CN113056193A - 用peg磷脂分子的离体器官处理 - Google Patents
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Abstract
通过将包含PEG‑磷脂分子的溶液离体输注到器官移植物的脉管系统中来离体处理所述器官移植物。在所述脉管系统中离体孵育所述包含PEG‑磷脂分子的溶液，以实现用所述PEG‑磷脂分子包被所述脉管系统的内皮内膜的至少一部分，同时保持所述器官或所述器官的所述部分浸没于包含PEG‑磷脂分子的器官保存溶液中。这种用PEG‑磷脂离体处理器官移植物保护了所述器官移植物免受血栓炎症的影响，并且减少了否则当在受体中再灌注所述器官移植物时发生的血压下降。
Description
技术领域
本发明大体上涉及离体器官处理，并且具体地涉及能够抑制或预防由器官再灌注诱发的血栓炎症和低血压的此类离体器官处理。
背景技术
缺血再灌注(I/R)损伤(IRI)是多种病状的病理学的主要诱因，所述病状包括移植、血栓性病症、脓毒症和心肺转流，所有这些都诱发血栓炎症。
迄今为止，肾移植是终末期肾病患者最有效的治疗。尽管与1960年代的引入相比，治疗结果有显著改善，但5年后仍有25％的移植物损失，并且10年后有几乎50％的移植物损失。改善肾脏移植结果的主要目标是IRI，因为IRI引起急性肾衰竭、移植物功能延迟和远端器官衰竭。免疫抑制并不在很大程度上影响体液先天免疫系统，并且因此不减弱IRI。器官短缺也阻碍了移植领域。增加供体库的一种选择是边缘器官(例如，心脏死亡(deceased-after-cardiac-death；DCD)供体的器官)的使用增加。但是，这些器官也受到IRI的严重影响。
在缺血期间，新陈代谢转换为缺氧状况，最终导致炎性状态，这是由许多基因的上调和下调触发的，所述基因包括核因子活化B细胞κ轻链增强子(NF-κB)，从而细胞因子、趋化因子和组织因子(TF)，还有保护免受缺血影响的基因，诸如血红素加氧酶1(HO-1)、缺氧诱导因子(HIF)1和2以及硝基酪氨酸。在含氧量正常的条件下，内皮细胞表面被称为糖萼(GCX)的带负电荷的“毛状”网覆盖，其包含蛋白聚糖、糖胺聚糖和糖蛋白的复杂网络，所述糖蛋白包括抗炎和抗凝血蛋白，以确保微血管稳态并预防血栓炎症。此外，厚GCX遮蔽细胞表面和粘附分子，例如细胞间粘附分子1(ICAM-1)、脉管细胞粘附分子1(VCAM-1)和E-选择素，从而防止白细胞和血小板募集到内皮表面上。GCX对氧化应激和缺血诱发的结构伤害非常敏感，这通常导致GCX覆层快速损失。这是由内皮细胞内膜中肝素酶和金属蛋白酶的表达引起的，导致保护内皮细胞免受先天性免疫攻击的GCX的裂解和分解。GCX带有许多生长因子，例如肝细胞生长因子(HGF)和血管内皮生长因子(VEGF)，从而在GCX分解期间释放出这些生长因子。这还导致补体、凝血和接触系统的调节因子从细胞表面释放出来。此类调节因子是例如抗凝血酶(AT)、蛋白C、组织因子途径抑制剂(TFPI)、C4b结合蛋白(C4BP)、因子H和C1抑制剂(C1-INH)，因此内皮细胞表面将不抵抗补体、凝血和接触系统的攻击。最后，如果缺血持续存在，则三磷酸腺苷(ATP)储备耗尽，导致细胞凋亡和坏死。
缺血器官的再灌注诱发修复过程，但是由于缺血已诱发了病理变化，所以再灌注最初开始对器官造成毁灭性损伤。快速的氧合作用产生涉及活性氧(ROS)的生成的损伤，并且未保护的内皮表面触发补体和接触系统的破坏性活化。在移植中，肾移植物中的胶原凝集素-11/12(CL-11/12)表达识别缺血细胞，并经由凝集素途径(LP)促进补体活化。而且LP的其他识别分子(如甘露糖结合凝集素(MBL)和纤维胶凝蛋白-2)已与补体活化关联。补体活化的证据是C4d在内皮细胞上沉积以及膜攻击复合物(MAC)在近脉管实质中沉积，指示这些区域的细胞伤害。通过上调的TF表达和接触系统活化触发的纤维蛋白沉积表明凝血系统参与其中。结合补体活化、血管性血友病因子(vWF)的上调和暴露，然后血小板和多形核中性粒细胞(PMN)与内皮表面结合和活化，引起血栓炎症。在肾脏移植的小鼠模型中明确证明了这种血栓炎症的大部分是由局部产生的补体因子驱动的，其中C3的敲除保护移植器官免受排斥的影响。
移植器官的再灌注还与再灌注后的血液动力学不稳定相关联。这种现象先前被描述为再灌注后综合征(PRS)，首次描述于在肝脏移植物的再灌注之后经历严重的血液动力学不稳定的肝脏移植受体中。但是，这种现象还在肾脏和胰腺移植受体中观察到，这些受体常常在再灌注之后立即遭受血液动力学不稳定。因此，全身动脉压的快速降低导致移植物灌注受损和移植物热缺血的延长。这些患者可能遭受移植物功能延迟、排斥风险增加和移植物过早损失。
两亲性聚合物聚(乙二醇)-磷脂(PEG缀合磷脂或简称PEG-磷脂)通过疏水相互作用自发的结合到细胞膜的脂质双层膜中[1、2]。此外，在糖尿病小鼠中进行门静脉输注后，通过PEG-磷脂形成人造细胞表面层可以减弱立即经血液介导的炎性反应(IBMIR)并延长存活和胰岛功能[3、6]。
先前已显示，与先天性免疫调节因子(如三磷酸腺苷双磷酸酶和因子H)缀合的PEG-磷脂在体外保护细胞和材料表面抵抗先天性免疫攻击[4、5]。
但是，需要与器官移植有关的改善。
发明内容
大体目的是提供与器官移植有关的改善。
通过本文所公开的实施方案满足了这个目的和其他目的。
本发明在独立权利要求中限定。本发明另外的实施方案在从属权利要求中限定。
处理器官或器官的一部分的离体方法包括将包含PEG-磷脂分子的溶液离体输注到所述器官或所述器官的所述部分的脉管系统中。所述方法还包括在所述脉管系统中离体孵育所述包含PEG-磷脂分子的溶液，以实现用所述PEG-磷脂分子包被所述脉管系统的内皮内膜的至少一部分，同时保持所述器官或所述器官的所述部分浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中。
本发明还涉及用于抑制或预防受体受试者在器官移植物的再灌注之后产生的与再灌注相关联的低血压的PEG-磷脂。
如通过凝血标志物(如TAT)和补体标志物(如C3a和sC5b-9)的血浆水平所反映，与未处理的对照器官移植物相比，用PEG-磷脂分子离体处理的器官移植物的血栓炎症显著较少。而且在PEG-磷脂处理的器官移植物中，细胞因子表达(特别是IL-6和IL-1β)被大大抑制。在PEG-磷脂处理的器官移植物中，器官功能得到改善。PEG-磷脂处理的器官移植物还显示补体标志物(如C3b和MAC)的沉积和C5aR的表达减少。用PEG-磷脂分子离体处理器官移植物的一个非常令人惊讶但医学上显著的效应是，这种PEG-磷脂处理能够减少受体中常常与器官移植物的再灌注相关联的破坏性血压下降。此外，4天之后，PEG-磷脂处理能够减少与适应性免疫反应的活化相关联的T细胞依赖性细胞因子IL-4和IL-12的增加。
附图说明
可以通过参考以下结合附图的描述来最佳地理解实施方案以及它的其他目的和优点，在附图中：
图1示意性地示出了PEG-脂质分子与细胞膜的脂质双层的疏水相互作用的机制。
图2A至图2C示出了在体外Chandler环模型中分析包被MSC时，与对照(未包被的细胞)相比，PEG磷脂的各种功能基团对凝血(图2A)和补体(图2B和图2C)的影响。
图3示出了在用25mL 2mg/mL FITC-PEG-磷脂灌注期间的60min期间的液相浓度。圆圈指示未连接肾脏，并且正方形指示连接了肾脏。计算的PEG-磷脂的摄取为76％。
图4A至图4F示出了在再灌注后的以下时间点，从对照和处理的肾脏取回的活检：5min(图4A：对照，图4B：处理的)；60min(图4C：对照，图4D：处理的)；以及360min(图4E：对照，图4F：处理的)。用生物素-PEG-磷脂溶液灌注肾脏，并通过用链霉亲和素-488对比染色来对用PEG-磷脂包被肾脏内皮进行验证。通过共焦显微镜分析切片。
图5A至图5E示出了短期同种异体猪肾脏移植模型中的补体活化。来自肾脏的活检中的图5A血浆C3a、图5B sC5b-9、图5C C4d、图5D C3b和图5E MAC沉积。正方形和带有箭头的长条代表PEG-磷脂处理的肾脏，并且圆圈和没有箭头的长条代表未处理的对照。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001。
图6A至图6D示出了短期同种异体肾脏移植模型中的凝血活化。图6A血浆TAT，图6BTF，图6C FXII/AT并且图6D FXII/C1INH。正方形代表PEG-磷脂处理的肾脏，并且圆圈代表未处理的对照。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
图7A至图7C示出了短期同种异体肾脏移植模型中促炎性细胞因子的浓度。图7A血浆IL-1β，图7B IL-6，并且图7C TNF。正方形代表PEG-磷脂处理的肾脏，并且圆圈代表未处理的对照。*p＜0.05；**p＜0.01。
图8A至图8C示出了长期同种异体肾脏移植模型中的补体和凝血活化。图8A血浆C3a，图8B sC5b-9，并且图8C TAT。正方形代表PEG-磷脂处理的肾脏，并且圆圈代表未处理的对照。*p＜0.05；**p＜0.01。
图9A至图9L示出了长期同种异体肾脏移植模型中细胞因子/趋化因子的浓度。图9A血浆INFγ，图9B IL-1β，图9C IL-1α，图9D IL-1R，图9E IL-2，图9F IL-4，图9G IL-6，图9H IL-10，图9I IL-8，图9J IL-12，图9K IL-18，并且图9L TNF。正方形代表PEG-磷脂处理的肾脏，并且圆圈代表未处理的对照。
图10A和图10B示出了短期(图10A)和长期(图10B)同种异体肾脏移植模型中PEG-磷脂处理的肾脏的功能评估。在图10A中评估了利尿，并且在图10B中测量了肌酸酐水平。正方形代表PEG-磷脂处理的肾脏，并且圆圈代表未处理的对照。*p＜0.05。
图11示出了在长期同种异体肾脏移植模型中，与移植对照肾脏的动物相比，在移植PEG-磷脂处理的肾脏的猪中，针对在再灌注之后即刻脉搏率的补偿性增加的功能评估。*p＜0.05。
图12示出了(1)获取、(2)静态低温灌注和(3)PEG-磷脂灌注之后猪肾脏的大体形态。
图13示出了使用CCRF-CEM细胞的具有不同长度的PEG亚基(1kDa圆圈，5kDa正方形和40kDa三角形)的PEG-磷脂分子的保留。
图14示出了[68Ga]NO2A-丙基叠氮化物的合成。
图15示出了68Ga-NO2A-PEG-脂质的合成。
图16A和图16B示出了在4℃下将猪肾脏在补充PEG-磷脂的HTK溶液(处理的)或仅HTK溶液(对照)中孵育24小时之后的TAT值和血浆肌酸酐值。
图17A至图17D示出了长期同种异体肾脏移植模型中的补体和凝血活化以及肌酸酐水平，血浆TAT(图17A)、C3a(图17B)、sC5b-9(图17C)以及肌酸酐(图17D)。带有正方形的线代表PEG-磷脂处理的肾脏，并且带有圆圈的线代表未处理的对照。*p＜0.05。
图18A至图18G示出了长期同种异体肾脏移植模型中细胞因子/趋化因子的浓度，血浆IL-1β(图18A)、IL-2(图18B)、IL-4(图18C)、IL-6(图18D)、IL-8(图18E)、IL-10(图18F)以及TNF(图18G)。正方形代表PEG-磷脂处理的肾脏，并且圆圈代表未处理的对照。*p＜0.05。
图19示出了将PEG-脂质分子输注到来自四头不同的猪的肾脏中之后5kDa PEG-脂质和40kDa PEG-脂质的摄取，其中一个肾脏用于5kDa PEG-脂质并且另一个用于40kDaPEG-脂质。肾脏用FITC-PEG-磷脂溶液灌注，并且将用PEG-磷脂对肾内皮和实质的包被的验证进行观察。通过共焦显微镜分析切片。
图20示出了PEG-脂质分子在三种常用的灌注液(HTK、IGL-1和UW)中的混合性。在浓度为2mg/mL PEG-脂质的这些混合物中的任一种中均未观察到沉淀。
具体实施方式
本发明大体上涉及离体器官处理，并且具体地涉及能够治疗、抑制或预防由器官再灌注诱发的血栓炎症(其在适应性免疫系统的活化之前)和低血压的此类离体器官处理。
本发明的离体方法通过保护性遮蔽或包被此类器官或此类器官的部分的脉管系统的内皮内膜或内皮以及实质来得到器官移植和器官处理的显著改善。这种保护性包被有助于有效防止血栓炎症以及缺血再灌注(I/R)损伤(IRI)的有害影响。
糖萼对于确保微脉管止血和预防血栓炎症来说至关重要。但是，这种糖萼对氧化应激和缺血诱发的伤害非常敏感。因此，在与器官获取和体外器官保存有关而发生的缺血期间，保护性糖萼包被层快速损失。一旦器官移植物被移植并再灌注，便诱导了修复过程，由于糖萼不存在或被破坏，修复过程对器官移植物开始毁灭性的损伤。因此，补体和接触系统被活化。血小板被消耗，并且白细胞被活化并渗入器官移植物中。由于这些系统的活化，最终生成细胞因子，导致细胞死亡和移植物损失或移植物功能延迟。对器官移植物的这种毁灭性损伤是血栓炎症，其主要由体液先天免疫系统触发，体液先天免疫系统主要由血液的级联系统(即补体、接触/凝血和纤溶系统)组成。这些系统的活化随后诱导内皮细胞、白细胞和血小板的活化，最终导致血栓性和炎性反应。
如本文所示，通过用聚(乙二醇)-磷脂(PEG-磷脂)分子离体处理器官或器官的一部分，可以保护器官或器官的该部分免受血栓炎症。因此，PEG-磷脂分子能够结合器官或器官的该部分的脉管系统的内皮内膜的细胞膜，从而补偿糖萼的损失。因此，PEG-磷脂分子形成内皮的保护性包被层，其抑制血栓炎症或至少显著减少血栓炎症的有害影响，包括较低水平的凝血和补体活化、细胞因子表达的抑制以及移植物功能的大体改善。
特别地，用PEG-磷脂分子离体处理器官导致细胞因子(例如包括白介素4(IL-4)和IL-12的T细胞特异性细胞因子)的显著减少。在未处理的对照器官中，在移植后数天有大量此类细胞因子，这对继续免疫和未来免疫抑制有负面效应。因此，通过PEG-磷脂分子包被内皮抑制了移植之后细胞因子诱导的效应和对器官或器官的该部分的损害，并且还改善了移植之后免疫抑制的结果。
通过用PEG-磷脂分子离体处理器官或器官的一部分而实现的另一个非常令人惊讶的效应是，治疗、抑制或预防了在器官移植物的再灌注之后由与再灌注发展相关联的心率增加和低血压所致的血液动力学不稳定。与移植相关的这种低血压可能导致灌注不良、器官衰竭并且甚至导致患者死亡。当将器官移植物连接到患者的脉管系统并由此进行再灌注时，诱发低血压。现今，治疗这种低血压是器官移植期间的重要任务，因为如果不能治疗低血压，则存在移植期间患者死亡的巨大风险。然而，通过在移植之前用PEG-磷脂分子离体处理器官移植物，可以预防或至少显著抑制或减少低血压。因此，通过使用本发明的PEG-磷脂分子，降低了与器官移植相关的低血压诱发的伤害的风险。本发明的PEG-磷脂分子从而可用于治疗、预防和/或抑制再灌注后综合征(PRS)。
本发明的一个方面从而涉及一种处理器官或器官的一部分的离体方法。所述方法包括将包含PEG-磷脂分子的溶液离体输注到器官或器官的一部分的脉管系统和任选地实质中。所述方法还包括在脉管系统和任选地实质中离体孵育包含PEG-磷脂分子的溶液，以实现用PEG-磷脂分子包被脉管系统的内皮内膜的至少一部分和优选地实质，同时保持器官或器官的一部分浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中。
因此，离体方法包括将PEG-磷脂分子引入到器官或器官的一部分的脉管系统中，并在其中允许PEG-磷脂分子与内皮和实质的细胞膜相互作用并结合。图1示意性地示出此原理，其中PEG-磷脂分子与内皮的脂质双层膜疏水相互作用，从而通过磷脂基团将PEG-磷脂分子锚定或连接在细胞膜中。
当将器官或器官的一部分浸入或浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中时，PEG-磷脂分子与内皮和任选地实质(例如在肾脏的情况下，肾实质)的脂质双层膜之间的相互作用离体发生。如本文所呈现的实验数据所指示，即使器官或器官的该部分的脉管系统和任选地实质包被了PEG-磷脂分子，相比于仅将器官或器官的该部分浸没于不含任何PEG-磷脂分子的器官保存溶液中，将器官保持浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中得到显著更低的级联系统活化和细胞因子表达。
因此，为了实现器官或器官的部分的有效离体处理，器官或器官的该部分的脉管系统和任选地实质应暴露于PEG-磷脂分子，并且器官或器官的该部分应浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中。相比于仅将包含PEG-磷脂分子的溶液离体输注到器官或器官的该部分的脉管系统和任选地实质中，此类离体处理的抗血栓炎性效应显著改善。实际上，在冷缺血期间，当将器官或器官的该部分保持浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中时(即，即使在器官或器官的该部分再灌注之前)，本发明的离体处理的抗血栓炎性效应已被诱导。
在特定的实施方案中，首先将包含PEG-磷脂分子的溶液离体输注到器官或器官的该部分的脉管系统和任选地实质中。在将器官或器官的该部分从供体身体外植和取出之后尽可能早地有利地进行此离体输注。然后将灌注的器官或器官的部分浸没于包含PEG-磷脂的器官保存溶液中并保持在其中，优选地处于降低的温度，诸如约4℃，这将在本文进一步讨论。
在另一个特定的实施方案中，首先将器官或器官的该部分浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中，然后将包含PEG-磷脂分子的溶液离体输注到器官或器官的该部分的脉管系统和任选地实质中。这种离体输注可以在将器官或器官的该部分浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中的同时进行。可替换地，暂时从器官保存溶液中取出器官或器官的该部分以进行离体输注，然后放回到包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中。
在一个实施方案中，所述方法还包括将器官保存溶液离体输注到脉管系统中，以将未结合的PEG-磷脂分子从脉管系统冲走。因此，优选地使用器官保存溶液以一个或多个(即，至少两个)洗涤步骤洗去未结合的PEG-磷脂分子。
这种器官保存溶液还可以用于在输注包含PEG-磷脂分子的溶液之前以一个或多个洗涤步骤洗涤器官或器官的该部分的脉管系统。在这种实施方案中，所述方法还包括在将包含PEG-磷脂分子的溶液离体输注到脉管系统中之前，将器官保存溶液离体输注到脉管系统中。在添加PEG-磷脂分子之前初始输注器官保存溶液将洗涤器官或器官的该部分的脉管系统，从而有利于用PEG-磷脂分子有效包被内皮。
在一个实施方案中，离体输注包含PEG-磷脂分子的溶液包括离体夹紧脉管系统的动脉和静脉中的一个。此实施方案还包括将包含PEG-磷脂分子的溶液离体输注到动脉和静脉中的另一个中，以及离体夹紧动脉和静脉中的另一个。
因此，在一个实施方案中，首先将器官或器官的该部分的脉管系统的静脉(或动脉)夹紧，以防止待添加的溶液流出脉管系统。将具有PEG-磷脂分子的溶液添加至脉管系统的动脉(或静脉)中，然后夹紧此动脉(或静脉)，以防止待添加的溶液流出脉管系统。因此，通过夹紧来封闭器官或器官的该部分中的脉管系统的血管入口和出口，从而使包含PEG-磷脂分子的溶液保持在脉管系统内，从而使PEG-磷脂分子结合至脉管系统的内皮。
在另一个实施方案中，将具有PEG-磷脂分子的溶液输注到器官或器官的该部分的动脉(或静脉)中，直到溶液出现在器官或器官的该部分的静脉(或动脉)。这证实了，具有PEG-磷脂分子的溶液已经填充了脉管系统。此时，将动脉和静脉夹紧。
可以通过静脉或通过动脉添加包含PEG-磷脂分子的溶液。在特定的实施方案中，将溶液输注到动脉中。在这种特定的实施方案中，然后优选地对脉管系统的静脉进行任选的初始夹紧。
上文所述的夹紧实施方案可特别用于当离体输注到脉管系统中的溶液与器官或器官的该部分浸没于其中的器官保存溶液不同的情况，和/或溶液中包含的PEG-磷脂分子与器官保存溶液中包含的PEG-磷脂分子不同的情况。在其他情况下，不需要夹紧，因为然后将离体输注与其中浸没器官或器官的该部分相同的含有PEG-磷脂的器官保存溶液。
包含PEG-磷脂分子的溶液优选在脉管系统中离体孵育10分钟至48小时的一段时间，以使PEG-磷脂分子与内皮细胞膜疏水相互作用，从而包被器官或器官的该部分的脉管系统的至少一部分。离体孵育优选地进行20分钟至36小时、并且更优选地30分钟至24小时，例如30分钟至12小时、至8小时、至4小时或至1小时。
输注到脉管系统中的包含PEG-磷脂分子的溶液的量取决于器官的类型和器官的大小(成人相对于儿童)。一般来讲，溶液的体积应足以填充器官的脉管系统。在大多数实际应用中，将5mL至250mL的包含PEG-磷脂分子的溶液离体输注到脉管系统中。在优选的实施方案中，将5mL至100mL并且优选地5mL至50mL的包含PEG-磷脂分子的溶液离体输注到脉管系统中。
在一个实施方案中，溶液包含0.25mg/mL至25mg/mL的PEG-磷脂分子。在优选的实施方案中，溶液包含0.25mg/mL至10mg/mL、优选地0.25mg/mL至5mg/mL，例如2mg/mL的PEG-磷脂分子。
上文所述的PEG-磷脂分子的浓度也可以用于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液。
根据本发明，在脉管系统中离体孵育包含PEG-磷脂分子的溶液，同时保持器官或器官的该部分浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中。另外，器官或器官的该部分也优选地保持在高于0℃但低于8℃、优选地高于0℃但等于或低于6℃并且更优选地高于0℃但等于或低于4℃的温度。
在此实施方案中，在孵育时间期间，当使PEG-磷脂分子与脉管系统中的内皮的细胞膜相互作用并结合时，将器官或器官的该部分浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中。器官或器官的该部分优选地也保持冷的，即在接近但高于0℃的温度下。
根据本发明，将器官或器官的该部分保持浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中。
已经显示，器官保存的理论完美温度为4℃-8℃。较高的温度由于新陈代谢未有效降低而导致器官的缺氧损伤，而温度低于4℃则增加伴随蛋白质变性的冷损伤的风险。
目前，在临床器官移植中供体器官保存的黄金标准使用三个塑料袋和一个冰盒。第一个塑料袋包括浸没在器官保存溶液中的器官本身。将第一个塑料袋放入填充有盐水的第二个塑料袋中，然后将这两个塑料袋放入填充有盐水的第三个塑料袋中，然后将其放入冰盒中。用于将器官保持在温度受控环境中的更先进的器官保存装置是可获得的并且可以使用，例如来自Paragonix Technologies,Inc.的Sherpa PakTM运输系统、来自WatersMedical Systems的Waves、来自Organ Recovery systems的LifePort运输器等。
包含PEG-磷脂分子的溶液可以是盐水、缓冲水溶液或器官保存溶液。
可以使用的缓冲水溶液的例示性但非限制性的实例包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)和柠檬酸盐溶液。
可以用于输注PEG-磷脂分子和/或在离体输注PEG-磷脂分子之前或之后洗涤器官或器官的该部分的脉管系统和/或可以浸没器官或器官的该部分的器官保存溶液可以选自已知的器官保存溶液。此类器官保存溶液的例示性但非限制性的实例包括：组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐(HTK)溶液、柠檬酸盐溶液、威斯康星大学(University of Wisconsin；UW)溶液、Collins溶液、Celsior溶液、京都大学(Kyoto University)溶液和Institut GeorgesLopez-1(IGL-1)溶液。
如本文所呈现的实验数据显示，PEG-磷脂分子易于在器官保存溶液中混合而没有任何沉淀(图20)。
在一个实施方案中，PEG-磷脂分子是由PEG-磷脂组成的未功能化PEG-磷脂分子。因此，在此实施方案中，PEG-磷脂分子不含有任何功能基团。这对应于图1中的R等于CH2或H。
在另一个实施方案中，PEG-磷脂分子是包含连接至PEG-磷脂分子的PEG的相应功能化分子的功能化PEG-磷脂分子。
在又一个实施方案中，溶液包含由PEG-磷脂组成的未功能化PEG-磷脂分子和包含连接至PEG-磷脂分子的PEG的相应功能化分子的功能化PEG-磷脂分子的混合物。
在仅包含功能化PEG-磷脂分子或包含功能化与未功能化PEG-磷脂分子的混合物的实施方案中，功能化分子优选地选自由以下组成的组：补体抑制剂、凝血抑制剂、血小板抑制剂、能够结合补体抑制剂的分子、能够结合凝血抑制剂的分子、能够结合血小板抑制剂的分子及其混合物。
补体抑制剂的例示性但非限制性的实例包括：因子H；C4b结合蛋白(C4BP)；补体受体1(CR1)的N末端4至6个短共有重复序列(SCR)，还称为C3b/C4b受体或分化簇35(CD35)；CD46补体调节蛋白(CD46)，还称为膜辅因子蛋白(MCP)；和补体衰变加速因子(DAF)，还称为CD55。
凝血抑制剂的例示性但非限制性的实例包括肝素。
血小板抑制剂的例示性但非限制性的实例为二磷酸腺苷(ADP)降解酶，如三磷酸腺苷双磷酸酶和外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(NTPDase1)(还称为CD39)。
能够结合补体抑制剂的分子的例示性但非限制性的实例为：因子H结合肽，如[4]中所公开的5C6；和C4BP结合肽，如[5]中所公开的链球菌(Streptococcus)M蛋白衍生肽M2-N、M4-N或M22-N。
能够结合凝血抑制剂的分子的例示性但非限制性的实例为肝素结合肽，如[7]中所公开的。
因此，在一个实施方案中，功能化分子选自由以下组成的组：肝素结合肽、CR1的N末端4至6个SCR、CD46、DAF、因子H结合分子、ADP降解酶及其混合物。
在一个特定的实施方案中，功能化分子选自由以下组成的组：肽5C6、三磷酸腺苷双磷酸酶、CD39、C4BP及其混合物。
在一个实施方案中，PEG-磷脂分子具有式(I)或式(II)：
在一个实施方案中，n、m是在10至16的范围内独立地选择的整数。参数n、m优选地独立地为10、12、14或16，并且更优选地n＝m＝14。
在一个实施方案中，p经过选择，使得PEG链的平均分子量在1000Da至40000Da的范围内选择。参数p优选地经过选择，使得PEG链的平均分子量为3000Da至10000Da，并且更优选地为5000Da。
如本文所定义的平均分子量指示，各个PEG-磷脂分子的分子量可与此平均分子量不同，但平均分子量表示PEG-磷脂分子的分子量平均值。这进一步意味，PEG-磷脂样品在此平均分子量附近将有分子量的自然分布。
在一个实施方案中，端基R为H、CH2、NH2、马来酰亚胺基团、生物素基团、链霉亲和素基团、亲和素基团或功能化分子。就功能化分子而言，其优选地选自由以下组成的组：补体抑制剂、凝血抑制剂、血小板抑制剂、能够结合补体抑制剂的分子、能够结合凝血抑制剂的分子、能够结合血小板抑制剂的分子及其混合物。
PEG-磷脂分子的脂肪酸链可以是饱和的。可替换地，至少一个或两个脂肪酸链可以是不饱和的，即，包含至少一个-CH＝CH-基团、至少一个-C≡C-基团或其组合。每个脂肪酸链可以是直链或支链的。
离体输注到器官或器官的该部分的脉管系统和任选地实质中的PEG-磷脂分子可以是器官或器官的该部分保持浸没于其中的器官保存溶液中所包含的相同类型的PEG-磷脂分子。在另一个实施方案中，与器官或器官的该部分保持浸没于其中的器官保存溶液相比，可以将不同类型的PEG-磷脂分子用于离体输注到器官或器官的该部分的脉管系统和任选地实质中。例如，PEG-磷脂分子的PEG链的大小可以是不同的，其中PEG-磷脂分子的PEG链的大小经过选择以达到器官或器官的该部分的脉管系统和任选地实质中的目标大小。如图19所示，PEG链的大小限制了PEG-磷脂分子可以到达其中的脉管系统和实质的部分。特别地，与较大的40kDa PEG-磷脂分子相比，5kDa PEG-磷脂分子可以到达脉管系统和实质的较大部分。
因此，在一个实施方案中，离体输注到器官或器官的该部分的脉管系统和任选地实质中的溶液中所包含的PEG-磷脂分子的PEG链的平均大小可以与器官或器官的该部分浸没于其中的器官保存溶液中所包含的PEG-磷脂分子不同。
此外或可替换地，离体输注溶液中的PEG-磷脂分子和器官保存溶液中的PEG-磷脂分子可以具有不同的功能基团，即式(I)和(II)中的端基R。
本发明的离体方法可以应用于具有脉管系统并且可以用作器官移植物(即移植到受体中)的任何器官或器官的部分。此类器官的例示性但非限制性的实例包括肾脏、肝脏、胰腺、心脏、肺、子宫、膀胱、胸腺和肠。
在一个特定的实施方案中，器官是肾脏。在此特定的实施方案中，在脉管系统中离体孵育包含PEG-磷脂分子的溶液使能够用PEG-磷脂分子不仅包被肾脉管系统的肾内皮，而且还优选地包被肾实质的肾小管。因此，如本文所呈现的实验数据显示，当通过主动脉残端离体注射包含PEG-磷脂分子的溶液时，PEG-磷脂分子均匀分布在肾脏的管周血管、肾小球和肾小管中。
如本文所呈现的实验数据显示，如通过凝血标志物(如TAT)和补体标志物(如C3a和sC5b-9)的血浆水平所反映，与未处理的对照器官移植物相比，PEG-磷脂处理的器官移植物具有显著更少的血栓炎症。在PEG-磷脂处理的器官移植物中，细胞因子表达(特别是IL-6和IL-1β)也被大大抑制。在PEG-磷脂处理的器官移植物中，器官功能得到改善。PEG-磷脂处理的器官移植物还显示减少的补体标志物(如C3b)和膜攻击复合物的沉积和C5aR的表达。
因此，用PEG-磷脂分子离体包被器官移植物保护免受I/R诱导的血栓炎症，指示其具有对抗临床移植中的I/R损伤的潜力。
本发明的进一步的方面涉及用于治疗、抑制或预防在器官移植物的再灌注之后产生的与再灌注相关联的低血压的PEG-磷脂。
本发明的又一个方面涉及用于治疗、抑制或预防PRS的PEG-磷脂。
器官移植期间和之后即刻(通常最多24小时)的并发症是受体的器官移植物再灌注之后血压显著下降。在严重的情况下，受体的这种血液动力学变化可导致受体器官和移植的移植物的缺血，如果治疗不成功，则对这些实体中的任何一个造成伤害并且甚至导致患者死亡。
所观察到的PEG-磷脂防止脉管不稳定性的保护可能是由于抑制了接触/激肽释放酶系统。出乎意料地发现，再灌注之后，接触/激肽释放酶系统被活化。接触/激肽释放酶系统产生缓激肽，其为高度血管活性肽，诱导血管舒张和通透性增加，导致低血压，从而引起代偿性心动过速。在手术中，用药物和液体治疗血压下降，但仍然可能发生危及生命的情况。因此，预防低血压的可能性具有很大的临床价值。
因此，预防、治疗或至少降低与器官移植物的再灌注相关联的这种低血压和血压下降是与器官移植相关的显著改善。如本文所呈现的实验数据显示，在移植之前用包含PEG-磷脂分子的溶液离体处理器官移植物保护了受体免受器官移植物再灌注时这种低血压或血压下降。
在一个实施方案中，PEG-磷脂被配制为包含PEG-磷脂分子的溶液，并且旨在用于离体输注到器官移植物的脉管系统中，以实现用PEG-磷脂分子包被脉管系统的内皮内膜以及实质。
本发明的一个相关方面定义了PEG-磷脂用于制造用于治疗、抑制或预防在器官移植物的再灌注之后产生的与再灌注相关联的低血压的药物的用途。一个方面还涉及一种用于治疗、抑制或预防在器官移植物的再灌注之后产生的与再灌注相关联的低血压的方法。此方法包括先前描述的方法步骤：将包含PEG-磷脂分子的溶液离体输注到器官移植物的脉管系统中，并在脉管系统中离体孵育包含PEG-磷脂分子的溶液，以实现用PEG-磷脂分子包被脉管系统的内皮内膜的至少一部分，任选地但优选地，同时保持器官移植物浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中。
实验
实验1
材料、方法和动物实验
PEG-磷脂衍生物的合成
a.FITC-PEG-磷脂
PEG-磷脂的合成通过先前所述的方法进行[1]。简而言之，将1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(NOF Corporation，Tokyo，Japan，DPPE，21mg)溶解于3mL二氯甲烷(Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis，MO，USA))中。并且将α-N-羟基琥珀酰亚胺基-ω-叔丁氧羰基聚(乙二醇)(来自NOF的NHS-PEG-Boc，Mw：5000，185mg)和三乙胺(3μL，Nacalai Tesque(Kyoto，Japan))添加至反应溶液中，然后在室温(RT，约20℃)下搅拌4天。NHS-PEG-Boc的NHS基团容易与磷脂的氨基反应。在添加2mL 99％三氟乙酸(Wako PureChemical(Osaka，Japan))并在4℃下再孵育30min之后，去除保护基Boc(氨基)。通过在乙醚(Nacalai Tesque)中再沉淀来纯化粗产物。在用氯仿(Nacalai Tesque)萃取并蒸发之后，得到呈白色固体的PEG-磷脂。产率是85％。为了用异硫氰酸荧光素(FITC)(DojindoLaboratories(Kumamoto，Japan))进行荧光标记，使PEG-磷脂(200mg)与在丙酮中的FITC(31mg)反应12h。通过凝胶渗透色谱法(Sephadex G-25，GE Healthcare(Buckinghamshire，UK))纯化FITC-PEG-磷脂。
根据以下合成FITC-PEG-磷脂(40kDa)。将α-N-羟基琥珀酰亚胺基-ω-马来酰亚胺基聚(乙二醇)(NHS-PEG(40k)-Mal，Mw：40,000)和DPPE(9.6mg)溶解于3mL二氯甲烷中，并且将三乙胺(3μL，Nacalai Tesque)添加至反应溶液中，然后在室温(RT，约20℃)下搅拌4天。通过在乙醚中再沉淀来纯化粗产物。在用氯仿萃取并蒸发之后，获得呈白色固体的Mal-PEG-磷脂(40kDa)。产率是80％。为了用异硫氰酸荧光素(FITC)进行荧光标记，将Mal-PEG-磷脂(40kDa)(1200mg)溶解于DMSO(Nacalai Tesque，20mL)中，然后添加FITC-甘氨酸-半胱氨酸(FITC-GC，BEX Co.Ltd，Tokyo，Japan，12mg)并在37℃下孵育24小时。通过在乙醚中再沉淀来纯化粗产物。在用氯仿萃取并蒸发之后，获得呈黄色固体的FITC-PEG-磷脂(40kDa)。
b.生物素-PEG-磷脂
通过以下合成生物素-PEG-磷脂：将聚(乙二醇)(N-羟基琥珀酰亚胺5-戊酸酯)醚2-(生物素基氨基)乙烷(生物素-PEG-NHS，Mw：5000，NOF，180mg)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DPPE)(20mg)与三乙胺(50μL)和二氯甲烷(4mL)组合并在室温下搅拌48h。用乙醚沉淀得到呈白色粉末的生物素-PEG-磷脂(165mg；80％产率)。生物素-PEG-磷脂无需进一步纯化即用于观察。
c.PEG-磷脂
通过以下合成PEG-磷脂：将α-琥珀酰亚胺基氧基琥珀酰基-ω-甲氧基聚乙二醇(来自NOF的MeO-PEG-NHS，Mw：5000，171mg)和DPPE(22mg)与三乙胺(25μL)和二氯甲烷(5mL)组合并在室温下搅拌72h。用乙醚沉淀得到呈白色粉末的PEG-磷脂(160mg；80％产率)。PEG-磷脂无需进一步纯化即用于肾脏处理。
各种类型的PEG-磷脂的功能评估
为了评估功能部分是否对其保护特性有影响，对原代人间充质干细胞(hMSC)进行了一系列实验。用PEG-磷脂、FITC-PEG-磷脂和生物素-PEG-磷脂包被hMSC。在表面改性之后，根据制造商的说明书，通过阿尔玛蓝(Allmar blue)测定(Life technologies，Stockholm；Sweden)对包被的细胞的活力进行分析。简而言之，将包被的细胞在96孔细胞培养微板中培养于MSC培养基中。在培养6小时之后，将10μL阿尔玛蓝试剂添加到100μL培养基中，然后在37℃下孵育4小时。随后，在580nm-610nm处测量荧光发射。
为了确定hMSC的血液相容性，将表面修饰的MSC如先前所述[7]在环模型中暴露于全血。概括地说，从健康志愿者抽取全血于肝素涂覆管(Corline AB，Uppsala；Sweden)中。使用肝素化PVC管(30cm)。每个管中填充3mL血液，向其中添加10,000MSC/mL。在37℃将管以30rpm的速度旋转60min。孵育之后，在2mL含有EDTA的管(Eppendorf，Germany)中收集1.2mL血液，EDTA的最终浓度为10mM。随后，在4℃下将血液以4200×g离心15min以获得血浆。将血浆分成等分试样并储存在-80℃下直至进一步分析。
具有不同长度的PEG亚基的PEG-磷脂的保留
将细胞(CCRF-CEM，漂浮细胞系；n＝3)与FITC-PEG-磷脂(在PBS中2mg/mL)一起在室温下孵育30min，然后用培养基洗涤。在此，使用具有不同分子量的PEG链的FITC-PEG-磷脂，分子量为1kDa、5kDa和40kDa。将处理的细胞在37℃下于培养基中培养，并在0h、1h、3h、6h、24h和48h进行收集以用于流式细胞术分析。
猪同种异体移植模型
由于猪的解剖结构和生理与人类高度相似，所以选择猪为大型动物模型。具体而言，肾脏的结构和功能与灵长类动物器官非常类似。在所有关于猪的研究中，均使用了具有高健康标准的常规品种。在长期存活实验中，使动物适应两周时间，并进行训练和社会化程序。经常进行包括尿路超声检查、血液学检查和临床病理检查在内的临床检查，并且在移植之前进行SLA分型以使供体和受体不匹配。受体猪在手术之后恢复很快，但未用免疫抑制药物进行治疗。此类药物的施用干扰免疫反应并且不包括在实验中。因此，在96小时之后对猪实施安乐死，以避免移植急性排斥。安乐死之后进行充分的尸检。所有研究均得到瑞典乌普萨拉动物实验伦理委员会(ethics Committee for Animal Experimentation，Uppsala，Sweden)的批准。
A.短期模型(仅用PEG-磷脂灌注肾脏40min)
缺血再灌注损伤(I/R损伤)是多种病状的病理的主要诱因，病状包括移植、血栓性病症、脓毒症和心肺转流。本实验测试了，在整块同种异体肾脏移植模型中，用PEG-磷脂离体包被猪肾脏移植物的缺血细胞表面是否防止I/R损伤。
动物。研究是在瑞典乌普萨拉大学医院的Hedenstierna实验设施(Hedenstiernaexperimental facility，Uppsala University Hospital，Sweden)处进行的。包括了两种性别的六只供体猪和六只受体猪。猪的体重和年龄分别在30kg-35kg和10周-12周之间变化。应用非存活程序并在移植后的8小时观察期之后处死动物。
麻醉。到达实验室后，肌内注射2.2mg/kg甲苯噻嗪(Rompun；Bayer，Leverkusen，Germany)与6mg/kg唑拉西泮(Zoletil；Virbac，Carros，France)的组合以实现镇静。随后，以俯卧位固定动物。将外周静脉导管引入双耳静脉中以用于诱导并维持麻醉以及输液。在气管上切开小口，以暴露气管，并进行经气管插管，以实现机械通气Servo-IMechanicalVentilator,MAQUET,Medical Systems,US。在空气中用30％氧气对动物通气，以获得5.0-5.5kPa CO2。动脉压平均值(MAP)＞60mmHg旨在确保足够的器官灌注。
移植模型。我们开发了猪移植模型，其实现双重整块取回供体的两个肾脏并植入到受体动物中。通过对整块包(en-bloc package)内仅一个随机选择的肾脏进行分离的离体PEG-磷脂孵育，此技术允许我们在一头受体猪中共同移植处理的器官以及与其完美匹配的对照组织，这不仅减少了实验动物的数目，还使实验混杂变量最少。
调动肾上和肾下主动脉干以及下腔静脉，因此得到了整块包，其由两个肾脏、输尿管和完整的肾脉管系统组成。立即将整块包移出，并用HTK(Custodiol；
ChemieGmbH,Germany)溶液冷冲洗。之后，将整块包在4℃的HTK溶液中冷藏24小时。
保存后，随机选择每个整块包中的一个肾脏以用于PEG-磷脂孵育。将对侧肾脏(对照)的静脉和动脉以及所选肾脏的静脉夹紧。将总计10mL-15mL浓度为2mg/mL的PEG-磷脂溶液缓慢输注到所选肾脏中。然后将处理的肾脏的动脉夹紧，并且将整块包在HTK中于4℃下再冷藏40min。孵育后和植入前，用HTK将多余的PEG-磷脂从处理的肾脏中冲走，而无需从对照去除夹钳。
如先前所述，对受体猪进行处理和麻醉。将整块包水平腹部内放置。将移植体的腔静脉和主动脉的远侧端部分别与受体的静脉和主动脉端侧吻合。解除夹紧时，通过间隔数秒来延迟对照肾脏的解除夹紧，来依次对处理的肾脏和对照肾脏进行再灌注，同时冲洗掉来自处理的肾脏的流出物。这样做是为了防止主动脉导管内剩余的PEG-磷脂溶液污染对照肾脏。将两个移植输尿管分别插入导管以记录尿输出。
B.长期模型(仅用PEG-磷脂灌注肾脏40min)
动物。基于SLA分型的结果，选择供体(n＝12)和受体(n＝21)的杂种猪进行不匹配移植。将这些动物圈养在测量为3m2的单独围栏中，彼此可以看到和听到。将稻草和木屑用作垫草。应用14:10h的明/暗时间表(在06:00点亮灯)，并在每个围栏中提供一个红外灯(24h)。温度为16℃-18℃。每天两次向动物饲喂无生长促进剂的商业肥育饲料(SOLO 330，
Sweden)，饲料量取决于BW和根据瑞典农业大学(Swedish University ofAgricultural Sciences)的养猪方案。任意提供水。用剂量为0.1mg/kg BW的美托咪定(
vet，1mg/mL；Orion Pharma Animal Health，Sollentuna，Sweden)、剂量为0.2mg/kg BW的布托啡诺(Butomidor vet，10mg/mL；Salfarm Scandinavia，Helsingborg，Sweden)和剂量为5mg/kg BW的氯胺酮(
vet，100mg/mL；IntervetInternational BV，Boxmeer，Netherlands)的组合(肌内(i.m.))对供体猪进行麻醉，并且使用线型(10MHz)和曲线型(4MHz)探针超声检查(Logiq e R6，GE Healthcare，Wauwatosa，U.S.A.)肾脏，以排除有肾囊肿的猪。评估肾脏长度、回声反射性和皮髓质定义，评估肾盂区域的肾盂扩张的证据，并且使用彩色多普勒评估肾脏中血流的存在。在两周适应期中，每天对猪进行处理，并训练以在移植后不受约束地进行不同的检查。
移植模型。用剂量为0.05mg/kg BW的美托咪定(
vet，1mg/mL；OrionPharma Animal Health，Sollentuna，Sweden)和剂量为5mg/kg BW的替来他明与唑拉西泮(
50mg+50mg/mL；Virbac，Reading，Carros，France)的组合(肌内)诱导麻醉。手术前给予剂量为0.01mg/kg BW的丁丙诺啡(
vet，0.3mg/mL；Orion PharmaAnimal Health，Sollentuna，Sweden)(肌内)和剂量为0.1mg/kg的硬膜外吗啡(MorfinEpidural Meda，2mg/ml；Meda，Solna，Sweden)以再次镇痛。手术前给予剂量为20mg/kg BW的普鲁卡因苄青霉素(
vet，300mg/mL；Boehringer Ingelheim Vetmedica，Ingelheim am Rhein，Germany)(肌内)。麻醉诱导之后，通过Seldinger技术将长期使用的静脉导管(CareflowTM，3Fr，200mm，BD，Franklin Lakes，NJ，USA)插入耳静脉中。手术后，导管有利于无应力血液取样。每天用100IE/mL肝素化盐水(Heparin LEO，5000IE/mL；LeoPharma，Ballerup，Denmark)冲洗导管一次。用在氧气中蒸发的异氟烷(
vet；OrionPharma Animal Health，Sollentuna，Sweden)维持麻醉。猪连续接受拟晶体(Ringer-acetat；Fresenius-Kabi，Bad Homburg，Germany)疗法。必要时给予胶体(
40mg/mL；Braun，Melsungen，Germany)和多巴酚丁胺(Dobutamin Carino，250mg/mL；Carinopharm，Elze，Germany)，以将血压维持在参考值内。在麻醉期间，监测呼吸和心血管参数。
供体程序。在第一系列的实验(3+3个供体和6+5个受体)中，获得了两个肾脏，用HTK灌注(n＝11)进行类似的处理，在冰上保持过夜，然后将其中一个肾脏在插入前随机地用PEG-磷脂处理60min，而另一个肾脏未处理。在另外十个肾脏(5个供体和10个受体)中交替施用PEG-磷脂，这些肾脏用含有PEG-磷脂的HTK灌注溶液或常规HTK灌注溶液进行处理。在该程序之后，在全身麻醉下通过静脉注射戊巴比妥钠(Allfatal vet，100mg/mL；OmnideaAB，Stockholm，Sweden)对供体猪实施安乐死。
移植手术。受体猪经历同种异体单肾移植。所有程序均通过15cm-20cm的中线切口在腹腔内进行，并且识别并轻轻调动右髂窝的髂血管。调动腔静脉的远侧段以及髂动脉(从其从主动脉中出现)，密封周围的淋巴样组织。此后将肾移植物放置在右骼窝中靠近骼血管。修剪肾脏静脉和动脉，随后使用聚丙烯7/0连续缝合线(
Ethicon，U.S.)以端侧方式与受体的右髂动脉和远端腔静脉吻合。通过膀胱外输尿管膀胱吻合术将输尿管通过6-0聚二氧六环酮缝合线(
Ethicon，US)植入到膀胱顶部。此后，进行了天然肾脏的双侧切除术。通过连续缝线2/0polyglactin(
Ethicon，US)筋膜缝合线和皮肤夹来将中线切口闭合。手术的平均时间为3h(2.5h-5.5h)。
在手术快要结束时，中断异氟烷施用，增加吸入氧气的分数(FiO2 1.0)，并且将猪与机械通气器断开，并恢复自主呼吸。将猪放在强化护理笼中，在所述笼中工作人员可以很容易地对其进行连续监测。提供氧气补充，并监测心率、呼吸率、氧饱和和体温，直到猪清醒。在第一天期间，向猪人工喂养水果，并在需要时帮助其喝水。它们还受帮助以站立和行走并且接受若干次臀中肌、股二头肌和臀大肌的按摩。对于手术后镇痛，在两天内静脉施用丁丙诺啡。
安乐死和尸检。96h之后，用过量的戊巴比妥钠(Allfatal vet，100mg/mL；OmnideaAB，Stockholm，Sweden)对受体实施安乐死。死后立即收集肾脏活检以用于组织学检查，并且所有猪在SLU病理学系生物医学科学和兽医公共健康部(Department of BiomedicalSciences and Veterinary Public Health,Division of Pathology,SLU)进行死后检查。
HTK溶液的预处理。在另一组实验中，四头猪移植PEG-磷脂处理的肾脏，并且五头猪移植对照肾脏。在这组实验中，获取后，用具有2mg/mL PEG-磷脂(处理的肾脏)或不具有PEG-磷脂(对照肾脏)的HTK(Custodiol；
Chemie GmbH，Germany)溶液灌注肾脏。还将肾脏在4℃下储存浸没于具有2mg/mL PEG-磷脂的HTK溶液(处理的肾脏)或不具有任何PEG-磷脂的HTK溶液(对照肾脏)中24小时。
C.用于评估PEG-磷脂从肾脏内皮脱离的长期模型
如上文所述，在两周的适应和训练之后，从供体猪获得肾脏并且移植到受体猪中。使用与在插入之前接受60min PEG-磷脂的移植体相同的程序处理肾脏。为了测量与内皮的脱离，对PEG-磷脂进行了荧光标记。使用相同的麻醉剂和手术方案，但将天然肾脏留在受体中(n＝4)。分别在12小时、24小时、48小时和72小时之后对猪实施安乐死。对所有猪进行尸检并收集活检，以进行组织学检查和荧光监测。
血液取样
在短期模型中，在开始再灌注之后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、240分钟和360分钟，从左和右肾脏移植体静脉获得血液样本。在长期模型中，在1小时、24小时、48小时、72小时和96小时之后获得血液。将样品吸入EDTA Vacutainer管(Becton DickinsonAB，Sweden)中，并立即在室温下离心15分钟。将收集的血浆储存在-80℃以用于进一步分析。
TAT、C3a和sC5b-9EIA
如先前所述[7]，通过夹心EIA测量血浆中的TAT、C3a和sC5b-9。简单地说，对于TAT的评估，将血浆样本1/100稀释于正常柠檬酸磷酸右旋糖(CPD)血浆中。使用抗人凝血酶单克隆抗体以进行捕获，并且使用HRP偶联的抗人抗凝血酶抗体(AT)以进行检测(EnzymeResearch Laboratories，South Bend，IN，USA)。通过将合并的人血清稀释于正常CPD血浆中来制备标准品。值用μg/L表示。对于C3a的评估，将血浆1/1000稀释于工作缓冲液(含有0.05％Tween 20、10mg/mL BSA和10mM EDTA的PBS)中。使用抗人C3a mAb 4SD17.1来捕获C3a，并且使用生物素化的多克隆兔抗C3a抗体，接着使用HRP缀合的链霉亲和素来检测血浆C3a。酵母多糖活化血清(针对纯化的C3a进行校准)充当标准品。值用ng/mL表示。将sC5b-9血浆1/50稀释于工作缓冲液中(如上)。通过抗人C5b-9mAb(a9e)来捕获sC5b-9，并且通过抗人C5多克隆兔抗体(Dako)和HRP缀合的抗兔IgG(Dako)进行检测。将含有6x104 AU/mL的酵母多糖活化血清用作标准品。值用AU/mL表示。
组织学分析
再灌注之后5分钟、60分钟和360分钟，从对照和生物素-PEG-磷脂处理的肾脏取得肾组织活检。为了检测PEG-磷脂，将活检立即在液氮中冷冻并储存在-80℃直至进一步分析。将用生物素-PEG-磷脂处理的肾脏的冷冻切片(4μm厚度)在室温下于Alexa488-链霉亲和素(GE Healthcare，1:500)中孵育10min。通过激光扫描共焦显微镜(LSM510，META，CarlZeiss，Germany)分析切片。评估了生物素-PEG-磷脂和FITC-PEG-磷脂(5kDa、40kDa)两者。
还将组织样本在4％多聚甲醛溶液中固定过夜，并储存在70％乙醇中，直到包埋在石蜡中。将石蜡切片(5μm厚度)在二甲苯中脱蜡，并用乙醇再水化。通过在柠檬酸钠缓冲液中将切片煮沸两次来进行热诱导的抗原修复。用山羊血清封闭，然后进行一抗孵育。将切下的切片用苏木精和伊红染色(HE染色)，并且用补体标志物如C5aR(Acris Antibodies，Herford，Germany)、C3b(Bioss Antibodies，Woburn，MA，USA)、C4d(Abcam，Cambridge，UK)和C5b-9(MAC；Abcam)标记抗体。作为对照实验，使用了IgG兔(Dako，Glostrup，Denmark)和IgG小鼠(Abcam)。用Dako real检测系统碱性磷酸酶红(Dako)进行一抗检测，然后用苏木精对比染色。使用Zeiss Axio Imager A1显微镜观察载玻片。镜头是10X物镜，并且评估的视野为800,000μm2。使用Axio Visio(rel.4.8)软件(Zeiss，Jena，Germany)对正方形区域的免疫反应区域的强度和面积进行定量。结果呈现为红色光密度总和平均值。样本双盲的病理学家进行了组织学分析，以检测肾小管扩张和坏死、肾小球损伤和空泡形成。
统计学分析
结果呈现为平均值±SEM。使用Macintosh软件的Prism版本6(Graphpad，SanDiego，CA，USA)进行数据作图和统计学分析。使用Wilcoxon配对检验统计学评估两个组的平均值之间的差异，而通过重复测量两因素ANOVA，然后通过事后Bonferoni评估来分析多于两个组之间的统计学显著性。当p＜0.05时，认为组之间的比较是显著的，而更高的值被认为是不显著的(ns)。
结果
各种PEG-磷脂制剂的功能特性比较
用各种类型的PEG-磷脂制剂处理hMSC。仅用PEG-磷脂(97.3％)、FITC标记的PEG-磷脂(98.3％)以及用生物素标记的PEG-磷脂(97％)进行表面改性之后，hMSC的活力没有改变，指示PEG-磷脂不影响活力。
使用CCRF-CEM漂浮细胞测试了具有不同长度的PEG亚基的PEG-磷脂的保留。用与FITC缀合的具有1kDa、5kDa和40kDa PEG亚基的PEG-磷脂包被细胞。将细胞在37℃下孵育，并通过流式细胞术监测结合。结果显示，所有制剂的结合在24h后都损失90％，但5kDa的制剂却保留了最长时间(图13)。
当暴露于全血时，与未包被的细胞相比，PEG-磷脂包被的细胞的TAT水平显著降低。与没有PEG-磷脂(110±7.6)包被的对照相比，仅用PEG-磷脂(61.5±2.9相对于110±7.6)、用FITC标记的PEG-磷脂(60.1±2.7)或用生物素标记的PEG-磷脂(61.4±5.1)包被的细胞的TAT生成的这种减少是类似的(图2A)。
当包被和未包被的细胞暴露于全血时，观察到补体活化标志物的类似趋势。血液暴露之后60min时，与未包被的细胞(104±7.7，104±6.2)相比，当用PEG-磷脂(50.8±3.2，37.7±1.5)、FITC标记的PEG-磷脂(51.3±3.8,35.0±2.1)和生物素标记的PEG-磷脂(49.8±4.1，38.3±2.0)包被细胞时，C3a和sC5b-9的血浆水平显著降低(图2A和图2B)。
PEG-磷脂处理的猪肾脏中FITC标记的磷脂的分布
如材料和方法中所述，将同种异体肾脏整块移植到受体(n＝6)。在5min、60min和360min时在活检中分析了在受体中再灌注之后肾脏组织中PEG-磷脂的分布。如图4所示，来自FITC标记的PEG-磷脂的再灌注之前的荧光均匀分布在整个肾脏的管周血管、肾小球和肾小管中，反映了经由将PEG-磷脂溶液通过主动脉残端注射，用PEG-磷脂相等地改性了肾脏组织。相比之下，对照肾脏组织中没有荧光，指示在测试肾脏与对照肾脏之间没有显著的渗漏。
比较5、60和360min时的肾脏组织，在FITC标记的PEG-磷脂处理的肾脏组织中，尤其是肾小球以及管周血管和肾小管的荧光随时间逐渐降低，指示PEG-磷脂从细胞上脱落，但是在360min时仍有一些PEG-磷脂结合到肾小管。
在评估脱落的长期研究中(C.评估PEG-磷脂从肾脏内皮脱落的长期模型)，在24h后仅可见少量荧光，并且在48h后未观察到荧光，表明所有PEG-磷脂脱落。离体FITC标记的PEG-磷脂也附接到心血管内皮。
A.短期同种异体移植模型
移植肾脏的免疫组织化学分析
通过免疫组织化学分析移植肾脏的白蛋白渗漏、补体沉积和受体表达(C3a、sC5b-9、C4d、C3b；图5A至图5D)。组织学评估显示，与对照肾脏相比，PEG-磷脂处理的肾脏移植物中补体活化标志物(如C3b/iC3b和C5b-9)的沉积水平和补体受体C5aR的表达水平较低。在灌注后5min时，PEG-磷脂处理的肾脏中的C3b/iC3b沉积显著减少。对于白蛋白或氧化应激标志物HO-1、iNOS和硝基酪氨酸，与对照肾脏相比，PEG-磷脂处理的肾脏中有这些标志物更低的趋势(ns)。因此，组织学排序的结果支持了，通过PEG-磷脂对肾脏移植物进行表面处理防止补体活化，并且有抑制氧化应激的趋势。
凝血和补体活化
为了评估在短期猪整块同种异体移植模型中，PEG-磷脂处理对肾脏再灌注之后血管先天免疫系统的影响，分析了血液中的凝血活化(TAT，图6A)和补体活化标志物(C3a、sC5b-9，图5A和图5B)。与对照受体相比，具有PEG-磷脂处理的肾脏的受体的血液中的TAT水平更低。再灌注之后5min(46.1±5.2相对于73±12.3，p：0.01)、15min(48±8.4相对于73±9，p：0.02)、30min(41±9.1相对于57±4.9，ns)、60min(32±4.8相对于58±3.7，p：0.02)和120min(28.6±5.1相对于53±4，p：0.02)时观察到PEG-磷脂处理的肾脏相对于未包被的对照中的TAT水平的显著降低，但在240min(32±4相对于49±6.1，ns)和360min(29±9相对于41±14，ns)之后未观察到该结果。这些结果指示，肾脏移植后，表面改性显著抑制了凝血活化。
对于补体标志物(C3a和sC5b-9)观察到了类似的结果。再灌注之后5min(40±2.8相对于63.6±5.4，p：0.03)、15min(39±4相对于61±7.2，p：0.04)、60min(41±5.2相对于68±5.1，p：0.01)、120min(44±6.1相对于67±3.1，p：0.03)、240min(45±12相对于93±3，p＜0.0001)和360min(45±12相对于80±16，p＜0.001)之后，移植了用PEG-磷脂处理的肾脏的受体相比于对照受体的血液中C3a水平显著降低，但在30min(39±5.8相对于54±5.9，ns)没有这种情况。此外，还观察到，与对照受体相比，sC5b-9水平显著降低。与对照相比，在所有时间点(5min后除外)，处理的肾脏的样本中sC5b-9的生成减少。处理的肾脏和对照肾脏的再灌注之后的sC5b-9血浆水平为：5min时(16±6相对于31±5，p：0.2)、15min之后(15±3相对于45±11，p：0.01)、30min之后(16±4相对于45±3，p：0.01)、60min之后(25±7相对于54±4，p：0.01)、120min之后(36±12相对于64±9，p：0.01)、240min之后(45±11相对于75±11，p：0.01)以及360min之后(44±14相对于79±11，p＝0.008)。因此，这些结果显示，通过用PEG-磷脂包被内皮显著抑制了补体活化。
肾脏功能
通过评估在有和没有PEG-磷脂处理的肾脏移植后的利尿来分析肾脏功能(图10A)。再灌注之后360min时，与对照受体相比，具有PEG-磷脂处理的肾脏的受体的总尿液产量显著增加(48.3±22.2mL相对于33.5±18.2mL，p＜0.05)。然而，由于未去除受体的肾脏，所以两组之间在利尿时间或血清肌酸酐水平方面无显著差异。
B.长期同种异体移植模型
凝血和补体活化
为了评估在长期猪同种异体移植模型中，PEG-磷脂处理对肾脏再灌注之后血管先天免疫系统的影响，分析了血液中的补体活化标志物(C3a、sC5b-9，图8A和图8B)和凝血活化(TAT，图8C)。与对照受体相比，具有PEG-磷脂处理的肾脏的受体的血液中的TAT水平更低。再灌注之后24小时(372±123相对于137±21，p＜0.05)、48小时(365±82相对于152±17，p＜0.05)、72小时(467±96相对于135±18，p＜0.001)和96小时(428.6±111相对于168±23，p＜0.01)观察到PEG-磷脂处理的肾脏相对于未包被的对照的TAT水平的显著降低，但在1小时(378±82相对于176±24，ns)之后未观察到该结果。这些结果指示，肾脏移植后，表面改性显著抑制了凝血活化。
对于补体标志物(C3a和sC5b-9)观察到了类似的结果。再灌注之后48小时(119±40相对于67±9，p＜0.001)、72小时(95±13相对于63±10，p＜0.01)之后，移植PEG-磷脂处理的肾脏的受体相比于对照受体的血液中C3a水平显著降低，但在1小时(68±11相对于54±4，ns)、24小时(128±54相对于63±18，ns)或96小时(103±21相对于74±8，ns)之后没有这种情况。此外，还观察到，与对照受体相比，sC5b-9水平显著降低。与对照相比，在所有时间点(5min后除外)，处理的肾脏的样本中sC5b-9的生成减少。处理的肾脏和对照肾脏的再灌注之后5min时的sC5b-9血浆水平为24小时(73±29相对于33±16，p＜0.05)、48小时(94±33相对于33±11，p＜0.001)、72小时(126±46相对于41±18，p＜0.0001)和96小时(108±23相对于51±11，p＜0.01)，但在1小时(63±11相对于33±16，ns)之后没有这种情况。因此，这些结果显示，通过用PEG-磷脂包被内皮显著抑制了补体活化。
促炎性细胞因子
评估了长期同种异体肾移植中细胞因子/趋化因子的浓度。使用多重测定，评估了INFγ、IL-1β、IL-2、IL-1α、IL-1R、IL-4、IL-6、IL-10、IL-18、IL-8、IL-12和TNF的血浆浓度，参见图9A至图9L。4天之后，移植PEG-脂质处理的肾脏的动物的IL-1β、IL-1R、IL-4、IL-6、IL-12、IL-18和TNF水平显著较低。
肾脏功能
移植后所有动物恢复良好，并在24h内开始进食。通过超声检查确认尿液产生，并且所有猪在72h内在膀胱中发现尿液。通过评估在有和没有PEG-磷脂处理的肾脏移植后的肌酸水平来分析肾脏功能(图10B)。在整整四天时间内，具有PEG-磷脂处理的肾脏的受体相比于对照受体的水平显著较低。
尸检
除了与肾脏移植有关的变化外，没有观察到疾病迹象。死后检查是在乌普萨拉SLU病理学组(Section of Pathology，SLU，Uppsala)进行的。
灌注后综合征
在我们对猪的长期存活研究中，显示了移植PEG-磷脂处理的肾脏的动物在再灌注之后心率和动脉血压的变化很小或没有变化。因此，PEG-磷脂产物还阻止了接触系统的活化，并最终阻止了PRS的活化，参见图11。
HTK溶液的预处理
图16A和图16B显示了评估在4℃下猪肾脏在补充PEG-磷脂的HTK溶液中孵育24小时的结果。TAT值呈现于图16A中，并且血浆肌酸酐值呈现于图16B中。与用仅HTK溶液且没有PEG-磷脂处理的对照相比，将猪肾脏保持在补充有PEG-磷脂的HTK溶液中有显著改善。即使没有任何额外的免疫抑制作用，也获得了在处理的猪肾脏中发现的低血浆肌酸酐水平。
器官储存
当将PEG-脂质溶解于灌注液中并在+4℃下长期储存移植物时，再灌注时，在PEG-脂质处理的肾脏中有显著较低的级联系统活化(图17A至图17D)和细胞因子表达水平(图18A至图18G)。
FITC-PEG-磷脂的组织学分析
图19示出了用FITC-PEG-磷脂(5kDa)和FITC-PEG-磷脂(40kDa)处理的肾脏以及对照的活检的共焦显微镜图像。这些图像从而显示了将PEG-脂质离体输注到四头不同的猪的肾脏中之后5kDa PEG-脂质和40kDa PEG-脂质的摄取，其中一个肾脏用于5kDa PEG-脂质并且另一个用于40kDa PEG-脂质。如图19所示，与40kDa PEG-脂质相比，5kDa PEG-脂质更有效地渗入肾实质。因此，与5kDa PEG-脂质分子相比，通过肾单位的肾小球过滤40kDa PEG-脂质分子的效率较低。
讨论
在许多疾病和病理状况中，缺血诱导病理变化。从原理上看，四种类型的机制诱导组织的缺血，即血栓形成、移植、导向器官的动脉夹紧和脓毒症。IRI是器官移植期间不可避免的事件，但它也在各种各样的其他临床相关情况(例如脑死亡、脓毒症、心脏手术)以及在缺血性区域的再灌注后在危险的心肌梗塞或中风中发生。在本实验中，我们证明了在短期和长期猪同种异体移植模型中，在移植前用PEG-磷脂构建体包被内皮内膜和肾小管系统，在功能上替代了GXC，并大大减弱了体内初始I/R损伤反应。
从在供体中到实际的移植事件的时间段，移植的肾脏在各个阶段都暴露于缺血性损伤。由于尸体供体作为器官捐献的主要贡献者，所以尸体供体中循环的血流动力学不稳定是缺血的主要原因之一。在从尸体供体获取器官期间出现热缺血，并且在低温下器官保存期间发生冷缺血性损伤。受体中器官的再灌注最终导致I/R损伤。
为了克服这些问题，我们提出了一种在肾脏移植中免受先天性免疫攻击的局部保护的新方法。通过与细胞脂质双层膜的疏水相互作用，用PEG-磷脂包被肾脏内皮和肾小管，从而代替GXC层。PEG链是惰性的并且提供高生物相容性。因此，PEG-磷脂本身通过遮蔽内皮和肾小管细胞膜并通过阻碍蛋白质到达肾脏内皮细胞表面上并被活化来防止I/R损伤。
如在肾脏移植物的内皮表面上减弱的TAT、FXIIa、TF、C3a和sC5b-9血浆水平和C3b沉积所反映，受体中的PEG-磷脂处理的肾脏显示较小的免疫活化。这显示，从脂质双层膜伸出的PEG链可以在再灌注来自受体的新鲜血液之后抑制补体活化并且保护细胞膜免于补体组分的沉积。这也导致了凝血活化的抑制。补体和凝血活化是I/R的标志，并且补体标志物水平的降低证实了对导致排斥的I/R损伤的掩蔽效应的概念。
在短期研究中，对移植体进行长达6小时的随访以评估肾脏功能和局部血液相容性。当经由两个肾脏移植物的共同主动脉区段注射PEG-磷脂悬浮液时，整个测试肾脏的组织同等地包被了PEG-磷脂，包括肾小球(图4B、图4D、图4F)。肾脏移植物的大体形态没有改变，指示用PEG-磷脂处理肾脏移植物对细胞活力没有不利影响。而且，当比较对照肾脏与PEG-磷脂处理的肾脏的总尿液产量时，在测试肾脏中观察到利尿的显著改善。这些结果指示，不仅保护了肾内皮免于先天免疫攻击，而且尽管肾小球包被有PEG-磷脂，肾脏功能也得到了很好的保留。鉴于缺血性伤害后的形态变化与肾脏功能之间的已建立的联系作为离体区分有活力和无活力肾脏的工具，我们的短期观察研究证明了PEG-磷脂包被层减轻I/R攻击的功效，而对肾脏功能无任何不良影响。
PEG-磷脂的效应限于细胞表面，因为结合是通过疏水相互作用来介导的。根据在短期和长期模型中对结合在肾脏中的PEG-磷脂的荧光的监测，显示了在观察期间强度降低，指示PEG-磷脂脱离了内皮。荧光似乎从肾小球迁移到肾小管系统，最终在移植后6小时到达肾小管细胞的底部。在观察期间在尿液中发现了荧光，支持了PEG-磷脂分子被肾脏代谢。在长期研究中，在再灌注后长达12-24小时检测到显著的荧光，并在48小时后完全消失。可能是最初存在PEG-磷脂的过饱和，其容易被洗掉并且内皮细胞的实际保护是通过仅产生微弱荧光的分子来实现的。这由以下证实，在短期研究中移植后6小时之后PEG-磷脂荧光相对较低，以及对先天免疫攻击的保护效应(如通过血液中的TAT、C3a和sC5b-9水平以及肾脏移植物中的C3b沉积的显著差异所指示)。这也得到了以下支持，即，尽管观察到插入内皮表面中的PEG-磷脂密度较低，但在长达72小时的长期研究中仍保持功效。因此，PEG-磷脂的长期稳定性是足够的。
这项短期研究提供了以下概念验证，即，单独PEG-磷脂包被层通过直接抑制血栓炎症来减弱I/R损伤事件的功效。PEG-磷脂被开发为充当结合至细胞的先天免疫的调节因子的连接物和间隔物。功能化的PEG-磷脂分子在减弱各种先天免疫和血栓性反应(例如补体活化、接触系统活化和血小板活化)方面非常有效。例如，对因子H具有亲和力的肽抑制补体活化，并且三磷酸腺苷双磷酸酶能够减少与血小板活化相关联的血栓性反应。当猪主动脉内皮细胞在全血体外系统中与人血接触时，这两种调节因子的组合可以完全抑制异种系统中触发的血栓炎症。考虑到PEG-磷脂本身的巨大效应，向PEG-磷脂中添加调节因子将在抑制同种异体肾脏移植中的I/R损伤方面进一步改善构建体。
接触系统的活化是先天免疫力的一部分，可能导致严重的术中并发症，例如再灌注后的心血管紊乱和血液动力学不稳定。这种现象先前被描述为再灌注后综合征(PRS)，首次在肝脏移植物的再灌注之后经历严重的血液动力学不稳定的肝脏移植受体中被观察到。但是，这种现象还在肾脏和胰腺移植受体中观察到，这些受体常常在再灌注之后立即遭受血液动力学不稳定。在PRS期间，血浆蛋白因子XII、激肽释放酶前体和高分子量激肽原被活化，导致凝血级联的启动和缓激肽的产生，缓激肽是一种非常有效的血管扩张剂，引起血液动力学不稳定。因此，全身动脉压的快速降低导致移植物灌注受损和移植物热缺血的延长。这些患者可能遭受移植物功能延迟、排斥风险增加和移植物损失过早。在健康的个体中，心率的提高可以部分补偿血压的下降。
在我们对猪的长期存活研究中，显示了移植PEG-磷脂处理的肾脏的动物在再灌注之后心率和动脉血压的变化很小或没有变化。因此，PEG-磷脂产物还阻止了接触系统的活化，并最终阻止PRS。
不同的长期实验之间的差异在于，在前面的实验中的移植物在未浸没于灌注液中的情况下在+4℃的冰箱中储存24小时，并且在肾脏移植之前40min通过灌注到脉管系统中来施用PEG-磷脂。在后面的实验中，在获取后立即用PEG-磷脂对移植物进行灌注，之后在+4℃下浸没于溶解于灌注液中的PEG-磷脂中24小时，直到移植和再灌注。在第一项研究中在PEG-磷脂处理的动物中已经有显著较低的级联系统活化(图8A至图8C)和细胞因子表达(图9A至图9L)。然而，在第二项研究中，与第一项研究相比，级联系统活化(图17A至17D)和细胞因子表达(图18A至图18G)低得多，并且此外，PEG-磷脂处理导致级联系统活化(图17A至图17D)和细胞因子表达(图18A至图18G)的显著减少。因此，本实验清楚地表明，灌注液和PEG-磷脂的组合是优异的组合。在此实验中还显示，在PEG-磷脂处理的移植物的移植物再灌注后，细胞因子表达明显较低(图18A至图18G)，指示在冷缺血期期间，在再灌注之前已经诱导了抗炎效应，这可能是由于上文提到的在缺血期间对CL-11的抑制效应。
实验2
实验的目的是对在大鼠中与磷脂(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺，DPPE)缀合的PEG的安全性评估。静脉内施用单剂量的化合物，然后恢复期为14天。在临床环境中，将2g PEG(MW：5.0kDa)/磷脂化合物稀释于1000mL例行向离体器官移植体施用的灌注溶液中，之后插入受体中。分别地，低剂量组中的大鼠被给予相同的浓度，而高剂量组中的大鼠被给予所述浓度的10倍。
研究设计
三十只两种性别的史-道二氏大鼠购自Charles River并运输到Uppsala。实验共进行了四周，从两周的适应期开始，然后以随机顺序向动物注射NaCl、低剂量或高剂量PEG磷脂(第1天)。注射在侧尾静脉中进行。然后使用Irwin观察测试，在大鼠的笼子中重复观察大鼠6小时，此测试包括对神经和运动功能进行扩展临床检查以寻找急性毒性的迹象。观察者对治疗未知。此后每周进行五天的临床检查，持续两周。在研究结束时，在终末麻醉下通过心脏穿刺收集血液。安乐死后，立即对所有动物进行尸检(第15天)。
第1组：10只对照动物(5只雌性，5只雄性)接受1mL NaCl
第2组：10只大鼠(5只雌性，5只雄性)接受1mL 2mg/mL PEG-磷脂
第3组：10只大鼠(5只雌性，5只雄性)接受1mL 20mg/mL PEG-磷脂
临床观察
在整个研究中，每周5天对所有动物进行检查并处理。将它们从笼子中取出并且一次一只或两只放在一块合成羊毛上。每周三次将所有大鼠放进一个大型游乐区中，一次5只大鼠，进行攀爬、沐浴和探索。处理后立即使用以玉米片的形式的正强化。他们在到达动物设施时以及在注射物质之前进行了全面的临床检查。注射后即刻，在六小时期间以设定的时间间隔观察大鼠的毒性迹象。此后，通过经验丰富的兽医对它们进行定期检查。在适应和实验期中，在任何动物中均未观察到疾病或毒性的临床迹象。
体重
在静脉内注射之前记录所有动物的体重，此后在研究的剩余时间期间每周两次记录体重。这三组动物的体重增加幅度相似。
眼科检查
在注射PEG-磷脂之前一周和之后一周，对所有动物用生物显微镜(KOWA-SL17)和检眼镜(Heine Omega 500)进行眼科检查。在检查前，大鼠接受0.5％5mg/mL
(托吡卡胺)滴眼剂。在整个过程中，都轻轻地用手握住它们。
通过眼科检查未观察到毒性迹象。在施用物质之前，一只雌性大鼠右眼有角膜混浊，并且两只雌性大鼠的晶状体有核混浊，一只在两只眼中，而另一只仅在右眼中。施用物质后，未见眼科改变，只是一只雌性大鼠有轻度上皮刺激。在注射物质之前，两只雄性大鼠具有角膜变性，一只是双侧，而另一只仅是右角膜。一只雄性大鼠的晶状体具有核缺陷，而另一只患有白内障。一只雄性大鼠中可见左眼玻璃体内出血。施用物质后，雄性大鼠中未见任何变化，并且出血被吸收。
临床病理学
在研究终止时，通过心脏穿刺从所有动物取得血液，将一毫升血液分到EDTA-肝素管和Li-肝素管中。在3000rpm下离心10min后，收集血浆并将其储存在-20℃中，直到进行临床生化分析。根据用户手册和乌普萨拉SLU临床病理学部的SOP，立即使用Advia2120Siemens保健仪器对EDTA血液进行血液学分析，并使用Abbott Laboratories的Architect c4000对血浆进行分析。分析对啮齿动物进行了验证。进行了以下血液学检查：B-血小板(B-TPK)、B-红细胞(B-EPK)、B-血红蛋白(B-Hb)、B-平均红细胞容积(B-MCV)、B-平均红细胞血红蛋白浓度(B-MCHC)、网织红细胞、红细胞分布宽度(RDW)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均血小板体积(MPV)、红细胞形态、B-白细胞(B-LPK)、B-中性白细胞、B-嗜酸性细胞、B-嗜碱细胞、B-淋巴细胞、B-单核细胞，并且对于临床生物化学进行了以下确定：钠、钾、葡萄糖、总胆固醇、尿素、肌酸酐、总蛋白和白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALAT)、天冬氨酸转氨酶(ASAT)和胆汁酸。如果可能，进行以下尿液分析：pH、蛋白质、葡萄糖和血液。
8-16周龄的史-道二氏大鼠的所有血液和血浆分析结果均在参考范围内。在五个尿液样本中检测到血液。
病理学
在第15天通过在异氟烷和氧气麻醉下放血来对所有动物实施安乐死以进行预定的尸检。进行了安乐死和大体病理检查之后记录体重。在任何动物中均未发现宏观异常。
结论
在低剂量、高剂量和对照组动物中，临床检查，包括眼科调查，均未显示任何毒性迹象。血液学和生化分析均在参考范围内，并且尸检中未发现任何动物的宏观异常。可以得出结论，静脉内施用的PEG-磷脂在大鼠中的耐受浓度高达20mg/mL。
实验3
镓-68(68Ga)是半衰期为68min的正电子发射体，通常用作正电子发射断层扫描(PET)/计算机断层扫描(CT)中的诊断放射性核素。放射性标记的PEG-磷脂分子68Ga-NO2A-PEG磷脂是以两步合成法制得的。
缓冲液和储备溶液的制备。
用于68Ga洗脱的0.1M盐酸(HCl)。将浓盐酸(9.00mL，d＝1.17g×mL-1，11.23M，32-35％超纯NORMATOM，用于痕量金属分析)添加到水(1000mL，Thermo Fisher，超痕量分析级)中并直接在水瓶中混合并且以4℃储存在暗处。在发生器洗脱之前，将等分试样在塑料瓶(Nalgene高密度聚乙烯低金属树脂，Thermo Fischer)中于室温下保存。
无金属的水。在玻璃烧瓶中从净水器(MillieQ)获得去离子水。将等分试样转移到塑料容器中，并储存在Chelex-100上以清除金属离子。
在DMSO和水中的1.0M NO2A-叠氮化物溶液。将1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-双(乙酸)-7-(3-叠氮基丙基乙酰胺)三盐酸盐(NO2A-叠氮化物，大环化合物，式量494.8g/mol)(1.0mg，2.0μmol)添加到Eppendorf管(2mL)中。首先将固体溶解于二甲基亚砜(DMSO，50μL)中，并且用无金属的水(1950μL)非常缓慢地逐滴稀释，直到获得均匀的1.0M溶液。
1.0M pH 3.5乙酸钠缓冲液。制备缓冲液的所有步骤均使用无金属的水。将乙酸钠(8.203g，0.100mol，99.995％痕量金属基础，TraceSELECT)在塑料瓶(Nalgene，HDPE低金属树脂)中溶解于水(100mL)中，并且通过使用塑料移液管添加浓乙酸(≥99％，TraceSELECT用于痕量分析)来将pH调节至4.5、4.0或3.5。最终体积由于添加了盐和酸而大于100mL，因此最终溶液的摩尔浓度小于1.0M。依次抽出约5mL缓冲液的等分试样，并用校准的pH计(Mettler Toledo)测量pH。pH测量后将等分试样丢弃，以避免来自pH探针的任何金属污染。最终的缓冲液储存在Chelex 100上，并在进一步使用前通过0.5μm针式过滤器过滤。
1.0M氢氧化钠溶液。在Eppendorf管中，用不含金属的水(900μL)稀释氢氧化钠溶液(100μL，10M，生物特级，Sigma Aldrich)。
68Ga发生器的洗脱
使用10mL塑料注射器和机动化注射器驱动器(Univentor 864，Malta)用0.1M HCl(5.0mL，约0.8mL/min)从68Ga/68Ge发生器(50mCi发生器，Obninsk，Russia)洗脱68Ga。将所得溶液分馏在Eppendorf管中以获得小体积和高放射性浓度。
级分1：时间0-45s，600μl，0MBq-舍弃
级分2：时间45-1min，15s，400μl，212MBq-留下以用于标记
级分3：时间1min，15s-6min，15s，4000μl，281MBq-舍弃
HPLC方法
LaPrep Sigma HPLC系统(Hitachi)配备有手动进样器(Rehodyne 7225i，20μL环大小)、具有与光缆连接的外部分析型UV流通池(2μL)的UV检测器(4D LWL，Knauer)以及配备由范围扩展模块FC 6106(Eckert and Ziegler)和PMT/NaI井探测器FC-3300(Eckertand Ziegler)的放射性检测器(Flow Count，Bioscan)(串联附接在UV检测器之后)。由于分析的放射性材料的粘性，在放射检测器内部优选使用不锈钢环而不是塑料环。HPLC设备使用OpenLAB(Agilent)进行软件控制，并且使用相同的软件分析结果。
离子室(VDC 202，Veenstra Instruments，使用的68Ga的校准系数为751)。
方法A：反相，C18柱YMC-Pack ODS-AL，AL12S05-1046WT，AL-301(YMC EuropeGmbH)100×4.6mm(I.D)，5μm，120A。溶剂A：水和0.1％TFA，溶剂B：乙腈和0.1％TFA。溶剂梯度：在5min内5-70％B，然后70％B持续3min。流速1.0ml·min-1。
方法B：尺寸排阻色谱法，柱：SuperdexTMPEPTIDE 10/300GL，GE Healthcare。等度洗脱液30％B。流速0.80mL·min-1。
[68Ga]NO2A-叠氮化物的合成
将1.0M氢氧化钠(40μL，40μmol)和0.10M乙酸钠缓冲液(25μL，pH3.5)在Eppendorf管(2mL)中混合，并添加到在0.1M HCl(400μL)中的68Ga(179MBq)中。然后添加NO2A-叠氮化物溶液(10μL，在DMSO/纯水混合物(1/39)中1.0M，按体积计)(总反应体积为250μL)，并且使小瓶涡旋，离心并在加热块中加热至80℃持续15min，以形成68Ga标记的NO2A-叠氮化物，参见图14。使用放射性HPLC方法A分析粗品反应混合物，波长λ＝215nm，tR：无信号(UV)，3.7min(放射)，且未进一步纯化即用于后续反应。使用放射性HPLC方法B作为点击反应中未反应的1的参考，tR：无信号(UV)tR：25.7min(放射)。
DBCO-PEG-脂质的合成
在室温下，将Mal-PEG-脂质(20mg)与半胱氨酸(2mg)在PBS(1mL)中反应1h，并通过旋转柱(Protein Desalting Spin Column，Thermo Fisher Scientific)纯化，以在冻干后获得Cys-PEG-脂质。然后，将Cys-PEG-脂质(在PBS中10mg)与在DMSO(1mL)中的DBCO-C6-NHS酯(6mg，Click Chemistry Tools LLC)在室温下反应1h。添加10mL纯水后，通过过滤来去除沉淀(孔径：0.2μm，
-GV，Merck Millipore Ltd.)，然后真空干燥，以获得DBCO-PEG-脂质(5mg)。DBCO的标记效率为80％，由DBCO的紫外线吸收率计算得出。
68Ga-NO2A-PEG-脂质的合成
将DBCO-PEG-脂质(2.0mg，333nmol脂质，75％DBCO功能化，250nmol DBCO)和PBS(50μL)添加到Eppendorf管(2mL)中。使用离心机将所有材料移至小瓶底部。随后，添加450μL先前制备的[68Ga]NO2A-叠氮化物溶液(116MBq，9.0nmol)。反应混合物中的最终DBCO/叠氮化物比率按摩尔比计为1/28。使反应在室温下持续10分钟，然后在加热块中加热至60℃持续10分钟。
将450μL反应混合物转移至NAP-5柱(
G-25DNA级柱，用5mL PBS预平衡，截断值为5kDa，GE Healthcare)，将其用PBS洗脱为200μL馏分。将期望的产物68Ga-NO2A-PEG-脂质(参见图15)洗脱成级分2-4(35.0MBq，基于添加的[68Ga]NO2A-叠氮化物的量，点击反应中的衰变校正放射化学产率为32％，基于洗脱的68Ga总量，非衰变校正放射化学产率为7％)并在配备有尺寸排阻色谱法柱(SuperdexTMPeptide10/300GL，GE)的放射性HPLC上进行分析，波长λ＝254nm，tR：21.5min，放射化学纯度＞92％。主要杂质是未反应的[68Ga]NO2A-叠氮化物(5％)tR：25.7min。
实验4
基于体外研究的结果，进行了PET/磁共振成像(MRI)检查，以追踪PEG-磷脂构建体在猪肾脏中的分布，并估计PEG-磷脂在猪肾脏中的分布量。
就在使用前将68Ga-NO2A-PEG-脂质(在PBS中)与未标记的MeO-PEG-脂质(在HTK溶液中)混合(68Ga-NO2A-PEG-脂质/MeO-PEG-脂质＝1/4，按摩尔比计，[PEG-脂质]＝2.0mg/mL)。
用冷PBS从猪肾脏中洗出血液，然后在4℃下用HTK溶液冲洗肾脏，并放置在填充有HTK溶液的塑料袋中过夜。通过注射器小心地将68Ga-NO2A-PEG-脂质溶液(2mg/mL，于HTK中，20mL，至少10MBq)通过猪肾脏动脉注入，并在冰上孵育30min。用冷HTK溶液(50mL)洗涤肾脏后，将处理的肾脏放置在PET/MRI设备(
Mediso Medical Imaging Systems，Budapest，Hungary)上。所述阶段为针对大型大鼠的小型动物PET/3T MRI临床前扫描仪。使用MR定位像(GRE Multi-FOV)设置PET全肾扫描的床位。静态PET检查多床扫描进行40分钟。使用整个猪肾脏发射-接收线圈以3T进行MRI测量。使用以下参数获取梯度回波(GREMultiFOV)序列：激发数(NEX)：2；重复时间(TR)：396ms；回波时间(TE)：4.15ms；翻转：45；片数：180；切片厚度：1mm；视场(FOV)：64×64mm2；空间分辨率：0.5×0.5mm2；采集时间：14min。使用Tera tomo 3D算法(4次迭代，体素大小：0.40mm，矩阵：212×212×582)重建列表模式PET数据。
使用PMOD(3.510版；PMOD Technologies Ltd.)分析PET和MRI图像。在融合的PET-MR图像上手动绘制感兴趣的体积，以包括整个肾脏和髓质周围区域。通过从整个肾脏和髓质周围区域减去值来估计示踪剂在肾脏其他部位的分布。
每个组织中的摄取以MBq表示，根据注射时间校正衰变。在剂量校准器(VDC-405，Veenstra Instrumenten，the Netherlands)中测量来自所有洗涤步骤的注射的放射性量和来自静脉的流出物，并根据注射时间校正衰变。所有测量均在室温下进行。在通过PET/MRI和伽玛计数器进行第一次测量后，再次用冷HTK溶液(50mL)洗涤肾脏，然后将肾脏放置在PET/MRI设备的台上进行第二次测量。
结果
用68Ga-NO2A-PEG-脂质以与移植到猪受体的肾脏相同的方式对猪肾脏进行处理，然后进行PET/MRI成像。用68Ga-NO2A-PEG-脂质通过注射处理肾脏并通过动脉冲洗后，进行成像以评估68Ga-NO2A-PEG-脂质的分布。68Ga-NO2A-PEG-脂质的信号分布在整个肾脏中，并且与皮质区域(19％)相比，在髓质区域还特别检测到更高的信号(81％)。当用HTK溶液进一步洗涤后90min时对同一肾脏进行再成像时，成像结果几乎相同。68Ga-NO2A-PEG-脂质的信号仍然分布在整个肾脏中，并且与皮质区域(7％)相比，在髓质区域检测到了更高的信号(93％)。这些结果表明，肾脏的所有组织和血管都通过注射包被了68Ga-NO2A-PEG-脂质，并且髓质区域的组织和血管被68Ga-NO2A-PEG-脂质很好地改性。
以上所述的实施方案应被理解为是本发明的几个说明性实例。本领域的技术人员应当理解，可对实施方案做出各种修改、组合和变化，而不背离本发明的范围。具体地，在技术上可能的情况下，不同实施方案中的不同部分解决方案可组合为其他配置。然而，本发明的范围由所附权利要求书限定。
参考文献
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Claims (16)
1.一种聚(乙二醇)-磷脂(PEG-磷脂)，其用于抑制或预防受体受试者在器官移植物的再灌注之后产生的与再灌注相关联的低血压。
2.根据权利要求1所述使用的PEG-磷脂，其中所述PEG-磷脂被配制为包含PEG-磷脂分子的溶液，并且旨在用于离体输注到所述器官移植物的脉管系统中，以实现用所述PEG-磷脂分子包被所述脉管系统的内皮内膜。
3.一种处理器官或所述器官的一部分的离体方法，所述方法包括：
将包含聚(乙二醇)-磷脂(PEG-磷脂)分子的溶液离体输注到所述器官或所述器官的所述部分的脉管系统中；以及
在所述脉管系统中离体孵育所述包含PEG-磷脂分子的溶液，以实现用所述PEG-磷脂分子包被所述脉管系统的内皮内膜的至少一部分，同时保持所述器官或所述器官的所述部分浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括：
将器官保存溶液离体输注到所述脉管系统中，以将未结合PEG-磷脂分子从所述脉管系统冲走。
5.根据权利要求3或4所述的方法，所述方法还包括：
在将所述包含PEG-磷脂分子的溶液离体输注到所述脉管系统中之前，将器官保存溶液离体输注到所述脉管系统中。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中离体输注所述溶液包括：
离体夹紧所述脉管系统的动脉和静脉中的一个；
将所述包含PEG-磷脂分子的溶液离体输注到所述动脉和所述静脉中的另一个中；以及
离体夹紧所述动脉和所述静脉中的另一个。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中离体输注所述溶液包括将包含0.25mg/mL至25mg/mL、优选地0.25mg/mL至10mg/mL并且更优选地0.25mg/mL至5mg/mL，诸如2mg/mL的PEG-磷脂分子的溶液离体输注到所述脉管系统中。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中离体输注所述溶液包括将5mL至250mL、优选地5mL至100mL并且更优选地5mL至50mL的所述包含PEG-磷脂分子的溶液输注到所述脉管系统中。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中离体孵育包括在所述脉管系统中离体孵育所述包含PEG-磷脂分子的溶液，同时保持所述器官或所述器官的所述部分浸没于所述包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中，并且所处温度高于0℃但低于8℃、优选地高于0℃但低于6℃并且更优选地高于0℃但等于或低于4℃。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述器官保存溶液选自由以下组成的组：组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐(HTK)溶液、柠檬酸盐溶液、威斯康星大学(UW)溶液、Collins溶液、Celsior溶液、京都大学溶液和Institut Georges Lopez-1(IGL-1)溶液。
11.根据权利要求3至10中任一项所述的方法，其中离体孵育包括在所述脉管系统中将所述包含PEG-磷脂分子的溶液离体孵育10分钟至48小时、优选地20分钟至36小时并且更优选地30分钟至24小时的一段时间。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其中
所述PEG-磷脂分子选自由以下组成的组：由PEG-磷脂组成的未功能化PEG-磷脂分子、包含附接至PEG-磷脂分子的PEG的相应功能化分子的功能化PEG-磷脂分子及其混合物；以及
所述功能化分子选自由以下组成的组：补体抑制剂、凝血抑制剂、血小板抑制剂、能够结合补体抑制剂的分子、能够结合凝血抑制剂的分子、能够结合血小板抑制剂的分子及其混合物。
13.根据权利要求3至12中任一项所述的方法，其中所述PEG-磷脂分子具有式(I)或式(II)：
其中
n、m为在10至16的范围内独立地选择的整数，优选地n、m独立地为10、12、14或16，并且更优选地n＝m＝14；
p经过选择，使得PEG链的平均分子量在1000Da至40000Da、优选地3000Da至10000Da的范围内选择，并且更优选地为5000Da；并且
R为H、CH2、NH2、马来酰亚胺基团、生物素基团、链霉亲和素基团、亲和素基团或选自由以下组成的组的功能化分子：补体抑制剂、凝血抑制剂、血小板抑制剂、能够结合补体抑制剂的分子、能够结合凝血抑制剂的分子、能够结合血小板抑制剂的分子及其混合物。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述功能化分子选自由以下组成的组：肝素结合肽、补体受体1(CR1)的N末端4至6个短共有重复序列(SCR)、CD46补体调节蛋白(CD46)、补体衰变加速因子(DAF)、因子H结合分子、二磷酸腺苷(ADP)降解酶及其混合物，优选地所述功能化分子选自由以下组成的组：肽5C6、三磷酸腺苷双磷酸酶、分化簇39(CD39)、C4b结合蛋白(C4BP)及其混合物。
15.根据权利要求3至14中任一项所述的方法，其中所述器官选自由以下组成的组：肾脏、肝脏、胰腺、心脏、肺、子宫、膀胱、胸腺和肠。
16.根据权利要求15所述的方法，其中
所述器官是肾脏；并且
离体孵育包括在所述脉管系统中离体孵育所述包含PEG-磷脂分子的溶液，以实现用所述PEG-磷脂分子包被肾脉管系统的肾内皮并包被肾实质的肾小管，同时保持所述肾脏浸没于包含PEG-磷脂分子的器官保存溶液中。
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