CN113069560A - 一种聚乙二醇修饰的黑磷量子点在评价uuo诱导的肾纤维化方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇修饰的黑磷量子点的UUO诱导的肾纤维化的评价方法，采用液相超声刻蚀法制备黑磷量子点，并通过聚乙二醇(PEG)的修饰改善了黑磷量子点(BPQDs)的生物相容性，由于聚乙二醇‑黑磷量子点具有良好的光声成像效果，且粒径在5nm以下，可以通过肾小球滤过膜，因此将其作为光声成像造影剂来评价UUO诱导的肾纤维化。本发明的优点在于：PEG‑BPQDs不仅具有很高的肾脏清除效率和良好的生物相容性，而且采用光声成像系统可以实时、无创地监测活体小鼠的UUO诱导的肾纤维化，在生物成像方面具有广阔的应用前景。

Description

一种聚乙二醇修饰的黑磷量子点在评价UUO诱导的肾纤维化 方面的应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰的黑磷量子点在评价UUO诱导的肾纤维化方面的应用。

背景技术

UUO(单侧输尿管结扎)诱导的肾纤维化是指由多种疾病引起肾小球滤过率下降、肾脏结构和功能呈不可逆转、渐进性进展并最终发展为终末期肾病的综合征。根据UUO诱导的肾纤维化发生发展进程和肾细胞损伤的主要生物学特点，设计符合UUO诱导的肾纤维化检测的新评价方法，达到肾损伤快速且精准检测的，为UUO诱导的肾纤维化检测方法的提升和完善以及药物安全性评价提供了一套新的研究思路。

光声成像是近些年来新兴的一种无损医学成像方法，是根据生物组织对光的吸收分布来反演组织结构的一种成像模式。光声成像技术检测的是超声信号，反映的是光能量吸收的差异，结合光学和超声这两种成像技术各自的优点，能实现对组织体较大深度的高分辨率、高对比度的功能成像。

通过光声成像实时监测UUO诱导的肾纤维化，能够对UUO诱导的肾纤维化进行及早诊断，而且可以及时进行肾脏保护性干预措施，以防止进展为严重并发症。然而，肾脏功能实时光学成像的关键挑战在于开发具有高肾脏清除率光学药物。

黑磷作为一种新兴的二维层状材料，具有良好的光学性能，如优异的电子迁移率、层数相关的带隙值和高的光响应性。而纳米级的黑磷量子点具有褶皱结构及其沿Z字形方向的双层结构，其褶皱的结构使黑磷量子点具有更高的比表面积。但是黑磷量子点很容易与水和氧气作用而降解，且与生物相容性差，目前还没有将黑磷量子点应用到肾纤维化方面成像系统中的报道。因此，需要提供一种能更好的应用于光学成像的黑磷量子点。

发明内容

为解决现有技术中的黑磷量子点很容易与水和氧气作用而降解，从而影响光声成像实时监测效果的技术问题，本发明提供一种聚乙二醇修饰的黑磷量子点及其制备方法和在评价UUO诱导的肾纤维化中的应用。本发明的制备方法简便易行，成本低，制备得到的聚乙二醇修饰的黑磷量子点具有稳定性好，粒径分布均匀且小于5nm，通过聚乙二醇的表面修饰以提高其水分散体中的稳定性，及生物相容性，从而改善其光学性质及应用性能，能更好的应用于光学成像。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种粒径均匀的聚乙二醇修饰的黑磷量子点。

进一步的，所述的聚乙二醇修饰的黑磷量子点的粒径为1～5nm。

本发明的第二个目的是提供前述的聚乙二醇修饰的黑磷量子点在评价慢性肾损伤方面的应用；

在某个特定的实施例中，所述慢性肾损伤为单侧输尿管结扎(UUO)诱导的肾纤维化。

进一步的，所述的聚乙二醇修饰的黑磷量子点通过以下方法制备得到：

(1)在冰浴条件下，取黑磷晶体加入放有饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮，研磨至液体颜色发黑浑浊；

优选的，步骤(1)中黑磷晶体在放有饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮中的浓度为2～5mg/mL；

进一步优选的，步骤(1)中黑磷晶体在放有饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮中的浓度为5mg/mL；

(2)将步骤(1)得到的黑色浑浊产物转入放有饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮，用细胞超声破碎仪进行超声；超声后，进行第一次离心，收集上清液；将收集到的上清液进行第二次离心，收集沉淀物，即为黑磷量子点BPQDs；

优选的，步骤(2)中黑色浑浊产物在放有饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮中的浓度为：以黑磷晶体计1～2mg/mL；

(3)将步骤(2)得到的黑磷量子点BPQDs加入NH₂-PEG1000超声，离心，离心后收集沉淀得到聚乙二醇修饰的黑磷量子点PEG-BPQDs；

优选的，步骤(3)中所述黑磷量子点BPQDs与NH₂-PEG1000的质量比例为1：200。

进一步的，步骤(2)中超声功率为350W，超声振幅为80％，超声程序为：总时间3h，优选的，超声程序为：总时间3h，每超声5s间歇5s。

进一步的，步骤(2)中所述第一次离心的条件为4℃，7000rpm离心60min；第二次离心的条件为4℃，13000rpm离心60min。

进一步的，步骤(3)中所述超声时间为6h，离心的条件为4℃，13000rpm离心20min。

进一步的，所述的聚乙二醇修饰的黑磷量子点的粒径为1～5nm。

进一步的，将聚乙二醇修饰的黑磷量子点静脉注射入待评价个体体内，立即采用光声-超声双模态成像的方法，持续观测待评价个体肾脏光声信号，利用所述光声信号的强弱对UUO诱导的肾纤维化程度作出评价，光声信号强代表聚乙二醇修饰的黑磷量子点在肾脏中富集，光声信号弱代表聚乙二醇修饰的黑磷量子点在肾脏中清除，进而代表肾脏损伤的严重程度；优选的，所述待评价个体为人或小鼠。所述聚乙二醇修饰的黑磷量子点作为光声成像造影剂来评价肾脏损伤程度。

进一步的，所述的聚乙二醇修饰的黑磷量子点受激光激发，在680～970nm处有光声信号；且在680nm处有最大光声信号。

进一步的，所述光声-超声双模态成像的方法为采用

光声-超声双模态成像系统，其中光声条件为：光声采集方式(PA Acquisition)：Single，响应门(Resp Gate)：Off，能量伐(Correct Energy)：on，频率(Frequency)：21MHz，帧延迟(Frame Delay)：4，光声参数(PA-Mode Gain)：30dB；B超模式参数(B-Mode Gain)：20dB，持续时间(Persisitence)：6，波长(Wavelength)：680nm，扫描深度(Depth)：12mm。所述光声-超声双模态成像时长为120min。所述光声-超声双模态成像是在注射完聚乙二醇修饰的黑磷量子点后，立即成像。

进一步的，待评价个体为人时，聚乙二醇修饰的黑磷量子点的注射剂量为0.1～0.8mg/kg；待评价个体为小鼠时，聚乙二醇修饰的黑磷量子点的注射剂量为200ppm。

本发明的有益效果在于：

本发明的制备方法简便易行，成本低，制备得到的聚乙二醇修饰的黑磷量子点(PEG-BPQDs)的稳定性好，粒径分布均匀，通过聚乙二醇的表面修饰以提高黑磷量子点水分散体中的稳定性，从而改善聚乙二醇修饰的黑磷量子点的光学性质及应用性能，能更好的应用于光学成像。将制备得到的的PEG-BPQDs作为光声成像造影剂来评价UUO诱导的肾纤维化程度，光声成像效果良好且具有良好的生物相容性，由于其粒径小于5nm，可以通过肾小球滤过膜，具有很高的肾脏清除效率，该评价方法操作简单，易于推广，在生物成像方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明PEG-BPQDs的紫外吸收光谱图；

图2为本发明PEG-BPQDs的透射电镜图；

图3为本发明BPQDs和PEG-BPQDs对H9C2和HepG-2细胞的毒性实验结果；

其中，图3A为H9C2细胞存活率，图3B为HepG-2细胞存活率；

图4为本发明PEG-BPQDs的生物相容性实验结果；

图5为本发明PEG-BPQDs和空白溶剂仿体试验中光声信号随波长变化图；

图6为本发明PEG-BPQDs在UUO模型小鼠肾脏区域的光声成像图以及光声信号值随时间变化图；

其中，图6A为本发明PEG-BPQDs在UUO模型小鼠肾脏区域的光声成像图，图6B为本发明PEG-BPQDs在UUO模型小鼠肾脏区域的光声信号值变化图；

图7为本发明实施例7中小鼠肾脏H&E染色的组织学图像。

具体实施方式

本发明所述UUO是指单侧输尿管结扎；

本发明所述PEG是指聚乙二醇；

本发明所述BPQDs是指黑磷量子点；

本发明所述PEG-BPQD是指聚乙二醇修饰的黑磷量子点；

本发明所述BP是指黑磷晶体；

本发明所述NMP是指N-甲基吡咯烷酮。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不应视为对本发明范围的限制。

实施例1制备PEG-BPQDs：

一种聚乙二醇修饰的黑磷量子点的制备方法，其特征在于：采用液相超声刻蚀法制备黑磷量子点。

(1)在冰浴条件下，取25mg黑磷晶体(厂家：江苏先丰纳米材料科技有限公司；NO:XF161；货号：100944；批号：62897799)，加入5mL饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮(NMP)于研钵中研磨至液体颜色发黑浑浊，

(2)将步骤(1)得到的黑色浑浊产物转入15mL放有饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮(NMP)，使黑磷晶体在放有饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮中的浓度为1.25mg/mL。用400W细胞超声破碎仪进行超声，功率为350W，超声振幅为80％，超声5s，间歇5s，连续超声3h。超声后，4℃，7000rpm离心60min，收集上清液，随后，4℃，13000rpm离心60min，收集沉淀物，得到0.022mg黑磷量子点(Black phosphorus quantum dots，BPQDs)。

(3)将步骤(2)得到的黑磷量子点BPQDs加入浓度为5mg/mL NH₂-PEG1000超声6h，5mg/mL NH₂-PEG1000用量为：4.4mg，超声结束后离心：13000rpm，4℃，20min，收集沉淀得到PEG-BPQDs，并加蒸馏水溶解至1mg/mL。

实施例2对本发明中的PEG-BPQDs进行形态和性质测试：

取实施例1步骤2制备得到的聚乙二醇修饰的黑磷量子点PEG-BPQDs进行紫外吸收测试，以实验用水为参比，使用石英比色皿，测定在400～900nm的紫外可见吸收光谱。图1为PEG-BPQDs的紫外吸收图谱，证明了本发明制备的PEG-BPQDs具有较强的光吸收性能，光声的测定范围为680～970nm，且PEG-BPQDs在680nm处有紫外吸收，可以用于光声成像。

进一步，通过透射电子显微镜观察实施例1制备的PEG-BPQDs形态，取PEG-BPQDs的上清液，用滴管滴加少量在超薄碳膜上，在空气中使其自然风干。图2为PEG-BPQDs的透射电镜图(TEM)，电镜下的PEG-BPQDs分散均匀，呈比较规则的球状，其直径约为1～5nm。

实施例3对本发明BPQDs与PEG-BPQDs细胞毒性考察：

将大鼠心肌细胞H9C2细胞(江苏凯基生物技术股份有限公司)和人肝肿瘤细胞株HepG-2细胞(江苏凯基生物技术股份有限公司)以每孔1×10⁴个细胞接种96孔板中，其中每孔200μL培养液，边缘孔用无菌磷酸缓冲溶液(PBS)填充，在37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，倒置显微镜下观察细胞形态，确保细胞生长状态良好。吸掉培养液并用PBS冲洗后，加入20μL不同浓度梯度(25、50、100、150、200ppm)的实施例1步骤2制备的BPQDs或PEG-BPQDs溶液和180μL的DMEM培养基，继续37℃孵育24h。孵育结束后在每个孔中分别加□200μL四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液(0.5mg/mL)，37℃下孵育4h，吸掉MTT溶液，加入150μL二甲基亚砜(DMSO)到每个孔中进行溶解，振摇10min。把96孔板放置在酶标仪上，在检测波长570nm和参考波长650nm的双波长下分别读取每个孔中溶液的吸光度值。

细胞存活率(cell viability)(％)＝(样品的OD值/空白OD值)X 100％，

实验结果如图3所示。PEG-BPQDs与细胞共培养24h，细胞存活率均大于90％，且相对于常规BPQDs，本发明制备的PEG-BPQDs的生物相容性显著提升。

实施例4对本发明PEG-BPQDs的生物相容性分析：

选用雄性ICR小鼠，分为空白组和实验组，空白组单次尾静脉注射200μL生理盐水，实验组单次尾静脉注射等体积的实施例1中的PEG-BPQDs(200ppm)。空白组和实验组小鼠尾静脉注射后24h采用引颈法处理后，迅速剥离心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠，用4％多聚甲醛(4g多聚甲醛固体溶于100mLPBS中)固定。取固定好的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠，包埋，制作石蜡切片，常规H&E染色，用数字病理切片扫描仪观察切片组织的病理改变，结果如图4所示，实验组心、肝、脾、肺、肾、肠组织形态良好，无明显异常，进一步证明了PEG-BPQDs具有良好的生物相容性。

实施例5对实施例1制备的的PEG-BPQDs进行仿体试验：

为了检测PEG-BPQDs的光声成像能力，进行了体外仿体试验。用四氟毛细管分别吸取200ppm的PEG-BPQDs和相同体积的蒸馏水，置于光声成像仪平台上，以680～970nm波长激光辐照，采集光声图像，并记录光声信号值。图5显示了PEG-BPQDs和空白组在680～970nm的光声信号强度，与空白组相比，PEG-BPQDs在680nm处出现了最大光声信号，而其他波长下无明显变化。

实施例6UUO肾纤维化模型小鼠构建：

选用雄性ICR小鼠(n＝3)，用质量-体积比4％水合氯醛0.1mL/10g腹腔注射麻醉小鼠后，结扎小鼠左侧输尿管，建立单侧输尿管结扎模型(UUO模型)。

实施例7体内UUO肾纤维化小鼠光声成像：

将实施例6中的所有小鼠在结扎小鼠左侧输尿管第14天麻醉后，通过尾静脉注射将200ppm实施例1制备的PEG-BPQDs注入小鼠体内，立即采用

光声-超声双模态成像系统，先采用超声模式“B-Mode”，找到肾脏部分，再利用光声成像系统中的“PA-Mode”，其中光声条件为：光声采集方式(PA Acquisition)：Single，响应门(Resp Gate)：Off，能量伐(Correct Energy)：on，频率(Frequency)：21MHz，帧延迟(Frame Delay)：4，光声参数(PA-Mode Gain)：30dB；B超模式参数(B-Mode Gain)：20dB，持续时间(Persisitence)：6，波长(Wavelength)：680nm，扫描深度(Depth)：12mm，对肾脏区域光声信号变化进行120min的检测，结果如图6所示，第5分钟时，右肾比左肾的信号强，因为右肾为正常组织，肾血流量大，代谢较快，则PEG-BPQDs可以快速通过肾小球滤过膜；而左肾损伤状态，代谢缓慢，血流量相对较小，光声信号较弱。随着检测时间的增加，左肾的光声信号明显比右肾增强，表明PEG-BPQDs富集到了左肾中，无法从输尿管排出体外，进一步说明了PEG-BPQDs具有良好的光声成像效果，可以作为光声成像造影剂来评价UUO诱导的肾纤维化程度。

实施例8单侧输尿管结扎对小鼠肾脏病理切片的影响：

取结扎4、7、14天小鼠的左右肾组织样本，采用H&E染色法对肾组织样本染色后，置于数字切片扫描仪成像，结果如图7所示，表明随着结扎天数的增加，左肾的肾小球逐渐萎缩，肾小管明显变性，肾损伤程度相比右肾明显加重，该结果与光声成像的结果相同，进一步验证了光声成像系统可以实时、原位、灵敏对UUO诱导的肾纤维化进行检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换，这些改进和变换应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇修饰的黑磷量子点在评价慢性肾损伤方面的应用；优选的，所述慢性肾损伤为单侧输尿管结扎诱导的肾纤维化。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的聚乙二醇修饰的黑磷量子点通过以下方法制备得到：

(1)在冰浴条件下，取黑磷晶体加入放有饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮，研磨至液体颜色发黑浑浊；

优选的，步骤(1)中黑磷晶体在放有饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮中的浓度为2～5mg/mL；进一步优选的，步骤(1)中黑磷晶体在放有饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮中的浓度为5mg/mL；

(2)将步骤(1)得到的黑色浑浊产物转入放有饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮，用细胞超声破碎仪进行超声；超声后，进行第一次离心，收集上清液；将收集到的上清液进行第二次离心，收集沉淀物，即为黑磷量子点BPQDs；

优选的，步骤(2)中黑色浑浊产物在放有饱和氢氧化钠的N-甲基吡咯烷酮中的浓度为：以黑磷晶体计1～2mg/mL；

(3)将步骤(2)得到的黑磷量子点BPQDs加入NH₂-PEG1000超声，离心，离心后收集沉淀得到聚乙二醇修饰的黑磷量子点PEG-BPQDs；

优选的，步骤(3)中所述黑磷量子点BPQDs与NH₂-PEG1000的质量比例为1：200。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中超声功率为350W，超声振幅为80％，超声程序为：总时间3h，优选的，超声程序为：总时间3h，每超声5s间歇5s。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述第一次离心的条件为4℃，7000rpm离心60min；第二次离心的条件为4℃，13000rpm离心60min。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(3)中超声时间为6h，离心的条件为4℃，13000rpm离心20min。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的聚乙二醇修饰的黑磷量子点的粒径为1～5nm。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将聚乙二醇修饰的黑磷量子点静脉注射入待评价个体体内，立即采用光声-超声双模态成像的方法，持续观测待评价个体肾脏光声信号，利用所述光声信号的强弱对UUO诱导的肾纤维化程度作出评价，光声信号强代表聚乙二醇修饰的黑磷量子点在肾脏中富集，光声信号弱代表聚乙二醇修饰的黑磷量子点在肾脏中清除，进而代表肾脏损伤的严重程度；优选的，所述待评价个体为人或小鼠。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的聚乙二醇修饰的黑磷量子点受激光激发，在680～970nm处有光声信号；且在680nm处有最大光声信号。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述光声-超声双模态成像的方法为采用

光声-超声双模态成像系统，其中光声条件为：光声采集方式：Single，响应门：Off，能量伐：on，频率：21MHz，帧延迟：4，光声参数：30dB；B超模式参数：20dB，持续时间：6，波长：680nm，扫描深度：12mm，所述光声-超声双模态成像时长为120min。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，待评价个体为人时，聚乙二醇修饰的黑磷量子点的注射剂量为0.1～0.8mg/kg；待评价个体为小鼠时，聚乙二醇修饰的黑磷量子点的注射剂量为200ppm。

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