CN113056207A - 用于改善肠道成熟的天然乳清蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于(a)改善肠道成熟;和/或(b)降低和/或预防肠道渗透性的天然乳清蛋白。发明人发现,天然乳清蛋白提供对肠道成熟和渗透性的有益作用。
Description
技术领域
本发明涉及用于(a)改善肠道成熟;和/或(b)降低和/或预防肠道渗透性的天然乳清制品领域,特别是婴儿配方物。
背景技术
胎儿在出生前会通过胎盘获得源源不断的母体元素营养。出生后,新生儿必须适应从乳中摄取的各种营养素,所述营养素只有在胃肠道(GIT) 中发生专门的消化过程后才能利用。用于肠内营养素摄入的GIT的最终成熟发生在足月前不久或之后。早产婴儿的消化系统通常尚未完全发育,这种弱势婴儿还需要额外的营养素以用于其生长和发育。促进肠道成熟并降低或减少肠道渗透性被认为是对足月婴儿和早产婴儿的发育有益。
本发明提供本领域中需要的用于改善肠道成熟并降低和/或预防肠道渗透性的天然乳清蛋白级分,其与常规肠内喂养方案完全相容并适合包括在婴儿配方物中。
发明内容
发明人出乎意料地发现,根据本发明的天然乳清蛋白显著改善肠道成熟并降低肠道渗透性的发生。天然乳清蛋白通常包含在营养组合物中,优选婴儿配方物如早产儿配方物中。本发明涉及根据本发明的天然乳清蛋白用于(a)改善肠道成熟;和/或(b)降低和/或预防肠道渗透性的用途。
在一个优选的实施方案中,乳清蛋白的天然性(nativity)超过80%,优选超过90%,更优选超过92%,超过94%,超过95%或甚至超过98%。优选地,乳清蛋白中基本上不存在非天然乳清蛋白。如果乳清蛋白包含在营养组合物中,则这适用于营养组合物中的所有乳清蛋白。
在一个优选的实施方案中,乳清蛋白为完整乳清蛋白。完整是指乳清蛋白未进行水解步骤。因此,作为乳清蛋白,基本上不存在不完整的乳清蛋白。如果乳清蛋白包含在营养组合物中,则这适用于营养组合物中的所有乳清蛋白。
在一个实施方案中,乳清蛋白包含在婴儿配方物中且婴儿配方物经巴氏杀菌,或至少其蛋白质级分经巴氏杀菌。出乎意料地,本发明的发明人已经示出了,具有天然乳清蛋白的婴儿配方物——根据本发明获得,包括巴氏杀菌步骤——可用于改善肠道成熟并降低和/或预防肠道渗透性。换言之,婴儿配方物基本上没有碱性磷酸酶活性。在一个优选的实施方案中,婴儿配方物是液体的即食的婴儿配方物,其基本上没有碱性磷酸酶活性。在一个优选的实施方案中,术语基本上没有碱性磷酸酶活性是指,当使用液体的即食的婴儿配方物测量时,碱性磷酸酶活性低于350mU/L。
在一个替代的优选实施方案中,乳清蛋白包含在婴儿配方物中且婴儿配方物未经巴氏杀菌。出乎意料地,本发明的发明人已经示出了,具有天然乳清蛋白的婴儿配方物——根据本发明获得,不包括巴氏杀菌步骤——可用于改善肠道成熟并降低和/或预防肠道渗透性。换言之,婴儿配方物包含碱性磷酸酶活性。在一个优选的实施方案中,婴儿配方物是液体的即食的制品并且包含碱性磷酸酶活性或被认为是碱性磷酸酶阳性的。在该实施方案中婴儿配方物的碱性磷酸酶活性大于350mU/L。
优选实施方案列表
1.在以下方面使用的天然乳清蛋白:
(a)改善肠道成熟;和/或
(b)降低和/或预防肠道渗透性。
2.根据实施方案1所述的使用的天然乳清蛋白,其用于降低和/或预防肠道渗透性。
3.根据实施方案1或2所述的使用的天然乳清蛋白,其中在弱势受试者、优选婴儿、更优选早产婴儿中改善肠道成熟、和/或降低和/或预防肠道渗透性。
4.根据前述实施方案中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中改善的肠道成熟降低对食物不耐受和/或肠道炎症如坏死性小肠结肠炎的易感性。
5.根据前述实施方案中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中天然乳清蛋白的天然性超过80%,优选超过90%,最优选超过95%。
6.根据前述实施方案中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中至少70%、更优选75-95%、最优选78-85%的α-乳白蛋白是天然的和/或至少70%、更优选80-100%、最优选85-95%的β-乳球蛋白是天然的。
7.根据前述实施方案中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中肠道成熟的改善、和/或肠道渗透性的降低和/或预防的进行是就在喂食同样的乳清蛋白的受试者中的发生而言的,所述同样的乳清蛋白被制成非天然的,优选通过充分加热以实现小于20%的天然性。
8.根据前述实施方案中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中肠道至少包括结肠。
9.根据前述实施方案中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中天然乳清蛋白为牛乳清蛋白,所述牛乳清蛋白通过基于膜过滤的技术获得以保留乳清蛋白的天然性。
10.根据前述实施方案中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中天然乳清蛋白可通过包括以下步骤的方法获得:
(a)将脱脂乳处理成酪蛋白流、乳清蛋白流和乳糖流,这通过以下进行:
(i)将脱脂乳在能够保留细菌并渗透乳蛋白的膜上进行微滤,或进行巴氏杀菌步骤,以提供脱细菌乳;
(ii)使源自步骤(i)的渗透物在能够保留酪蛋白并渗透乳清蛋白的膜上进行微滤,以提供作为保留物的酪蛋白流和含乳清蛋白的渗透物;
(iii)将源自步骤(ii)的渗透物分级成乳清蛋白流和乳糖流。
11.根据前述实施方案中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中天然乳清蛋白包含在营养组合物中,优选婴儿配方物中,更优选早产儿配方物中。
12.根据实施方案10所述的使用的天然乳清蛋白,其中营养组合物可通过包括以下步骤的方法获得:
(a)将脱脂乳处理成酪蛋白流、乳清蛋白流和乳糖流,这通过以下进行:
(i)将脱脂乳在能够保留细菌并渗透乳蛋白的膜上进行微滤,或进行巴氏杀菌步骤,以提供脱细菌乳;
(ii)使源自步骤(i)的渗透物在能够保留酪蛋白并渗透乳清蛋白的膜上进行微滤,以提供作为保留物的酪蛋白流和含乳清蛋白的渗透物;
(iii)将源自步骤(ii)的渗透物分级成乳清蛋白流和乳糖流;
(b)将源自步骤(a)的至少一部分酪蛋白流、至少一部分乳清蛋白流与乳糖源组合,以获得重组流;
(c)任选地对来自步骤(b)的重组流进行巴氏杀菌,
(d)在营养组合物的制造中使用源自步骤(b)或(c)的重组流。
13.根据实施方案9或12所述的使用的天然乳清蛋白,其中脱脂乳为脱脂牛乳。
14.根据实施方案9、12或13中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中使用源自步骤(a)的至少一部分乳糖流作为步骤(b)中的乳糖源。
15.根据实施方案9、12-14中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中步骤(iii)通过在能够保留乳清蛋白并渗透乳糖的膜上超滤而实施,以提供作为保留物的乳清蛋白流和包含乳糖的渗透物,优选其中超滤步骤 (iii)以20-200的体积浓缩因子操作。
16.根据实施方案12-15中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中脱脂乳是婴儿配方物唯一的蛋白质源。
17.根据实施方案12-16中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中步骤(d)的制造包括以下中的至少一种:干燥,浓缩,补充维生素、矿物质、脂质和/或膳食纤维,包装。
18.根据实施方案11-17中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中营养组合物为通过喷雾干燥获得的粉末,所述喷雾干燥优选作为步骤(d) 的一部分。
19.根据实施方案11-18中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中营养组合物未进行热处理和/或其中婴儿配方物表现出至少25mU/g的碱性磷酸酶活性。
20.根据实施方案11-18中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中营养组合物为经巴氏杀菌的营养组合物和/或其中营养组合物表现出至多 20mU/g、优选至多5mU/g的碱性磷酸酶活性。
具体实施方式
出乎意料地,发明人发现根据本发明的天然乳清蛋白显著改善肠道成熟并降低肠道渗透性的发生。天然乳清蛋白优选包含在营养组合物中,更优选婴儿配方物中。发明人开发了一种制备包含天然乳清蛋白的婴儿配方物的方法。
天然乳清蛋白
与通常包含在营养组合物中的乳清蛋白相比,本发明的乳清蛋白具有增加的天然性。发明人发现,将这种营养组合物中的常规乳清蛋白级分部分地或全部地替换成本发明的乳清蛋白提供了对肠道成熟和渗透性的有益作用。本发明不涉及人乳喂养,且在本发明的上下文中天然乳清蛋白是非人类乳清蛋白。尽管在本发明的上下文中任何乳清蛋白皆是合适的,但乳清蛋白优选为牛乳清蛋白。
本发明的乳清蛋白的增加的天然性可以若干种方法定义,例如通过超过80%的天然性定义和/或通过可通过本身已知的基于膜过滤的技术获得来定义,优选通过本发明的方法,特别是步骤(a)。
因此,在一个优选的实施方案中,根据本发明的乳清蛋白的天然性超过80%,优选超过90%,更优选超过92%、超过94%、超过95%或甚至超过98%。在一个实施方案中,天然性在90-100%的范围内,优选在 94-99%范围内,更优选在96-99%范围内。在一个实施方案中,天然性在90-99%范围内,优选在91-96%范围内,更优选在92-94%范围内。作为两种最富足的乳清蛋白,尤其优选的是,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白具有很高的天然性。出乎意料地,发明人发现,特别地,在本发明的方法中,β- 乳球蛋白很大程度上保留天然。因此,优选的是,α-乳白蛋白的天然性为至少70%,更优选75-95%,最优选78-85%。同样,优选的是,β-乳球蛋白的天然性为至少70%,更优选80-100%,最优选85-95%。不囿于理论,现认为,α-乳白蛋白和/或β-乳球蛋白、尤其是β-乳球蛋白的天然性有助于对肠道成熟和渗透性的有益作用。
天然性是本领域中已知的参数且可通过对技术人员可用的任何手段确定。天然性是指特定类型的天然蛋白质基于同样类型的蛋白质的总量计的百分比。本文中,乳清蛋白的天然性是指天然乳清蛋白基于乳清蛋白总量计的量。在一个实施方案中,天然性根据合适的凯氏分析法 (Kjeldahl-based)如根据ISO 8968-3/IDF 20-3:2004或更优选根据实施例 3中的方法确定。
根据本发明的天然乳清蛋白可包含一些其他蛋白质,但优选不超过 10重量%,更优选至多5重量%,如0.1-3重量%,基于总蛋白质计。如果存在其他蛋白质,则优选天然酪蛋白(胶束酪蛋白)。优选地,不存在变性酪蛋白酸盐。因此,在一个实施方案中,根据本发明的天然乳清蛋白的酪蛋白酸盐含量至多为5重量%,优选至多2重量%,或甚至至多0.5重量%,基于总蛋白质计。最优选地,根据本发明的天然乳清蛋白基本上不含酪蛋白酸盐。
另外或替代地,根据本发明的天然乳清蛋白定义为可通过基于膜过滤技术获得。在一个优选的实施方案中,乳清不是源自酸乳清或甜乳清。换言之,所述乳清尚未经历沉淀酪蛋白的步骤。此外,优选的是,所述乳清尚未经历将pH降低至低于6、优选不低于5.5的值的处理。已发现这种 pH的降低产生乳清蛋白聚集物。所述聚集物可能负面地影响本发明的天然乳清蛋白对肠道成熟和渗透性的有益作用。因此,在一个实施方案中,在本发明的天然乳清蛋白中通过pH减低引起的乳清蛋白聚集物的总量为至多5重量%,优选至多2重量%,或甚至至多0.5重量%,基于总的乳清蛋白计。最优选地,本发明的天然乳清蛋白中基本上不含乳清蛋白聚集物。
本文中一种制备天然乳清蛋白或包含天然乳清蛋白的营养组合物的优选方法被称为本发明的方法并在下文中进一步定义。发明人已经开发了一种制备天然乳清蛋白的方法以及制备包含天然乳清蛋白的营养组合物、特别是婴儿配方物的方法。
营养组合物
本发明的天然乳清蛋白优选地包含在营养组合物中,更优选包含在婴儿配方物中,最优选包含在早产儿配方物中。优选地,营养组合物的乳清蛋白级分包含的至少80重量%、优选至少90重量%的乳清蛋白为本文定义的天然乳清蛋白。最优选地,营养组合物基本上不含除本文定义的天然乳清蛋白之外的乳清蛋白。本发明的营养组合物优选用于肠道喂养,因为其对常规喂养方案影响最小。然而,管饲或其他喂养形式的包含天然乳清蛋白的营养组合物也适用于改善肠道成熟并降低和/或预防肠道渗透性。
在本发明的上下文中,“婴儿配方物”是指适合喂养婴儿的乳基营养组合物,其通常为可复水的粉末或即食的液体组合物的形式,或指适合制备婴儿配方物的婴儿配方物基础物,其包含婴儿营养所需量的所有或几乎所有必要成分。优选地,所述组合物为婴儿配方物、第二阶段配方物 (follow-on formula)、成长乳(growing-up milk)或其基础物。最优选地,所述组合物为婴儿配方物。在本发明的上下文中,尤其优选的婴儿配方物是早产儿配方物。婴儿配方物可以是粉末,优选喷雾干燥粉末,其旨在复水为液体婴儿配方物,或可以是液体婴儿配方物。
在一个实施方案中,营养组合物包含可通过本发明的方法的步骤(a) 获得的天然乳清蛋白。更优选地,营养组合物可通过本发明的方法获得。因此,在一个实施方案中,根据本发明的组合物包含这样的乳清蛋白级分,该乳清蛋白级分是通过如下定义的本发明方法——特别是步骤(a)——以乳清蛋白流的形式可获得的。具体地,乳清蛋白是通过以下可获得的:将脱脂、脱细菌乳在能够保留酪蛋白并渗透乳清蛋白的膜上进行微滤,以提供包含乳清蛋白的渗透物,并将渗透物分级成乳清蛋白流和乳糖流,其中脱细菌优选通过微滤或巴氏灭菌实施。乳清蛋白存在于由此获得的超滤保留物中。在一个实施方案中,乳清蛋白是通过本文定义的方法获得的。如何从脱脂乳开始获得这种包含天然乳清蛋白的超滤保留物对技术人员来说是众所周知的。
如果营养组合物是婴儿配方物,则其对于婴儿通常是营养完全的,并且包含本领域已知的婴儿配方物所有必需的常量营养物和微量营养物。具体而言,婴儿配方物除了天然和完整的乳清蛋白外,还优选含有酪蛋白。婴儿配方物中乳清蛋白与酪蛋白的重量比优选为90:10至40:60,更优选 80:20至50:50,甚至更优选75:25至50:50,最优选70:30至55:45。在一个实施方案中,婴儿配方物中乳清蛋白与酪蛋白的重量比为约60:40。精确的比例通常由正在制备的婴儿配方物的类型决定,并且可如本领域中已知的那样进行调整。
在一个实施方案中,本发明的营养组合物对碱性磷酸酶(ALP)活性测试显示出阴性反应。可替代的,营养组合物可表现出碱性磷酸酶活性。碱性磷酸盐活性测试是本领域中已知的,并且用作定义婴儿配方物中酶的活性(或缺乏活性)的标准。法律(例如欧洲法规2074/05及其在EC No 1664/2006中的修订)要求ALP活性低于350mU/L,这也称为ALP阴性。ALP活性可以定义为mU/g(通常用于粉末或用于基于干重计的液体)或 mU/L(通常对于液体,包括复水的粉末)。如果营养组合物是早产儿配方物,则优选营养组合物是ALP阴性。
因此,在一个实施方案中,当为液体形式时,本发明组合物的ALP 活性低于350mU/L,或当为粉末形式时,在婴儿配方物领域常见的复水后,其通常低于350mU/L。在一个实施方案中,本发明的组合物为液体或复水的粉末,且ALP活性为0-350mU/L,优选100-350mU/L,更优选200-350mU/L,最优选250-320mU/L。具有这种ALP活性的产品可称为变性的和/或失活的(例如,见实施例1)。在一个替代实施方案中,ALP 活性更高,例如超过350,或范围为350-100000mU/L、优选1000-50000 mU/L、最优选10000-30000mU/L。在一个实施方案中,ALP活性为 350-450mU/L。具有这种ALP活性的产品可称为天然的(例如,见实施例 1)或ALP阳性的。
在一个实施方案中,本发明的组合物的ALP活性为至多20mU/g、优选至多5mU/g,或本发明的组合物的ALP活性为0-20mU/g、优选 0.1-10mU/g、更优选0.2-7mU/g、最优选0.5-5mU/g,基于组合物的干重计。在一个替代的实施方案中,本发明的组合物的ALP活性为至少25 mU/g,优选至少30mU/g,或本发明的组合物的ALP活性范围为25-150 mU/g,优选30-50mU/g,基于组合物的干重计。
具有高于指定ALP阈值数值的活性的乳制品或乳产品在本领域中被认为是ALP阳性的,因此合格成为生乳或包含生乳。即使本发明的ALP 阳性乳清蛋白与天然乳相关,本发明人仍发现其可用于弱势受试者以改善肠道成熟和肠道渗透性。
在一个实施方案中,ALP活性通过ISO标准11816-1确定。或者, ALP活性通过以下方法确定。乳清蛋白的溶液——通常作为10重量%蛋白质溶液——与等量的1-丁醇混合,然后将混合物在2500-3500g离心30 min。水相从脂肪层下面收集,并稀释至1/5-1/200。这些样品溶液,连同对照和标准溶液一起,被添加到酶联免疫吸附试验(ELISA)板的孔中,所述孔覆盖有对在牛乳中发现的碱性磷酸酶具有特异性的单克隆抗体。板在 18-25℃下培养1h,其后从孔中取出溶液,并向每个孔中添加底物溶液。将板在35-38℃下培养2h。停止培养后,将板在405nm波长处成像,并通过将样品的光密度与标准品的光密度进行比较来确定ALP活性。在一个尤其优选的实施方案中,本发明的营养组合物包括完整的乳清蛋白,其中至少90%的乳清蛋白是天然的,且ALP活性为100-350mU/L,如通过 ISO标准11816-1确定。优选地,该营养组合物可通过本文定义的方法获得,其中包括巴氏杀菌步骤以提供脱细菌乳。在一个替代的优选实施方案中,本发明的营养组合物包括完整的乳清蛋白,其中至少90%的乳清蛋白是天然的,且ALP活性高于350mU/L或为350-100000mU/L,如通过 ISO标准11816-1确定。优选地,该营养组合物可通过本文定义的方法获得,其中包括使用能够保留细菌并渗透乳蛋白的膜以提供脱细菌乳的微滤步骤。
制备天然乳清蛋白或营养组合物的方法
在一个实施方案中,天然乳清蛋白可通过基于膜滤法的技术获得,以保留乳清蛋白的天然性。优选地,获得天然乳清蛋白的方法包括:
(a)将脱脂乳加工成酪蛋白流、乳清蛋白流和乳糖流,这通过以下进行:
(i)将脱脂乳在能够保留细菌并渗透乳蛋白的膜上进行微滤,或进行巴氏杀菌步骤,以提供脱细菌乳;
(ii)将源自步骤(i)的渗透物在能够保留酪蛋白并渗透乳清蛋白的膜上进行微滤,以提供作为保留物的酪蛋白流和包含乳清蛋白的渗透物;
(iii)将源自步骤(ii)的渗透物分级成乳清蛋白流和乳糖流;
在一个实施方案中,营养组合物可通过包括以下步骤的方法获得:
(a)将脱脂乳加工成酪蛋白流、乳清蛋白流和乳糖流,这通过以下进行:
(i)将脱脂乳在能够保留细菌并渗透乳蛋白的膜上进行微滤,或进行巴氏杀菌步骤,以提供脱细菌乳;
(ii)将源自步骤(i)的渗透物在能够保留酪蛋白并渗透乳清蛋白的膜上进行微滤,以提供作为保留物的酪蛋白流和包含乳清蛋白的渗透物;
(iii)将源自步骤(ii)的渗透物分级为乳清蛋白流和乳糖流;
(b)将源自步骤(a)的至少部分酪蛋白流、至少部分乳清蛋白流与乳糖源组合,以获得重组流;
(c)任选地对来自步骤(b)的重组流进行巴氏杀菌,
(d)在营养组合物的制造中使用源自步骤(b)或(c)的重组流。
在本发明的方法中,将脱脂乳处理以生产营养组合物。在本发明的上下文中,每当提到某一流或某一组合物“源自”某一方法步骤时,例如源自步骤(b)的重组流,所述流或组合物可以是由所述方法步骤直接获得的组合物。此外,如果这种直接获得的流或组合物经历一个或多个额外的加工步骤,如部分蒸发和/或补充额外的水或其他组分,则所述流或组合物也被认为源自该特定的方法步骤。因此,如果步骤(b)的重组流在进入巴氏杀菌步骤(c)之前被部分蒸发,则步骤(c)的进料流仍然被认为是源自步骤(b)的重组流。在本发明的上下文中,术语“流”是指液体组合物,虽然不排除一些固体物质的存在,例如就像在悬浮液中一样,只要所述组合物可以由传统的乳品厂处理。
本发明方法在步骤(a)中使用乳作为原料。脱脂乳——优选脱脂牛乳——经历步骤(a)。在本发明的上下文中,“脱脂乳”是指与全脂乳相比,脂肪含量降低的乳。通常,脱脂乳的脂肪含量范围为0-2重量%,优选0-1重量%,更优选0-0.2重量%,最优选0-0.05重量%,基于脱脂乳的总重量计。在一个实施方案中,脱脂乳为脱脂乳(skim milk)。本发明方法使用乳,其指非人乳,优选牛乳。最优选地,使用牛脱脂乳(cow’s skim milk)。在一个实施方案中,所述方法包括将乳脱脂以获得脱脂乳的步骤,所述脱脂乳随后经历步骤(a)。在本文中,非脱脂乳,或只是乳或全脂乳,经历脱脂步骤。脱脂步骤提供脱脂乳。优选地,脱脂乳是营养组合物的唯一蛋白质来源。
步骤(a)
步骤(a)中,脱脂乳被加工或分级成酪蛋白流、乳清蛋白流和乳糖流。在本文中,酪蛋白流是包含酪蛋白的液体组合物,其与进料脱脂乳中的酪蛋白含量相比富含酪蛋白,乳清蛋白流是包含乳清蛋白的液体组合物,其与进料脱脂乳中的乳清蛋白含量相比富含乳清蛋白,乳糖流是包含乳糖的液体组合物,其与进料脱脂乳中的乳糖含量相比富含乳糖。在本发明的上下文中,“富含”被定义为,基于干重计所富含的组分的含量在一个流中比在另一个流中的含量增加。因此,酪蛋白流富含酪蛋白,即其与进料脱脂乳相比,基于干物质计酪蛋白含量更高。
步骤(a)的分级是通过膜过滤技术完成的,涉及微滤和超滤的组合。酪蛋白流源自微滤,作为保留物;乳清蛋白流源自超滤,作为保留物;乳糖流源自超滤,作为渗透物。合适的膜过滤方法在本领域中是已知的,例如WO 2013/068653、WO 2013/137714和WO 2015/041529所公开的。更具体地说,步骤(a)包括:
(i)将脱脂乳在能够保留细菌并渗透乳蛋白的膜上进行微滤,或进行巴氏杀菌步骤,以提供脱细菌乳;
(ii)将源自步骤(i)的渗透物在能够保留酪蛋白并渗透乳清蛋白的膜上进行微滤,以提供作为保留物的酪蛋白流和包含乳清蛋白的渗透物;和
(iii)将源自步骤(ii)的渗透物分级为乳清蛋白流和乳糖流。
进料脱脂乳在步骤(i)中经历脱细菌化(细菌去除)。脱细菌化可通过过滤或巴氏杀菌进行。在一个实施方案中,脱细菌化通过细菌过滤(例如微滤MF)进行。这种以减少乳的细菌载量为目的的过滤方法是本领域中已知的。步骤(i)的微滤可以通过在能够保留细菌并渗透乳蛋白的膜上的微滤来进行,以提供脱细菌乳作为渗透物。优选地,所述步骤(i)的微滤包括陶瓷微滤。MF膜的孔径优选在1.8至0.6μm,优选在1.4至0.8μm。步骤(i)的MF方法优选在4至20℃的温度下进行,更优选在8至15℃,最优选在约10℃的温度下。
或者,步骤(i)通过巴氏杀菌进行。以减少乳的细菌载量为目的的脱脂乳的巴氏杀菌是本领域中已知的。巴氏杀菌及其优选实施方案将在下文的步骤(c)的上下文中更详细地描述,其在这里同样适用。
在微滤步骤(ii)中,源自步骤(i)的脱细菌乳被分级成两个流,每个流富含特定的蛋白质类型;产生富含酪蛋白的MF保留物(MFR)和富含乳清蛋白的MF渗透物(MFP)。MF步骤(ii)是在能够将酪蛋白和乳清蛋白分级的膜上进行的。这种膜的孔隙率通常在0.05至0.5μm之间,更优选在 0.08-0.35μm之间。或者,步骤(ii)中使用的膜的截留分子量范围可以为250-1500kDa,优选500-1000kDa。优选地,使用陶瓷膜或螺旋缠绕(有机)膜。步骤(ii)的微滤优选在1.5-10,优选2-5的体积浓缩因子(VCF)范围内进行,其被发现在MF保留物的组成方面、特别是在酪蛋白含量方面提供了最优的结果。
在本发明的上下文中,术语“体积浓缩因子”或“VCF”是液体组合物在经过滤而浓缩时的因子,即过滤前进料流的总体积除以过滤后保留物的总体积,而不考虑总固体含量。因此,当5L的液体组合物经超滤膜被分级成4L的渗透物和1L的保留物时,该UF方法以5/1=5的VCF进行。
根据一个优选实施方案,步骤(ii)的微滤用渗滤(DF)增强。可通过用一定量的水稀释MF的保留物至少一次,或通过用一定量的水稀释进料脱细菌乳,并将所稀释的乳进行MF来完成渗滤。可将DF水一次加入到进料脱细菌乳或MFR中,或将DF水的总量以几个级分加入。在每一次向进料脱脂乳或MFR中加入DF水后,将所稀释的液体组合物进行MF。
将包含乳清蛋白和乳糖的组合物分级成富含乳清蛋白的组合物和富含乳糖的组合物是本领域中已知的。步骤(iii)优选通过超滤(UF)进行。在超滤过程中,大部分液体和小的溶质最终进入UF渗透物(UFP),而 UF保留物(UFR)以更小的体积包含基本上所有的乳清蛋白。通过UF 膜渗透的小分子为例如乳糖、单价和多价离子。步骤(iii)的超滤可以用本领域中已知的任意UF膜进行,包括陶瓷膜、管状和有机螺旋缠绕膜。优选地,UF膜为有机螺旋缠绕膜。UF膜的截留分子量能够使蛋白质、优选乳清蛋白保留在保留物中,并允许小的溶质——例如乳糖——通过膜渗透。优选地,UF步骤(iii)是用截留分子量至多为25kDa,更优选至多为 10kDa,且优选至少为2.5kDa,更优选至少为5kDa的膜进行。优选地, UF步骤(iii)是在20-200、优选50-150的体积浓度因子(VCF)范围内进行的,其被发现在UF保留物的组成方面提供了最优的结果。
步骤(a)可进一步包括一个或多个浓缩步骤,例如源自步骤(ii)的MFR 和/或源自步骤(iii)的UFR的浓缩。浓缩优选通过反渗透(RO)、纳滤(NF) 和/或蒸发进行。NF是最优选的,因为NF浓缩了流,同时降低了单价离子含量,所述单价离子能够渗透NF膜。在婴儿配方物的生产中,这种降低单价离子含量是特别理想的。
源自步骤(a)的酪蛋白流的蛋白质级分通常包含很少的乳清蛋白,优选低于15重量%,更优选低于10重量%,基于酪蛋白流的蛋白质级分的重量计,并且具有较高的酪蛋白。优选地,所述蛋白质级分包含至少85 重量%酪蛋白,更优选至少90重量%酪蛋白。酪蛋白流中总固体的含量范围通常为5至30重量%,优选7至30重量%,最优选17至24重量%,基于酪蛋白流的总重量计。酪蛋白流也可称为酪蛋白浓缩物、酪蛋白分离物、胶束酪蛋白浓缩物或胶束酪蛋白分离物(MCI)。
乳清蛋白流通常是一种液体组合物,其总固体含量为5-35重量%,优选10-30重量%,最优选20-30重量%,并且通常包含25-90重量%,优选60-85重量%的乳清蛋白,基于总干重计。乳清蛋白流也可称为包含乳清蛋白的含水组合物。虽然乳清蛋白流与进料脱脂乳相比富含乳清蛋白,但它仍然可能含有大量酪蛋白,这取决于通过超滤在酪蛋白和乳清蛋白之间进行分级的确切条件。在一个实施方案中,乳清蛋白流包含至多40重量%,优选5-20重量%酪蛋白,基于蛋白质的总重量计。这种分级条件的变化和乳清蛋白流的伴随变化是本领域中已知的。根据乳清蛋白流中存在的酪蛋白的量,在组合步骤(b)中使用的酪蛋白的量可以调整,使营养组合物的乳清蛋白:酪蛋白比例落入优选比例90:10至40:60内。
乳糖流通常是一种液体组合物,其总固体含量为3-30重量%,优选 5-22重量%。源自步骤(a)的乳糖流中的乳糖含量通常至少为75重量%,优选至少90重量%,或甚至至少95重量%,基于总干重计。
脱矿
根据本发明的方法优选地包括脱矿步骤,其中乳糖源或其一种或多种组分在进行步骤(b)之前被脱矿。因此,通常在进行步骤(b)之前对源自步骤(a)的至少部分乳糖流进行脱矿。对于婴儿配方物的制备,脱矿是特别优选的,因为与进料乳相比,婴儿配方物通常需要降低矿物质含量。因此,在一个实施方案中,源自步骤(a)的至少部分乳糖流,优选源自步骤(iii)的 UFP,在被用作步骤(b)中的(部分)乳糖源之前进行脱矿。
乳糖源的脱矿可以通过本领域已知的任何技术进行,如电渗析、离子交换、盐沉淀、乳糖结晶、膜过滤技术(如纳滤,任选地用渗滤增强),或其组合。在一个优选实施方案中,脱矿包括盐沉淀、电渗析、乳糖结晶和离子交换中的至少一种,其任选地与纳滤组合;更优选地,脱矿包括与盐沉淀、电渗析、乳糖结晶和离子交换中的至少一种组合的纳滤。在一个优选实施方案中,脱矿至少包括电渗析和/或盐沉淀。在一个优选实施方案中,脱矿至少包括与电渗析和/或盐沉淀组合的纳滤。本发明人发现,当只使用纳滤用于脱矿、特别是在婴儿配方物的制备时用于作为乳糖源的超滤渗透物的脱矿时,二价离子(如钙和磷酸根)的含量通常没有充分减少到能获得在法律要求范围内的最终婴儿配方物。
优选地进行脱矿,使至少20重量%,或优选50重量%,更优选至少 70重量%或至少80重量%,最优选至少90重量%的多价离子和/或使至少20重量%的一价离子被去除,更优选至少35重量%或至少50重量%,最优选至少60重量%的存在于乳糖中的一价离子,例如存在于源自步骤 (iii)的UFP中的一价离子被去除。
步骤(b)
在步骤(b)中,将源自步骤(a)的至少部分酪蛋白流、至少部分乳清蛋白流与乳糖源组合以获得重组流。该重组流用于在步骤(d)中制备婴儿组合物,任选地在巴氏杀菌步骤(c)之后。步骤(b)的组合提供了一种具有蛋白质级分的组合物,该蛋白质级分包含一定重量比的酪蛋白和乳清蛋白。步骤(b)的组合可能涉及额外的组分。优选进行组合,使得重组流中乳清蛋白与酪蛋白的重量比范围为90:10至40:60,更优选为80:20至50:50,甚至更优选为75:25至50:50,最优选为70:30至55:45。在一个实施方案中,重组流中乳清蛋白与酪蛋白的重量比约为60:40。确切的比例通常由营养组合物的类型,特别是由正在生产的婴儿配方物的类型决定,并且可以根据本领域中已知的方式进行调整。此外,婴儿配方物的氨基酸谱也受到了本领域的广泛关注。根据本发明的方法提供了对达到特定所需氨基酸谱靶向的最佳灵活性,例如通过调整乳清蛋白和酪蛋白流组合的比例或改变步骤(a)的微滤的特定方法条件。因此,根据本发明的方法可获得与人乳中所发现的氨基酸谱相似的最佳氨基酸谱。
在一个实施方案中,基于酪蛋白的总重量计,将源自步骤(a)的酪蛋白流的10-50重量%、优选12-25重量%进行步骤(b)。最优选地,基于酪蛋白的总重量计,将源自步骤(a)的酪蛋白流的约16重量%进行步骤(b)。进行步骤(b)的源自步骤(a)的酪蛋白流的量有利地由重组流中所需的乳清蛋白与酪蛋白的重量比决定。优选地,源自步骤(a)的所有乳清蛋白流都进行步骤(b)的组合。在一个实施方案中,基于乳糖的总重量计,将源自步骤(a)的乳糖流的0-50重量%、优选5-25重量%进行步骤(b),作为(部分)乳糖源。进行步骤(b)的源自步骤(a)的乳糖流的量,作为(部分)乳糖源,有利地由步骤(d)所需的乳糖量决定。如果进行步骤(b)的源自步骤(a)的乳糖流中的乳糖量不足以用于婴儿配方物的制备,则可以使用额外的乳糖。在一个实施方案中,部分酪蛋白流与所有乳清蛋白流和部分乳糖流组合。在一个实施方案中,部分酪蛋白流与所有乳清蛋白流和所有乳糖流组合。在一个实施方案中,部分酪蛋白流与所有乳清蛋白流组合,而不与乳糖流组合。在一个实施方案中,源自步骤(ii)的部分MFR与源自步骤(iii)的至少部分UFR和源自步骤(iii)的至少部分UFP组合。
在步骤(b)中,三个以上的流被重组成一个流。这种重组可能同时发生(多个流同时组合)或分步发生(多个流先后连续组合)。组合可以作为湿混合或干混合,或甚至两者的组合进行。优选地,所述组合作为湿混合发生,其中液体组合物以适当量混合。
步骤(c)
根据本发明的方法可以包含巴氏杀菌步骤,虽然省略巴氏杀菌步骤也提供了合适的产品。如果进行巴氏杀菌步骤,则它可以作为步骤(i)或步骤 (c)进行。在一个优选实施方案中,进行巴氏杀菌步骤,因为从食品安全角度来看,这是许多司法管辖区对婴儿配方物的要求。在一个优选实施方案中,本发明的方法仅包括单一的巴氏杀菌步骤,以确保所获得的产品在预防微生物或细菌污染方面得到足够的热处理,而另一方面又确保蛋白质天然性的保存。因此,在一个优选实施方案中,步骤(i)是巴氏杀菌步骤,且不进行步骤(c);或步骤(i)是过滤步骤,且进行步骤(c)。虽然进料脱脂乳可以在步骤(i)中进行巴氏杀菌,但优选地如果包括巴氏杀菌步骤,则将源自步骤(b)的重组流进行巴氏杀菌步骤(c),然后进行步骤(d)。或者,不进行巴氏杀菌步骤,通过过滤进行步骤(i),且省略步骤(c)。通过过滤步骤(i),由此获得的产品被充分脱细菌化到能够适合本发明的上下文。最优选地,步骤(c)是在步骤(i)中通过微滤实现脱细菌的情况下进行的。
巴氏杀菌是本领域中已知的,可例如包括HTST、ESL或UHT。本文所指的巴氏杀菌步骤的目的是减少微生物载量,使所产生的营养组合物不受微生物的影响,并安全地食用,甚至是供婴儿食用。具体地,关于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii),它是安全的,例如,2007年第2073/2005号欧洲条例,勘误第1441/2007号所规定的。优选地,巴氏杀菌包括在72-74℃下加热15至30秒,或者与其等同的热处理,这意味着施加相同的热负荷,如本领域技术人员已知的。优选地,等同的热处理导致细菌载量的相同减少,并将蛋白质天然性保持在与在72-74℃持续15-30秒的巴氏杀菌步骤相同的程度,导致乳清蛋白的天然性超过90%,优选超过95%或甚至超过98%。
步骤(d)
在步骤(d)中,源自步骤(b)的重组流用于制备营养组合物。这种制备是本领域中已知的,通常包括干燥,浓缩,补充维生素、矿物质、脂质和 /或膳食纤维,热处理,均质化,包装中的一种或多种。在一个优选实施方案中,步骤(d)不包括热处理,并且包括干燥,浓缩,补充维生素、矿物质、脂质和/或膳食纤维和包装中的一种或多种。优选地,步骤(d)至少包括干燥步骤,最优选地它包括上述所有步骤。在一个优选实施方案中,干燥步骤在步骤(b)或(c)之后直接进行,最优选在步骤(c)之后直接进行。
虽然一个或多个单独的流可以在步骤(b)中组合之前干燥,但优选地源自步骤(b)的重组流被干燥,优选喷雾干燥。因此,在营养组合物制备中只需要一个干燥步骤。在一个优选实施方案中,根据本发明的方法仅包括单个干燥步骤,其中在步骤(d)中重组流被干燥,优选通过喷雾干燥法进行干燥。由于喷雾干燥过程中产生的液滴的水活性低而固有地使热负荷有限,因此蛋白质的天然性基本保持相同,且在喷雾干燥过程中没有被显著影响。这使得最终营养组合物中天然蛋白质的含量尽可能高,并且与喷雾干燥前基本相同。为了保留最终产品中的天然蛋白质含量,喷雾干燥步骤优选在低于250℃、优选低于220℃、更优选低于200℃的入口温度下进行。或者,进行喷雾干燥步骤,使湿球温度保持低于80℃,优选低于 70℃或甚至低于50℃。使用这种喷雾干燥条件,由于在喷雾干燥器中的粉末颗粒的水活性较低,因此经喷雾干燥的蛋白质的天然性不会再受到影响。在一个实施方案中,将重组流进行浓缩,优选在干燥之前进行。这种浓缩可以通过本领域中已知的任何方法来实现,例如反渗透(RO)、纳滤 (NF)和/或蒸发。
根据所需的营养组合物类型,可能需要补充某些成分,如维生素、矿物质、脂质和/或膳食纤维。这种补充可以在组合步骤(b)之前、期间或之后进行,和/或任选地在干燥步骤之前或之后进行。技术人员了解特定类型的营养组合物尤其是婴儿配方物的要求,例如来自欧盟第91/321/EEC 号指令或欧盟第2006/141/EC号指令或美国食品和药物管理局第21CFR Ch 1的107部分,并能够调整重组流的组成,以满足这些要求。
如技术人员所意识到的那样,应尽可能避免导致乳清蛋白变性的方法步骤。例如,营养组合物可能是喷雾干燥粉末,在这种情况下,优选地,喷雾干燥步骤是在低于250℃、优选低于220℃、更优选低于200℃的入口温度下进行。优选地,乳清蛋白进行了巴氏杀菌步骤,优选单一的巴氏杀菌步骤。
应用
本发明人出乎意料地发现,根据本发明的天然乳清蛋白对肠道,特别是关于肠道成熟和肠道渗透方面,具有有益效果。本发明人出乎意料地发现,显著降低了尿中的乳果糖/甘露醇比(参见实施例6),这是肠道渗透性降低的临床标志。基于乳果糖的细胞内扩散太大,但依赖于用于肠道吸收的细胞旁扩散,而甘露醇的吸收则较少依赖于肠道完整性,因此乳果糖与甘露醇的比度量了肠道渗透性。因此,根据本发明的天然乳清蛋白能够(a) 改善肠道成熟;(b)减少和/或预防肠道渗透性。在本发明的上下文中,肠道优选至少包括结肠,最优选是结肠。
由本发明的天然乳清蛋白引起的对肠道成熟的改善和/或肠道渗透性的减少和/或预防,是就营养组合物如婴儿配方物中通常存在的乳清蛋白 (其是非天然的或天然程度较小的)而言的。因此,在一个实施方案中,肠道成熟的改善和/或肠道渗透性的减少和/或预防,是就喂养相同乳清蛋白 (其被制成非天然的,优选通过充分加热使天然性小于20%)的受试者中的肠道渗透性的发生而言的。
在本发明的上下文中,肠道渗透性是指一种医学症状,其中肠壁对于肠道中存在的通常不应通过肠壁的成分(例如食物颗粒、微生物、毒素)是可渗透的。肠壁的正常功能(包括营养物的渗透)不受使用本发明的天然乳清蛋白的影响。因此,在本发明的上下文中,“肠道渗透性”也可被称为“受损的肠道渗透性”。已发现肠道渗透性有助于罹患多种疾病,例如坏死性小肠结肠炎、克罗恩氏病、乳糜泻、糖尿病、肠道炎症、肠易激综合症、肥胖症、脂肪肝病和食物不耐受。因此,本发明减少了与肠道渗透性有关的疾病的发生,或者减少了与肠道渗透性有关的疾病的易感性。这对于具有不成熟肠道的受试者(例如早产婴儿)是特别有意义的。特别优选地,根据本发明的天然乳清蛋白减少了对食物不耐受和/或肠道炎症(例如坏死性小肠结肠炎)的易感性。
在本发明的上下文中,将天然乳清蛋白(通常作为包含在上文定义的营养组合物中的形式)给予有风险和/或有需要的受试者。该受试者因此处于患肠道渗透性相关疾病的风险中,或甚至是增加的风险中,例如上文定义的那些。该受试者通常为婴儿,优选人类婴儿。优选地,婴儿是早产婴儿。优选地,婴儿为0至36月龄,更优选为0至12月龄,甚至更优选为 0至6月龄,甚至更优选为0至4个月龄,最优选为0至2月龄。对于早产儿,该年龄是指实际出生日期的年龄。
在一个优选的实施方案中,受试者需要改善肠道成熟或减少和/或预防肠道渗透性。在一个实施方案中,所述受试者具有未成熟的肠道,特别是需要成熟的未成熟肠道。在一个实施方案中,受试者处于患肠道渗透性的风险中。在一个优选的实施方案中,受试者为早产婴儿。早产婴儿、早产儿是指在怀孕第37周之前出生的婴儿。这种婴儿的特征在于,其由于早产而具有未成熟的器官和组织。尤其是,肠道的特征是未成熟的且需要成熟。
根据本发明的婴儿配方物通常适合作为婴儿的完全营养产品,如常规婴儿配方物。给予根据本发明的婴儿配方物,这作为婴儿的(部分)常规喂养方案存在。在一个实施方案中,根据本发明的用途进一步是用于向婴儿提供营养。
本发明因此涉及天然乳清蛋白,其用于(a)改善肠道成熟;和/或(b)减少和/或预防肠道渗透性。
本发明还可被认为是一种用于(a)改善肠道成熟;和/或(b)减少和/或预防肠道渗透性的方法,其包含向有该风险和/或有该需要的受试者给予治疗有效量的天然乳清蛋白。
本发明还可被认为是天然乳清蛋白在制备用于(a)改善肠道成熟;和/ 或(b)减少和/或预防肠道渗透性的营养组合物中的用途。
上文定义的本发明同样适用于根据本发明使用的组合物、本发明的方法和本发明的用途。
附图说明
附图描述了实施例6的结果
图1描述了近足月组的Lac/Man比(L/M),其中P=根据本发明的 PAST-WPC饮食,D=DENAT-WPC对照饮食。
图2A描述了早产组(PT)和近足月组(NT)的隐窝深度,以μm计。图 2B描述了对于早产组(PT)和近足月组(NT)观察到的每个隐窝的Ki67阳性增殖细胞。图2C描述了对于早产组(PT)和近足月组(NT)观察到的具有组织学阳性的碱活性的动物数量,其中阴性为白色,阳性为阴影。在这里, P=根据本发明的PAST-WPC饮食,D=DENAT-WPC对照饮食。
图3A描述了早产组(PT)和近足月组(NT)的ALP活性(以单位计)。图 3B描述了相同的ALP活性,但是是在特异性阻断iALP(用L-PHE预培养)后。在这里,P=根据本发明的PAST-WPC饮食,D=DENAT-WPC 对照饮食。
图4描述了近足月组的肠内分泌细胞计数,作为5HT+细胞/隐窝(y轴) 计。在这里,P=根据本发明的PAST-WPC饮食,D=DENAT-WPC对照饮食。
实施例
以下实施例说明本发明。
实施例1:WPC70制剂
根据以下方法制备了三种WPC70产品,(i)天然的WPC70,(ii)失活的WPC70和(iii)变性的WPC70。在整个生产过程中,乳和随后的级分在 4℃储存。全脂原牛乳(购自Dairygold)用典型的GEA Westfalia Separator @55℃脱脂,并冷却至4℃。将脱脂乳进行微滤以将乳清和乳糖与酪蛋白分离。使用的微滤膜是0.08μM Synder膜FR(PVDF 800kDa)螺旋缠绕膜。保留微滤保留物(MFR)作为酪蛋白级分,微滤渗透物(MFP)含有乳清、乳糖和灰分。操作温度为10℃,体积浓缩因子(VCF)为3。该VCF因子是获得MFR中酪蛋白的所需最终浓度的最佳因子。然后对MFP进行超滤,以在操作温度为10℃,VCF为90的条件下将乳清蛋白与乳糖分离。该VCF因子给出了超滤保留物(UFR)中乳清蛋白的最佳最终浓度。产生了一种天然的WPC70。所用的超滤膜为10kDa Synder膜ST(PES 10kDa)螺旋缠绕膜。加入渗滤介质,以提高膜的分离效率(原初始脱脂乳体积的 200%)。浓缩液体WPC70(DM 11%)在4℃储存直到进一步处理。将 WPC70加热至30℃,并在11%DM下喷雾干燥。所使用的喷雾干燥器是单级中试规模干燥器,其以185℃的入口温度和90℃的出口温度运行。该样品被称为天然的WPC70,代表高度天然的碱性磷酸酶阳性样品。
失活的WPC70被制备成代表高度天然的巴氏杀菌蛋白样品,其可以包括在婴儿配方物中。其通过以下方式制备:用高速混合器将天然的 WPC70在40℃的RO水中再水化30min,得到总固体含量为10%且蛋白质含量约为7%。该溶液用MicroThermics管式换热器(MicroThermics, North Carolina,USA)以73℃/30s进行热处理。然后将经热处理的WPC冷冻干燥,得到含有失活的生物活性组分──其由碱性磷酸酶失活表征──并且乳清蛋白的天然性>95%的WPC70粉末。
变性的WPC70通过以下方式制备:使用高速混合器将天然WPC70 在40℃的RO水中再水化30min,得到总固体含量为10%且蛋白质含量约为7%。该溶液使用MicroThermics管式换热器(MicroThermics,North Carolina,USA)以100℃/60s进行热处理。然后将经热处理的WPC冷冻干燥,得到乳清蛋白的天然性<30%的WPC70粉末。
三种WPC70产品──作为7%蛋白质溶液(见实施例3)──的组成在下表中给出(以基于干重计的重量%表示):
实施例2:IMF制剂
根据以下方法制备了三种IMF产品,(i)天然的IMF,(ii)失活的IMF,和(iii)变性的IMF。婴儿乳制剂的湿相是通过在90℃的RO水中先溶解乳糖粉末,并由高速silverson混合器(Chesham Bucks,U.K)搅拌而制备。将溶液冷却至45℃,将胶束酪蛋白浓缩物(MCC,在实施例1 中获得的MFR)和天然乳清蛋白浓缩物(在实施例1中获得的天然的WPC70)添加到溶液中,使最终酪蛋白:乳清比为40:60(类似于母乳中观察到的比例),并在高速混合下再水化20min。当酪蛋白和乳清蛋白粉末充分水化并混合15min后,将低聚半乳糖(GOS)糖浆加入到混合物中。根据预先确定的配方,将微量营养素组分添加到常量营养素中。将所有成分加入并高速搅拌20min。
对于天然的IMF,湿相直接与预先制备的油共混物组合,并通过添加大豆卵磷脂粉末和高速搅拌20min而均质化。将该完成的IMF (50-55%TS)直接置于多级Anhydro喷雾干燥器(水蒸发能力(WEC)30 kg/hr)中,其以185℃的入口温度和90℃的出口温度运行,得到含水量<4%的粉末状天然的IMF。
失活的IMF通过使用MicroThermics管式换热器(MicroThermics, NorthCarolina,USA)以73℃/30s对湿相进行巴氏杀菌而制备。经巴氏杀菌的湿相与预先制备的油共混物组合,通过添加大豆卵磷脂粉末和高速搅拌20min进行均质化。该经巴氏杀菌的化合物使用单级中试干燥器(WEC 10kg/hr)进行干燥,产生具有乳清蛋白天然性>95%和失活的生物活性组分(由酶碱性磷酸酶失活表征)的失活的IMF。
变性的IMF通过将天然的IMF粉末再水化到蛋白质含量约为10%制备。该复合物高速混合30min,以确保完全溶解。然后,将该复合物使用MicroThermics管式换热器(MicroThermics,North Carolina,USA) 以100℃/60s进行热处理。收集经热处理的复合物并冷冻干燥,以产生具有乳清蛋白天然性<40%的变性的IMF。
三种IMF产品──作为10%蛋白质溶液(见实施例3)──的组成在下表中给出(以基于干重计的重量%表示):
总蛋白 | NPN | NCN | 真蛋白 | 酪蛋白 | 乳清 | 天然性 | |
天然IMF | 10.19 | 0.41 | 6.44 | 9.78 | 3.34 | 6.38 | 100% |
失活IMF | 10.05 | 0.40 | 6.25 | 9.65 | 3.40 | 6.19 | 97.03% |
变性IMF | 9.98 | 0.40 | 2.43 | 9.59 | 7.15 | 2.37 | 37.16% |
实施例3:天然性值计算
根据ISO 8968-3/IDF 20-3:2004标准(Milk--Determination of nitrogencontent--Part 3:Block-digestion method(Semi-micro rapid routine method),2004),采用自动Kjeltec 8400单元(FOSS,Warrington, U.K),通过凯氏分析测定总氮(TN)、非蛋白氮(NPN)和非酪蛋白氮(NCN)。
实施例1和2中乳清蛋白的天然性计算如下:
(a)酪蛋白级分=(TP-NPN)-NCN
(b)乳清级分=NCN-NPN
(c)天然性=测量的乳清级分(b)/理论的乳清级分*100%
理论的乳清级分是基于产品的酪蛋白/乳清蛋白比例,该比例来自产品的配方。
实施例4:测定碱性磷酸酶活性
天然的和经热处理的WPC和IMF产品中的碱性磷酸酶(ALP)活性,通过用专门的ALP试验试剂盒(IDBiotech,Rue Marie Curie,Issoire, France)进行免疫捕捉试验来测定。该试剂盒含有酶联免疫吸附试验 (ELISA)板,其覆盖有对在牛乳中发现的碱性磷酸酶具有特异性的单克隆抗体。1-丁醇是用于酶提取的溶剂。酶活性表示为每升当量毫单位(Eq.mU/l)。
样品制备:将3ml WPC(10%蛋白)或IMF(10%蛋白)与3ml 1-丁醇混合,加盖,用涡旋混合30-40s。然后将样品在2500-3500g下离心30min。水相从脂肪层下面收集,并使用所提供的稀释缓冲液将其稀释至 1/5-1/200(推荐)。
按照检测试剂盒中的说明书制备标准溶液,得到了15,000Eq.mU/l 的工作溶液,将其随后用所提供的稀释缓冲液稀释,以产生浓度在 5,000-100Eq.mU/l的标准溶液:
·STD1 5000Eq.mU/l:125μl(15,000Eq.mU/l)+250μl稀释缓冲液;
·STD2 3000Eq.mU/l:75μl(15,000Eq.mU/l)+300μl稀释缓冲液;
·STD3 1000Eq.mU/l:25μl(15,000Eq.mU/l)+350μl稀释缓冲液;
·STD4 500Eq.mU/l:50μl(STD1)+450μl稀释缓冲液;
·STD5 300Eq.mU/l:50μl(STD2)+450μl稀释缓冲液;
·STD6 100Eq.mU/l:50μl(STD3)+450μl稀释缓冲液。
进行测定:用300μl洗涤缓冲液洗涤ELISA条带的每个孔,倒置板去除洗涤缓冲液。该操作重复4次。在相应的孔中加入100μl标准、对照和样品溶液,将板盖上,轻轻摇动1min,在18-25℃下培育1小时。培育后,从孔中(通过倒置板)去除标准、对照和样品溶液,并进行上述洗涤步骤。每个孔加入100μl底物溶液。将板盖上,轻轻摇动1min,在35-38 ℃下培育2小时。黄色出现。培育后,向所有孔中加入50μl停止溶液(试剂盒中提供)。移除塑料盖,使用酶标仪在405nm处读取板。通过绘制标准样品的光密度读数,得到了校准曲线,该曲线用于测定WPC和IMF 产品中碱性磷酸酶活性。
结果在下表中给出:
ALP活性 | |
天然WPC70 | 195mU/g |
失活WPC70 | 未测定到 |
天然IMF | 33mU/g |
失活IMF | <3mU/g |
实施例5:测定碱性磷酸酶活性
通过ISO标准11816-1(2018年10月有效的版本)以mU/L测定根据本发明的天然的WPC和IMF产品(不变性和变性)中的碱性磷酸酶(ALP) 活性。根据测试方案制备和测试各溶液。下表中给出了所有四种产品在1.3重量%蛋白质(基于总重量计)──其为标准婴儿配方物的蛋白质含量──时的结果:
ALP活性 | |
天然WPC70 | 1.8×10<sup>4</sup>mU/L |
变性WPC70 | <20mU/L |
天然IMF | 2.1×10<sup>4</sup>mU/L |
变性IMF | <20mU/L |
实施例6:对肠道成熟和/或肠道渗透性的作用
分析了根据实施例1的方法获得的具有超过90%的高天然性的失活的乳清蛋白产品用于改善仔猪的肠道成熟和/或肠道渗透性的性质。将所述仔猪的体内肠道渗透性与如下文所述通过深度加热变性为天然程度低于40%的相同的乳清蛋白产品进行比较。
仔猪研究:在大约90%的妊娠期(2窝,早产组)和大约96%的妊娠期 (1窝,近足月组),通过剖腹产从母猪中分娩早产猪(Danish Landrace x Large White x Duroc)。如之前所记载的(Cilieborg MS,Boye M,Thymann T,et al.,J Parenter Enteral Nutr.2011;35:32–42),进行了通过口胃饲管和血管导管的外科制剂以给予肠外营养(PN)和被动免疫。根据出生体重将每窝猪分为2组(n=7-9/组/每窝),分别接受两种类型的肠内饮食:
1)PAST-WPC组,接受基于失活WPC的配方物(即通过在73℃下加热30 秒的巴氏杀菌WPC,其蛋白质保持天然形式;天然乳清蛋白配方物组);和2)DENAT-WPC组,接受经过巴氏杀菌且进行了另外的热处理的WPC 配方物(即,在73℃下加热30秒+80℃下加热6分钟;加热的乳清蛋白配方物组),所述另外的热处理导致大量蛋白变性。本研究中使用的WPC 由生牛乳通过实施例1的不包括加热的方法制备。各配方物均由80g/L 乳清蛋白浓缩物、50g/LPepdite、50g/L Liquigen和30g/L Calogen组成。配方物中的常量营养素组成如下:3629kJ/L能量、59g/L蛋白质、 52g/L脂肪、39g/L碳水化合物、16g/L乳糖。在研究期间,各组中的猪接受如下表所述的肠内营养。此外,从第1天至第5天,所有猪均接受4 ml/kg/h的肠外营养(PN)。无论分配到哪个饮食组,早产和近足月仔猪都有相同的体重增加(数据未显示)。PN溶液基于市售产品(Kabiven, Fresenius Kabi),并调整了营养组成以满足猪的需求。在第5天,对猪进行麻醉并采集血液。随后,对猪实施安乐死,然后采集尿液和肠组织。
表1喂养方案
时间 | 肠内营养喂养方案 |
第1天 | 6ml/kg/3h |
第2天 | 8ml/kg/3h |
第3天 | 8ml/kg/3h |
第4天 | 10ml/kg/3h |
第5天 | 10ml/kg/3h |
体内肠道渗透性测试:为了测试肠道渗透性,在处死之前3-5h,猪接受了含有5%乳果糖和2%甘露醇的口服丸剂(15mL/kg)。在尸体剖检时采集尿液样品,以测量乳果糖和甘露醇的浓度,并如先前所记载的计算乳果糖/甘露醇的比例(Blood J,Ingle AR,AllisonN,et al.,Ann Clin Biochem.1991;28:401–6)。
肠道成熟的评估:为了测定肠道成熟情况,评估了结肠结构,评估了组织切片中的Ki67阳性细胞以确定隐窝中增殖细胞的程度,测定了肠内分泌细胞的存在和肠道碱性磷酸酶(iALP)的酶活性水平。将低聚甲醛固定的结肠组织进行组织学处理,并用苏木精-曙红染色。测量隐窝深度,以μm计。对组织切片进行Ki67免疫染色,并在结肠切片的隐窝中对增殖细胞(Ki67阳性细胞)进行评分。增殖性上皮细胞(即Ki67染色)、肠内分泌细胞(即血清素(5HT)阳性细胞)的免疫染色和iALP的刷状缘表达(即, iALP染色)的测定,进行了免疫组织化学法,如先前所记载的(Marit Navis,Martins Garcia,Ingrid B Renes etal.,EMBO Reports(2018),DOI 10.15252/embr.201846221)。使用了以下抗体:兔多克隆抗Ki67(1:8000, Abcam,ab15580)和小鼠单克隆抗5HT-H209(1:100,ThermoFisherScientific MA5-12111)。此外,通过NBT/BCIP转换测定组织玻片的iALP 刷状缘活性,如先前所记载的(Srivillibhuthur M,Verzi et al.,DOI: 10.1016/j.ydbio.2018.04.015)(Schneeberger K,Middendorp S et al.,DOI: 10.1073/pnas.1516672112)。
此外,将来自结肠的组织均化,并且根据制造商的说明书(磷酸酶底物,ThermoFisher Scientific)和先前所记载(Arnal ME,Lallès JP et al., DOI:10.1371/journal.pone.0118092),在L-苯丙氨酸的存在下(Gosh NK 和Fishman WH,PMID:5911626),通过分光光度法用二乙醇胺测定法 (EC 3.1.3.1)测量pNPP水解来测定iALP的活性。
结果:仔猪经历了规律的体重增加,其中两个处理组之间没有体重增加的显著差异,并且仔猪的结肠重量也没有差异(数据未显示)。仔猪尿液中基于乳果糖/甘露醇(Lac/Man)比的体内肠道渗透性显示出,在足月组中,天然乳清蛋白配方物处理的仔猪的Lac/Man比显著降低(p<0.05),表明天然乳清蛋白配方物喂养的仔猪的肠道渗透性更低并且肠道成熟有所改善(图1)。
结肠的组织学分析显示,用天然乳清蛋白配方物处理的早产仔猪和足月仔猪都具有明显降低的隐窝深度,表明更自然的肠道发育。从文献中已知的是,与哺乳的仔猪相比,配方物喂养的仔猪绒毛更长并且隐窝更深(早产仔猪组*p<0.5,足月仔猪组**p<0.01),这种现象在人类婴儿中同样可见。因此,天然乳清蛋白配方物喂养的仔猪中隐窝深度的降低至少部分逆转了该配方物对隐窝深度的影响(图2a)。在早产组(p<0.001)和足月组 (p<0.05)(图2b)中,与加热的乳清蛋白配方物喂养的仔猪相比,在天然乳清蛋白配方物喂养的仔猪中观察到在组织切片上每个隐窝的Ki67阳性增殖细胞数目明显减少。每个隐窝较低的增殖细胞水平表明,天然乳清蛋白配方物喂养的仔猪的表型更加分化,且肠道成熟度改善。来自天然乳清蛋白喂养的仔猪的组织学结肠切片具有明显的尖端刷状缘ALP活性染色 (数据未显示)。图2c显示,与加热的乳清蛋白配方物喂养的早产动物相比,在天然乳清蛋白配方物喂养的早产组中,具有组织学阳性碱性活性的动物的数量明显更多。在足月仔猪中,可观察到这样的趋势:用天然乳清蛋白配方物处理的动物比用加热的乳清蛋白配方物处理的动物的肠道碱性磷酸酶活性的阳性更高。图4表明,与接受加热的乳清蛋白配方物的仔猪相比,接受天然乳清蛋白配方的近足月仔猪表现出增加的肠内分泌细胞计数,表明接受本发明的组合物的受试者的肠道渗透性和肠道成熟改善。
结肠匀浆中肠碱性磷酸酶(iALP)活性的光谱分析显示,与那些早产并喂给加热的乳清蛋白配方物的仔猪相比,喂给天然乳清蛋白配方物的早产仔猪的iALP活性显著增加。与喂给加热的乳清蛋白配方物的仔猪相比,喂给天然乳清蛋白配方物的近足月仔猪呈现iALP活性增加的趋势(图3a)。在早产仔猪或近足月仔猪中,不同饮食组之间的iALP特异性阻断后,没有观察到样品中的ALP活性的显著差异(图3b)。用天然乳清蛋白组合物喂养的动物中iALP活性的增加表明肠道具有更成熟的免疫功能。
实施例7.含天然乳清蛋白浓缩物(WPC)的婴儿配方物
下面举例说明含本发明的天然乳清蛋白的婴儿配方物。该婴儿配方物的主要营养成分如下:
婴儿配方物旨在喂养0至3个月龄的足月婴儿。在能量值方面,婴儿配方物包含8En%蛋白质、44En%碳水化合物、46En%脂肪和2En%膳食纤维。根据现行的营养指南,含有矿物质和维生素,以制备完整的婴儿肠内喂养物。由于值的四舍五入,可能未达到指示的总数。RTF=即食 (Ready-To-Feed)。婴儿配方物中存在的乳清蛋白的天然性大于90%。RTF婴儿配方物的ALP活性要么不高于350mU/L且被认为是ALP阴性的,要么是ALP阳性的,此时ALP活性高于350mU/L。通过在能够保留细菌的膜上进行微滤,确保了ALP阳性婴儿配方物的微生物安全性。
实施例8.含天然乳清蛋白浓缩物(WPC)的早产儿配方物
下面举例说明含本发明的天然乳清蛋白的早产儿配方物。该早产儿配方物的主要营养成分如下。
单位 | 每100ml RTF | 每100kcal | |
能量价值 | kcal | 78 | 100 |
蛋白质 | g | 2.6 | 3.3 |
-乳清 | g | 1.5 | 2.0 |
-酪蛋白 | g | 1.0 | 1.3 |
碳水化合物 | g | 8.2 | 10.4 |
-其中糖 | g | 6.1 | 7.7 |
-葡萄糖 | g | 0.3 | 0.4 |
-乳糖 | g | 5.5 | 6.9 |
-麦芽糖 | g | 0.2 | 0.3 |
-多糖 | g | 2.1 | 2.6 |
脂肪 | g | 3.8 | 4.8 |
-植物 | g | 3.4 | 4.2 |
-动物 | g | 0.3 | 0.5 |
-饱和 | g | 1.6 | 2.0 |
-单不饱和 | g | 1.4 | 1.8 |
-多不饱和 | g | 0.8 | 1.0 |
膳食纤维 | g | 0.6 | 0.7 |
矿物质 | g | 0.2 | 0.2 |
早产儿配方物旨在喂养早产儿,意指怀孕37周之前出生的婴儿。与旨在用于喂养足月婴儿的婴儿配方物相比,蛋白质量增加,原因与预期在早产婴儿中发生的追赶生长有关。在能量值方面,早产儿配方物包含13 En%蛋白质、42En%碳水化合物、44En%脂肪和1En%膳食纤维。RTF =即食(Ready-To-Feed)。根据营养指南含有矿物质和维生素,以制备完整的早产儿肠内喂养物。由于值的四舍五入,可能未达到指示的总数。早产儿配方物中存在的乳清蛋白的天然性大于90%。RTF早产儿配方物的ALP活性不高于350mU/L且被认为是ALP阴性的。
Claims (20)
1.在以下方面使用的天然乳清蛋白:
(a)改善肠道成熟;和/或
(b)降低和/或预防肠道渗透性。
2.根据权利要求1所述的使用的天然乳清蛋白,其用于降低和/或预防肠道渗透性。
3.根据权利要求1或2所述的使用的天然乳清蛋白,其中在弱势受试者、优选婴儿、更优选早产婴儿中改善肠道成熟、和/或降低和/或预防肠道渗透性。
4.根据前述权利要求中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中改善的肠道成熟降低对食物不耐受和/或肠道炎症如坏死性小肠结肠炎的易感性。
5.根据前述权利要求中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中天然乳清蛋白的天然性超过80%、优选超过90%、最优选超过95%。
6.根据前述权利要求中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中至少70%、更优选75-95%、最优选78-85%的α-乳白蛋白是天然的和/或至少70%、更优选80-100%、最优选85-95%的β-乳球蛋白是天然的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中肠道成熟的改善和/或肠道渗透性的降低和/或预防的进行,是就在喂食同样的乳清蛋白的受试者中的发生而言的,所述同样的乳清蛋白被制成非天然的,优选通过充分加热以实现小于20%的天然性。
8.根据前述权利要求中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中肠道至少包括结肠。
9.根据前述权利要求中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中天然乳清蛋白为牛乳清蛋白,所述牛乳清蛋白通过基于膜过滤的技术获得以保留乳清蛋白的天然性。
10.根据前述权利要求中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中天然乳清蛋白可通过包括以下步骤的方法获得:
(a)将脱脂乳处理成酪蛋白流、乳清蛋白流和乳糖流,这通过以下进行:
(i)将脱脂乳在能够保留细菌并渗透乳蛋白的膜上进行微滤,或进行巴氏杀菌步骤,以提供脱细菌乳;
(ii)使源自步骤(i)的渗透物在能够保留酪蛋白并渗透乳清蛋白的膜上进行微滤,以提供作为保留物的酪蛋白流和含乳清蛋白的渗透物;
(iii)将源自步骤(ii)的渗透物分级成乳清蛋白流和乳糖流。
11.根据前述权利要求中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中天然乳清蛋白包含在营养组合物中,优选婴儿配方物中,更优选早产儿配方物中。
12.根据权利要求10所述的使用的天然乳清蛋白,其中营养组合物可通过包括以下步骤的方法获得:
(a)将脱脂乳处理成酪蛋白流、乳清蛋白流和乳糖流,这通过以下进行:
(i)将脱脂乳在能够保留细菌并渗透乳蛋白的膜上进行微滤,或进行巴氏杀菌步骤,以提供脱细菌乳;
(ii)使源自步骤(i)的渗透物在能够保留酪蛋白并渗透乳清蛋白的膜上进行微滤,以提供作为保留物的酪蛋白流和含乳清蛋白的渗透物;
(iii)将源自步骤(ii)的渗透物分级成乳清蛋白流和乳糖流;
(b)将源自步骤(a)的至少一部分酪蛋白流、至少一部分乳清蛋白流与乳糖源组合,以获得重组流;
(c)任选地对来自步骤(b)的重组流进行巴氏杀菌,
(d)在营养组合物的制造中使用源自步骤(b)或(c)的重组流。
13.根据权利要求9或12所述的使用的天然乳清蛋白,其中脱脂乳为脱脂牛乳。
14.根据权利要求9、12或13中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中使用源自步骤(a)的至少一部分乳糖流作为步骤(b)中的乳糖源。
15.根据权利要求9、12-14中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中步骤(iii)通过在能够保留乳清蛋白并渗透乳糖的膜上超滤而实施,以提供作为保留物的乳清蛋白流和包含乳糖的渗透物,优选其中超滤步骤(iii)以20-200的体积浓缩因子操作。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中脱脂乳是婴儿配方物唯一的蛋白质源。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中步骤(d)的制造包括以下中的至少一种:干燥,浓缩,补充维生素、矿物质、脂质和/或膳食纤维,包装。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中营养组合物为通过喷雾干燥获得的粉末,所述喷雾干燥优选作为步骤(d)的一部分。
19.根据权利要求11-18中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中营养组合物未进行热处理和/或其中婴儿配方物表现出至少25mU/g的碱性磷酸酶活性。
20.根据权利要求11-18中任一项所述的使用的天然乳清蛋白,其中营养组合物为经巴氏杀菌的营养组合物和/或其中营养组合物表现出至多20mU/g、优选至多5mU/g的碱性磷酸酶活性。
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