF、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，在冰上用细胞刮反复、用力的刮细胞培养瓶的瓶底，重复6次，每次刮3分钟，静置。2)采用超声探头在冰上充分裂解蛋白液。3)收集裂解液至EP管并将EP管封口，置于4度预冷过的离心机中，13000转高速离心18分钟。4)弃去沉淀，保留上清。5)加入5X的Loading Buffer缓冲液，混匀。6)在水浴锅中煮5分钟，注意水浴锅的液面不要浸没EP管。7)后续通过Western-Blotting法评估治疗性短肽GF8-001的目的抗体与乳鼠成纤维细胞TRPC6的结合情况。注意：治疗性短肽GF8-001的目的抗体的通过一抗稀释液的稀释比例分别设置为1：200、1：1000、1：4000和1：10000。二抗采用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，稀释比例为1：3000。发光液采用Millipore公司生产的ECL发光液。

通过以上免疫印迹实验，专利申报者发现：该治疗性短肽的目的抗体能够与心室成纤维细胞的TRPC6特异性的结合，如图2所示：Neutralized-TRPC6表示GF8-001治疗性短肽的中和化的抗体；Anti-TRPC6表示GF8-001治疗性短肽的目的抗体；抗体稀释比例分别为1:200、1:1000、1:4000、1:10000。

进一步通过激光共聚焦显微镜法检测治疗性短肽GF8-001的目的抗体与心室成纤维细胞TRPC6的共定位情况，操作步骤如下：

1)分离乳鼠原代心室成纤维细胞，分离方法同前所述。2)将分离到的乳鼠原代心室肌细胞种植于激光共聚焦皿中。3)培养乳鼠原代心室成纤维细胞，培养所用到的培养基为包含10％胎牛血清的高糖完全培养基。4)待激光共聚焦皿中的原代心室成纤维细胞铺满皿底后弃去完全培养基，加入PBS清洗。5)采用破膜液破膜后加入4％多聚甲醛固定细胞。固定后弃去多聚甲醛，加入少许PBS，保持激光共聚焦皿底湿润。6)如前所述，治疗性短肽GF8-001的目的抗体种属来源为兔源性的抗体。利用PBS以1:200的比例稀释治疗性短肽GF8-001的目的抗体。将稀释后的目的抗体或者中和化抗体加入激光共聚焦皿中，使其刚好覆盖激光共聚焦皿的共聚焦孔底。4度孵育过夜。7)弃去该目的抗体或者中和化的抗体，用PBS清洗，加入FITC标记的山羊抗兔二抗，37度避光孵育1小时。8)PBS清洗后加入DAPI液，避光孵育10分钟。9)弃去DAPI液，PBS清洗后加入抗荧光淬灭剂封片。10)通过激光共聚焦显微镜分析治疗性短肽GF8-001的目的抗体(绿色荧光)与TRPC6的结合情况。

利用上述的免疫荧光实验揭示：治疗性短肽GF8-001的目的抗体能够与原代心室成纤维细胞的TRPC6通道特异性的结合，如图3所示：Neutralized-TRPC6表示GF8-001治疗性短肽的中和化的抗体；Anti-TRPC6表示GF8-001治疗性短肽的目的抗体；FITC标记的荧光二抗为山羊抗兔抗体；利用DAPI染细胞核。

通过钙内流实验确认治疗性短肽GF8-001的目的抗体能够有效的阻断心室成纤维细胞钙内流，操作步骤如下：

1)将提纯后的治疗性短肽GF8-001目的抗体、对照抗体与中和化抗体分别与分离培养的乳鼠原代心室成纤维细胞在384孔板中过夜孵育培养。2)应用荧光染料标记细胞，用多功能酶标仪加入ET-1 10^-9mol/L与Ang II10^-6mol/L，测定细胞内钙的变化，从而评估治疗性短肽GF8-001的目的抗体对乳鼠心室成纤维细胞胞浆钙内流的影响。

本发明专利钙内流实验的评估结果如图4所示：Δ[Ca²⁺]_i(nM)表示分别予以AngII和ET-1干预后各组细胞胞内钙离子较基础水平的最大增加值。Control-Anti表示治疗性短肽GF8-001的对照抗体；Anti-TRPC6表示治疗性短肽GF8-001的目的抗体；Neutralized-TRPC6表示治疗性短肽GF8-001的中和化的抗体。

成纤维细胞的增殖、迁移实验表明治疗性短肽GF8-001的目的抗体能够在离体水平抑制心室成纤维细胞的增殖与迁移。进一步通过血管紧张素II干预刺激心室成纤维细胞生长，团队发现：治疗性短肽GF8-001的目的抗体能够显著缓解血管紧张素II诱发的心室成纤维细胞生长。已知α-SMA可以反映心室成纤维细胞的增殖情况、其表达水平可用于评估心室纤维化。

评估心室纤维化的α-SMA免疫荧光染色操作步骤如下：

1)分离培养乳鼠心室成纤维细胞，方法同前。2)待心室成纤维细胞铺满激光共聚焦皿底后弃去完全培养基，用PBS清洗，弃去沉渣。3)利用破膜液冰上破膜。4)弃去破膜液，4％多聚甲醛固定细胞。细胞固定后弃去福尔马林，加入少许PBS维持皿底湿润。5)将ABCAM公司生产的兔源性α-SMA按1:150的比例稀释，加入激光共聚焦皿中，使其刚好覆盖皿底正中的激光共聚焦孔。6)4度孵育过夜，弃去一抗，PBS清洗后加入CY3标记的山羊抗兔荧光二抗，荧光二抗的稀释比例为1:2000。7)37度环境中二抗孵育1小时，弃去二抗。PBS清洗后加入DAPI染细胞核。8)DAPI液避光，37度环境下孵育10分钟。9)弃去DAPI液，PBS清洗后加入抗荧光淬灭剂避光保存。10)利用OLYMPUS激光共聚焦显微镜评价反映α-SMA表达水平的红色荧光强度，α-SMA的红色荧光强度越高，则心室纤维化程度越强。本专利发明能够有效降低α-SMA表达水平，抑制心室纤维化。

部分结果如图5和图6所示：α-SMA的荧光二抗采用CY3标记的山羊抗兔二抗，发射光为肉眼可见的明亮红色荧光；采用DAPI染核；将GF8-001中和化的抗体+Ang II组的红色荧光强度设置为1，采用相对于GF8-001中和化的抗体+Ang II组红色荧光强度的比值反映各组α-SMA的表达水平。

采用Western-Blotting实验评估治疗性短肽GF8-001对心室成纤维细胞表达TGF-β1、MMP-2、MMP-9的影响，步骤如下：

1)采用差速贴壁法分离、培养乳鼠原代心室成纤维细胞，方法同前，注意将心肌成纤维细胞接种、培养在75CM²的细胞培养瓶中。2)待心室成纤维细胞铺满细胞培养瓶后弃去完全培养基，用PBS清洗、去沉渣后弃去PBS。3)加入碧云天公司生产的RIPA强裂解液，采用细胞刮反复刮磨细胞培养瓶瓶底。在冰上裂解细胞。重复以上步骤6次。4)利用超声充分裂解细胞。收集裂解液。5)预冷离心机至4度，采用12000RPM离心15分钟左右，弃去沉淀。6)加入Loading Buffer后将裂解液煮沸。于负80度保存。7)按照碧云天公司配胶试剂盒的说明配置12％的分离胶以及5％的浓缩胶。8)采用BCA法测蛋白质浓度。9)蛋白质上样跑胶。注意对照组以及GF8-001短肽干预组的蛋白质上样浓度均为10μg/孔。电泳的电压设置初始值为70V，30分钟后改为120V。10)待溴酚蓝到底部后终止电泳。加入甲醇、配置转膜缓冲液并予以预冷。利用甲醇激活PVDF膜。11)小心裁取电泳后的胶和对应的PVDF膜，采用湿性转膜法在冰上进行转膜。采用恒压转膜操作：维持转膜电压在100V，相对应的转膜电流在180mA-220mA为宜。12)80分钟后终止转膜。参考Marker，根据目的条带的大致位置小心裁膜。予以TBST清洗后加入脱脂奶粉中室温孵育70分钟。13)采用一抗稀释液稀释一抗后加入相应的一抗(TGF-β1/MMP-2/MMP-9)，孵育裁剪后的PVDF膜，于4度环境下一抗孵育过夜。14)PBST清洗后，加入1：3000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，于37度孵育1小时。15)予以PBST清洗，加入ECL发光液，发光后测量各组的光密度值。

结果发现：针对TRPC6的治疗性短肽GF8-001的目的抗体能够有效抑制血管紧张素II诱发的心室成纤维细胞TGF-β1、MMP-2、MMP-9表达，可能具有进一步反馈性抑制心室纤维化发生、发展的作用，如图7所示：Western-Blotting法评估治疗性短肽GF8-001对心室成纤维细胞表达TGF-β1、MMP-2、MMP-9的影响。^*P<0.05vs Control-Anti组；P值小于0.05被视作有统计学差异；n＝6。

最后，通过荧光定量RT-PCR实验评价治疗性短肽GF8-001对心室成纤维细胞TNF-α、IL-1βmRNA表达的影响。

其中IL-1β设计的引物序列如下：The forward primer sequence(5'-3')：gagcaccttcttttccttcatctt(如SEQ ID NO.2)；The reverse primer sequences(5'-3')：tcacacaccagcaggttatcatc(如SEQ ID NO.3)。

TNF-α设计的引物序列如下：The forward primer sequence(5'-3')：atccgcgacgtggaactg(如SEQ ID NO.4)；The reverse primer sequences(5'-3')：accgcctggagttctggaa(如SEQ ID NO.5)。

β-actin设计的引物序列如下：The forward primer sequence(5'-3')：gctctggctcctagcaccat(如SEQ ID NO.6)；The reverse primer sequences(5'-3')：gccaccgatccacacagagt(如SEQ ID NO.7)。

后续的实验步骤如下：

1)利用RNA提取试剂盒(Solarbio R1200 Total RNA Extraction Kit)提取RNA。通过光度仪测定OD260/OD280，评估RNA的纯度。2)利用逆转录酶(AMV ReverseTranscriptase)进行逆转录，获取相应的cDNA。利用光度仪测定OD260/OD280，评估cDNA的纯度。3)配置PCR反应体系：上、下游引物各1μL，cDNA模板2.0μL，5XPCR缓冲液5μL，dNTPs 3μL，Taq DNA聚合酶1.5μL，双蒸水12.5μL。4)利用ABI7500 PCR仪，根据优化后的反应条件进行扩增，通过计算机自动分析软件绘制得到标准曲线，通过荧光定量RT-PCR测定上述基因的mRNA表达水平。

申报人通过荧光定量RT-PCR发现治疗性短肽GF8-001能够在离体水平有效降低血管紧张素II刺激引发的心室成纤维细胞炎性因子(TNF-α、IL-1β)的mRNA表达，推测该治疗性短肽可能具有减轻心室炎性因子释放、减轻心室肌炎性浸润的作用，进而能进一步有效缓解心室纤维化，结果如图8所示：^*P<0.05vs Null组(阴性对照组)；P值小于0.05被视作有统计学差异；n＝8。

5.在体实验验证

分别通过皮下填埋灌注Ang II的Alzet Osmotic Pump 2006构建慢性血管紧张素II干预模型、建立TAC模型、STZ+高脂构建混合型糖尿病模型分别构建Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠心室纤维化的病理模型。病理模型构建成功后将GF8-001短肽与载体耦联完全的疫苗(即治疗性短肽GF8-001)辅以福氏佐剂分时、多点皮下注射免疫模型SpragueDawley大鼠、BALB/C小鼠。采用Visual Sonics Vevo 770小动物高分辨率超声检测系统，通过M型心脏超声评估Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠心脏的LVESD、LVEDD、LVEF和LVFS提示：治疗性短肽GF8-001能够有效缓解病理刺激诱发的心脏重塑，改善心脏功能，如图9所示：LVESD代表左室收缩末期内径；LVEDD代表左室舒张末期内径；LVEF代表左室射血分数；LVFS代表左室短轴缩短率；^*P<0.05vs Control组；

vs DM组；

vs DM+GF8-001组；^§P<0.05vs TAC组；^#P<0.05vs TAC+GF8-001组；

vs Ang II组，n＝4。

采用Masson染色以及天狼星红染色评估治疗性短肽GF8-001对不同病理模型Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠心室纤维化的影响，Masson染色的方法如下：

1)将制备好的心室组织石蜡切片脱蜡。2)分别采用DD—H₂O和去离子水冲洗心室组织的石蜡切片。3)通过苏木精染液染核。4)再次采用DD—H₂O和去离子水冲洗切片。5)予以丽春红复红液染10分钟。6)给予2％冰醋酸溶液浸洗30秒钟。7)加入磷钼酸水溶液，予以分化5分钟。8)用苯胺蓝染切片，5分钟即可。9)再次用冰醋酸水溶液浸泡30秒钟。10)利用95％乙醇，无水乙醇，二甲苯透明以及中性树胶固定封片。

心室切片的天狼星红染色步骤如下：

1)利用二甲苯将石蜡切片脱蜡，采用酒精梯度法将切片依次脱水。2)加入预先配置好的天狼星红染液，染色15分钟。3)采用双蒸水冲洗切片。随后加入无水乙醇轻度洗涤。4)烘干切片后利用树胶封片。5)在体式显微镜下，分别通过白光以及偏振光评价心室纤维化的程度以及纤维组织中I型胶原纤维、III型胶原纤维的比例。

通过以上的Masson染色和天狼星红染色，申报者发现治疗性短肽GF8-001能够有效改善病理刺激诱发的心室纤维化，如图10、11所示：图10表示各组小鼠心室纤维化的面积占心室总面积的百分比；^*P<0.05vs Control组；

vs DM组；

vs DM+GF8-001组；^§P<0.05vs TAC组；^#P<0.05vs TAC+GF8-001组；

vs Ang II组，n＝4。图11表示通过偏振光评估通过天狼星红染色的各组小鼠心室纤维化的面积和程度、I型胶原纤维和III型胶原纤维的分布(I型胶原纤维呈红色或者黄色两种颜色；III胶原纤维型呈淡绿色)。

进一步通过H&E染色评价治疗性短肽GF8-001短肽对病理刺激诱发SpragueDawley大鼠、BALB/C小鼠心室病理改变以及炎性细胞浸润的影响。实验步骤如下：

1)采用二甲苯将心室石蜡切片脱蜡；2)依次采用无水乙醇以及85％的乙醇洗涤切片；3)用蒸馏水清洗切片；4)利用苏木精染6min；5)利用蒸馏水洗去苏木精；6)通过盐酸乙醇分化后再次采用双蒸水洗涤切片；7)PBS洗涤后，利用伊红液染切片3分钟左右；8)按照85％—95％—100％的乙醇梯度进行分化；9)顺序采用石炭酸二甲苯以及二甲苯(I)、二甲苯(II)、二甲苯(III)处理切片；10)利用中性树胶封片。采用体式显微镜拍片。

H&E染色结果揭示：治疗性短肽GF8-001能够减轻病理刺激诱发的心室单核细胞以及淋巴细胞的浸润，如图12所示：H&E染色的淡染区域表示发生病理改变的区域；心肌细胞核的排列紊乱以及炎性细胞的浸润反映心室组织的病理改变程度以及炎症水平。

专利申报团队通过Western-Blotting以及RT-PCR法进一步评价治疗性短肽GF8-001对病理刺激诱发Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠心室TGF-β1、MMP-9蛋白质表达以及IL-1β、TNF-αmRNA表达的影响，Western-Blottin和RT-PCR的实验方法同前所述。结果发现：治疗性短肽GF8-001能够有效缓解病理刺激诱发的Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠心室TGF-β1、MMP-9表达升高，并且能够逆转病理刺激引起的Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠心室IL-1β、TNF-αmRNA的升高，具有良好的抗心室纤维化的作用。

通过免疫组化进一步评价治疗性短肽GF8-001对病理模型Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠心室的IL-1β、TNF-α表达影响，实验方法如下：

1)依次采用二甲苯与无水乙醇将心室的石蜡切片脱蜡、去水，用清水稍冲洗；2)采用预先配置的柠檬酸抗原修复液对切片进行抗原修复。注意微波炉煮沸过程中避免引发干片；3)将修复后的切片冷却，在1XPBS缓冲液中洗涤；4)利用过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶的表达，避光孵育后将切片浸入PBS缓冲液中洗涤；5)在室温下，加入抗原封闭液充分封闭1小时；6)清水冲洗，弃去抗原封闭液。加入按比例稀释的一抗，在4度环境下孵育过夜；7)清水冲洗以弃去1抗。切片甩干后加入HRP标记的二抗，37度环境下避光孵育60分钟；8)弃去二抗，PBS冲洗，加入预先配置好的DAB液，进行染色。合理控制DAB染色时间，胞浆内出现明显棕黄色颗粒即可终止染色；9)利用预先配好的苏木素液染细胞核，返蓝后采用蒸馏水清洗；10)序贯的加入梯度乙醇以及二甲苯，进行脱水，脱水后将心室切片从二甲苯中取出，晾干，利用树胶封片后长期保存。

采用免疫组化法评估Sprague Dawley大鼠、BALB/C小鼠心室IL-1β、TNF-α表达的实验揭示：治疗性短肽GF8-001能够有效逆转病理刺激诱发的心室IL-1β、TNF-α表达水平的升高，从而缓解心室炎性浸润，进一步改善心肌纤维化。如图13、14所示：IL-1β以及TNF-α免疫组化分析的统计学方法采用中国病理学会免疫组织化学技术方法和诊断指南中采用的4步分级系统进行评分后将—作为免疫组化阴性结果；将+、++、+++视为阳性结果；^*P<0.05vsControl组；

vs DM组；

vs DM+GF8-001组；^§P<0.05vs TAC组；^#P<0.05vs TAC+GF8-001组；

vs Ang II组，n＝4。

6.治疗性短肽GF8-001的在体安全性评估：实验结束后，留取肾脏、肝脏、肺部、心脏等重要组织器官。通过病理切片行病理检测，采用免疫组化法检测各组织器官中单核—巨噬细胞(表面抗原CD14、CD68作为标记)、B淋巴细胞(表面抗原CD19、CD20作为标记)等的浸润情况，评价各组织器官有无免疫损伤。免疫组化的实验步骤同上所述。结果发现：治疗性短肽GF8-001对各重要组织器官没有造成明显的免疫损伤，该短肽的在体安全性良好，可能具有重大的临床应用前景与价值。采用免疫组化法评估各组织器官内巨噬细胞及炎性细胞浸润的实验结果如图15-18所示：图中心室组织内含有深棕色颗粒的细胞代表相应的免疫组化阳性细胞。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

<110> 西安交通大学

<120> 一种胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性短肽及其疫苗和抗心室纤维化的制药应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ala Lys Gln Asn Glu Ala Phe

1 5

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagcaccttc ttttccttca tctt 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcacacacca gcaggttatc atc 23

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atccgcgacg tggaactg 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accgcctgga gttctggaa 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctctggctc ctagcaccat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccaccgatc cacacagagt 20

<210> 8

<211> 931

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Ser Gln Ser Pro Ala Phe Gly Pro Arg Arg Gly Ser Ser Pro Arg

1 5 10 15

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Arg Arg Asn Glu Ser Gln Asp Tyr Leu

20 25 30

Leu Met Asp Ser Glu Leu Gly Glu Asp Gly Cys Pro Gln Ala Pro Leu

35 40 45

Pro Cys Tyr Gly Tyr Tyr Pro Cys Phe Arg Gly Ser Asp Asn Arg Leu

50 55 60

Ala His Arg Arg Gln Thr Val Leu Arg Glu Lys Gly Arg Arg Leu Ala

65 70 75 80

Asn Arg Gly Pro Ala Tyr Met Phe Ser Asp Arg Ser Thr Ser Leu Ser

85 90 95

Ile Glu Glu Glu Arg Phe Leu Asp Ala Ala Glu Tyr Gly Asn Ile Pro

100 105 110

Val Val Arg Lys Met Leu Glu Glu Cys His Ser Leu Asn Val Asn Cys

115 120 125

Val Asp Tyr Met Gly Gln Asn Ala Leu Gln Leu Ala Val Ala Asn Glu

130 135 140

His Leu Glu Ile Thr Glu Leu Leu Leu Lys Lys Glu Asn Leu Ser Arg

145 150 155 160

Val Gly Asp Ala Leu Leu Leu Ala Ile Ser Lys Gly Tyr Val Arg Ile

165 170 175

Val Glu Ala Ile Leu Ser His Pro Ala Phe Ala Glu Gly Lys Arg Leu

180 185 190

Ala Thr Ser Pro Ser Gln Ser Glu Leu Gln Gln Asp Asp Phe Tyr Ala

195 200 205

Tyr Asp Glu Asp Gly Thr Arg Phe Ser His Asp Val Thr Pro Ile Ile

210 215 220

Leu Ala Ala His Cys Gln Glu Tyr Glu Ile Val His Thr Leu Leu Arg

225 230 235 240

Lys Gly Ala Arg Ile Glu Arg Pro His Asp Tyr Phe Cys Lys Cys Asn

245 250 255

Asp Cys Asn Gln Lys Gln Lys His Asp Ser Phe Ser His Ser Arg Ser

260 265 270

Arg Ile Asn Ala Tyr Lys Gly Leu Ala Ser Pro Ala Tyr Leu Ser Leu

275 280 285

Ser Ser Glu Asp Pro Val Met Thr Ala Leu Glu Leu Ser Asn Glu Leu

290 295 300

Ala Val Leu Ala Asn Ile Glu Lys Glu Phe Lys Asn Asp Tyr Lys Lys

305 310 315 320

Leu Ser Met Gln Cys Lys Asp Phe Val Val Gly Leu Leu Asp Leu Cys

325 330 335

Arg Asn Thr Glu Glu Val Glu Ala Ile Leu Asn Gly Asp Val Glu Thr

340 345 350

Leu Gln Ser Gly Asp His Gly Arg Pro Asn Leu Ser Arg Leu Lys Leu

355 360 365

Ala Ile Lys Tyr Glu Val Lys Lys Phe Val Ala His Pro Asn Cys Gln

370 375 380

Gln Gln Leu Leu Ser Ile Trp Tyr Glu Asn Leu Ser Gly Leu Arg Gln

385 390 395 400

Gln Thr Met Ala Val Lys Phe Leu Val Val Leu Ala Val Ala Ile Gly

405 410 415

Leu Pro Phe Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Phe Ala Pro Cys Ser Lys Met

420 425 430

Gly Lys Ile Met Arg Gly Pro Phe Met Lys Phe Val Ala His Ala Ala

435 440 445

Ser Phe Thr Ile Phe Leu Gly Leu Leu Val Met Asn Ala Ala Asp Arg

450 455 460

Phe Glu Gly Thr Lys Leu Leu Pro Asn Glu Thr Ser Thr Asp Asn Ala

465 470 475 480

Lys Gln Leu Phe Arg Met Lys Thr Ser Cys Phe Ser Trp Met Glu Met

485 490 495

Leu Ile Ile Ser Trp Val Ile Gly Met Ile Trp Ala Glu Cys Lys Glu

500 505 510

Ile Trp Thr Gln Gly Pro Lys Glu Tyr Leu Phe Glu Leu Trp Asn Met

515 520 525

Leu Asp Phe Gly Met Leu Ala Ile Phe Ala Ala Ser Phe Ile Ala Arg

530 535 540

Phe Met Ala Phe Trp His Ala Ser Lys Ala Gln Ser Ile Ile Asp Ala

545 550 555 560

Asn Asp Thr Leu Lys Asp Leu Thr Lys Val Thr Leu Gly Asp Asn Val

565 570 575

Lys Tyr Tyr Asn Leu Ala Arg Ile Lys Trp Asp Pro Ser Asp Pro Gln

580 585 590

Ile Ile Ser Glu Gly Leu Tyr Ala Ile Ala Val Val Leu Ser Phe Ser

595 600 605

Arg Ile Ala Tyr Ile Leu Pro Ala Asn Glu Ser Phe Gly Pro Leu Gln

610 615 620

Ile Ser Leu Gly Arg Thr Val Lys Asp Ile Phe Lys Phe Met Val Ile

625 630 635 640

Phe Ile Met Val Phe Val Ala Phe Met Ile Gly Met Phe Asn Leu Tyr

645 650 655

Ser Tyr Tyr Ile Gly Ala Lys Gln Asn Glu Ala Phe Thr Thr Val Glu

660 665 670

Glu Ser Phe Lys Thr Leu Phe Trp Ala Ile Phe Gly Leu Ser Glu Val

675 680 685

Lys Ser Val Val Ile Asn Tyr Asn His Lys Phe Ile Glu Asn Ile Gly

690 695 700

Tyr Val Leu Tyr Gly Val Tyr Asn Val Thr Met Val Ile Val Leu Leu

705 710 715 720

Asn Met Leu Ile Ala Met Ile Asn Ser Ser Phe Gln Glu Ile Glu Asp

725 730 735

Asp Ala Asp Val Glu Trp Lys Phe Ala Arg Ala Lys Leu Trp Phe Ser

740 745 750

Tyr Phe Glu Glu Gly Arg Thr Leu Pro Val Pro Phe Asn Leu Val Pro

755 760 765

Ser Pro Lys Ser Leu Phe Tyr Leu Leu Leu Lys Leu Lys Lys Trp Ile

770 775 780

Ser Glu Leu Phe Gln Gly His Lys Lys Gly Phe Gln Glu Asp Ala Glu

785 790 795 800

Met Asn Lys Ile Asn Glu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Leu Gly Ser His

805 810 815

Glu Asp Leu Ser Lys Leu Ser Leu Asp Lys Lys Gln Val Gly His Asn

820 825 830

Lys Gln Pro Ser Ile Arg Ser Ser Glu Asp Phe His Leu Asn Ser Phe

835 840 845

Asn Asn Pro Pro Arg Gln Tyr Gln Lys Ile Met Lys Arg Leu Ile Lys

850 855 860

Arg Tyr Val Leu Gln Ala Gln Ile Asp Lys Glu Ser Asp Glu Val Asn

865 870 875 880

Glu Gly Glu Leu Lys Glu Ile Lys Gln Asp Ile Ser Ser Leu Arg Tyr

885 890 895

Glu Leu Leu Glu Glu Lys Ser Gln Asn Thr Glu Asp Leu Ala Glu Leu

900 905 910

Ile Arg Glu Leu Gly Glu Lys Leu Ser Met Glu Pro Asn Gln Glu Glu

915 920 925

Thr Asn Arg

930

<210> 9

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Tyr Tyr Ile Gly Ala Lys Gln Asn Glu Ala Phe Thr Thr Val Glu Glu

1 5 10 15

Ser Phe Lys Thr Leu

20

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ile Gly Ala Lys Gln Asn Glu Ala Phe Thr Thr

1 5 10

Claims (9)

1.一种胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性短肽，其特征在于，该短肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性载体疫苗，其特征在于，该疫苗由权利要求1所述的短肽与载体耦联而成。

3.如权利要求2所述的胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性载体疫苗，其特征在于，该疫苗由权利要求1所述的短肽与血蓝蛋白KLH通过戊二醛耦联法耦联成的具有完全抗原特征的载体疫苗，即短肽半抗原GF8-001-耦联载体蛋白。

4.权利要求1所述的胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性短肽或权利要求2或3所述的胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性载体疫苗在制备抗心室纤维化药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制心室成纤维细胞的增殖、阻止心室肌纤维化、改善心室重构的药物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过阻遏心室成纤维细胞上的TRPC6通道、阻断心室成纤维细胞的胞浆钙内流，从而抑制心室成纤维细胞的增殖、阻止心室肌纤维化、改善心室重构的药物。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制心室成纤维细胞分泌的TGF-β1、MMP-2、MMP-9、TNF-α或IL-1β的药物。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过抑制促炎性因子、促纤维化因子的释放反馈性的改善心脏功能与缓解左室重构的药物。

9.一种抗心室纤维化的药物，其特征在于，由权利要求2或3所述的胞膜瞬时受体电位C6通道免疫原性载体疫苗添加药学上可接受的辅料制成。

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