CN113041255A - 一种新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新发现miRNA–mRNA调控轴，即miR‑1228‑5p–PRKCDBP调控轴，介导肺腺癌NCI‑H1299细胞焦亡的作用机理及实施方法，属于生物技术应用领域。本发明首次提出miR‑1228‑5p和PRKCDBP在肺腺癌NCI‑H1299细胞焦亡领域的应用，并提供构建miR‑1228‑5p敲减载体和PRKCDBP过表达载体，明确它们介导肺腺癌NCI‑H1299细胞焦亡作用机理。同时，体外证实miR‑1228‑5p和PRKCDBP基因间相互作用关系，提供了miR‑1228‑5p–PRKCDBP调控轴存在依据。本发明提供了敲减miR‑1228‑5p、过表达PRKCDBP及miR‑1228‑5p–PRKCDBP调控轴介导肺腺癌NCI‑H1299细胞焦亡的新机制，因此，根据miR‑1228‑5p–PRKCDBP调控轴开发制备抗肺腺癌药物及基因编辑疗法具有明显的临床运用价值。

Description

一种新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦 亡的方法
技术领域
本发明涉及一种新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法，属于生物技术应用领域。
背景技术
肺癌在当前世界范围内仍是死亡率最高的肿瘤。随着科技的发展，虽然针对肺癌的治疗方法在不断进步，但临床效果仍然有限。现代医学认为，基因的调节对于疾病发生发展及转归具有决定性作用，针对基因的治疗思路在未来有望突破传统治疗的桎梏，成为根治疾病的重要手段。
NCI-H1299细胞是一种典型的p53基因缺失肺腺癌细胞。p53基因是一种重要的肿瘤抑制基因，在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。研究NCI-H1299细胞的抗肿瘤应用对治疗肺癌具有重要意义。
miR-1228-5p基因是一种长度21bp的微小RNA，其来源于miR-1228前体RNA的5’臂端。miR-1228在肺癌相关生物学进程中有所报道。如在Daishi Chen等人的研究中，miR-1228作为海绵体基因介导circRNA hsa_circ_100395调控TCF21抑制肺癌进展，但其研究对象为miR-1228前体的3’臂，全名为miR-1228-3p，且研究范围局限在了A549和H460细胞上。与此类似的Wei-Xiao Xue等人也提出miR-1228-3p在非小细胞肺癌诊断和进展中具有意义，均有别于miR-1228-5p。
PRKCDBP被鉴定为蛋白激酶C的结合蛋白，其表达水平在多种细胞系中下调，具有潜在的抑癌作用。在现有的肺癌相关研究中，Jiali Fu等人认为，低水平的PRKCDBP通过DNMT1和TNF-α促进肺腺癌对顺铂耐药，但PRKCDBP高表达对肺腺癌的杀伤应用并未提及。
现有研究都未见直接报道miR-1228-5p和PRKCDBP通过细胞焦亡机制抑制肺腺癌NCI-H1299的应用，miR-1228-5p-PRKCDBP调控轴在抗肺癌方面的应用更是无从提及。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法，对miR-1228-5p-PRKCDBP调控轴肺腺癌NCI-H1299细胞作用机制深入研究，解决miR-1228-5p-PRKCDBP调控轴在肺腺癌NCI-H1299细胞作用机制中的理论及应用缺陷，提供临床运用miR-1228-5p-PRKCDBP调控轴治疗肺腺癌的理论依据。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法，将miR-1228-5p-PRKCDBP调控轴中miR-1228-5p敲减或PRKCDBP过表达后，促进肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡。
miR-1228-5p的具体基因序列如SEQ ID NO：1所示。
miR-1228-5p敲减所用抑制剂miR-1228-5p inhibitors的基因序列，如SEQ IDNO：2所示，对照组NC inhibitors的基因序列如SEQ ID NO：3所示。
miR-1228-5p表达水平的特异性扩增引物序列如SEQ ID NO：4-6所示。
miR-1228-5p inhibitors转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，诱导NCI-H1299细胞死亡。
miR-1228-5p inhibitors转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，诱导NCI-H1299细胞炎症因子IL-1β和IL-18释放。
miR-1228-5p inhibitors转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，诱导NCI-H1299细胞ASC蛋白寡聚化，ASC瘢痕形成。
miR-1228-5p inhibitors转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，诱导NCI-H1299细胞caspase1、IL-1β和GSDMD蛋白剪切。
miR-1228-5p inhibitors转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，诱导NCI-H1299细胞NLRP3炎症小体释放。
PRKCDBP的具体基因序列如SEQ ID NO：7所示。
PRKCDBP过表达质粒（即p-PRKCDBP）通过PGMLV-6395载体构建。
PRKCDBP表达水平的特异性扩增引物序列如SEQ ID NO：8-9所示。
p-PRKCDBP转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，诱导NCI-H1299细胞死亡。
p-PRKCDBP转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，诱导NCI-H1299细胞炎症因子IL-1β和IL-18释放。
p-PRKCDBP转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，诱导NCI-H1299细胞ASC蛋白寡聚化，ASC瘢痕形成。
p-PRKCDBP转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，诱导NCI-H1299细胞caspase1、IL-1β和GSDMD蛋白剪切。
p-PRKCDBP转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，诱导NCI-H1299细胞NLRP3炎症小体释放。
miR-1228-5p-PRKCDBP调控轴中，miR-1228-5p与PRKCDBP的结合位点，其中miR-1228-5p的结合位点序列如SEQ ID NO：10所示，PRKCDBP的结合位点序列如SEQ ID NO：11所示。
miR-1228-5p的模拟物miR-1228-5p mimics的基因序列如SEQ ID NO：12所示，对照组NC mimics的基因序列如SEQ ID NO：13所示。
PRKCDBP序列上，包含miR-1228-5p与PRKCDBP的结合位点的pmirGLO载体构建的野生型（pmirGLO-PRKCDBP-WT）和突变型（pmirGLO-PRKCDBP-MUT）双荧光素酶报告基因质粒，所包含的基因序列如SEQ ID NO：14-15所示。
miR-1228-5p mimics与pmirGLO-PRKCDBP-WT共转染293T、A549和NCI-H1299细胞中，其luciferase荧光强度下降的应用。
miR-1228-5p mimics转染NCI-H1299细胞后，PRKCDBP蛋白表达上调。
本发明的有益技术效果是：通过miR-1228-5p–PRKCDBP调控轴促进肺腺癌NCI-H1299细胞释放炎症因子IL-1β和IL-18，以炎症小体NLRP3为介导，通过ASC蛋白寡聚化、caspase1、IL-1β和GSDMD蛋白剪切，激活细胞焦亡经典通路，导致NCI-H1299细胞焦亡发生，且研究证实miR-1228-5p与PRKCDBP能够在基因层面相互结合，因此，miR-1228-5p–PRKCDBP调控轴有望作为作用靶点，开发活性成分，用于制备抗肺腺癌药物，具有明显的临床应用价值。
附图说明
图1为miR-1228-5p/NC inhibitors转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，miR-1228-5p表达对比图；
图2为Annexin V/PI流式细胞术在miR-1228-5p/NC inhibitors转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，死亡细胞检测和对比图片；
图3为ELISA法证实miR-1228-5p inhibitors促进炎症因子IL-1β和IL-18释放图；
图4为免疫荧光染色证实miR-1228-5p inhibitors促进ASC蛋白寡聚化并形成ASC瘢痕图片；
图5a～图5b为western blot实验证实miR-1228-5p inhibitors促进caspase1、IL-1β和GSDMD蛋白剪切的图片；
图6为免疫荧光染色证实miR-1228-5p inhibitors促进NLRP3炎症小体释放图片；
图7为Annexin V/PI流式细胞术在p-PRKCDBP/NC转染肺腺癌NCI-H1299细胞后，死亡细胞检测和对比图片；
图8为ELISA法证实p-PRKCDBP促进炎症因子IL-1β和IL-18释放图；
图9为免疫荧光染色证实p-PRKCDBP促进ASC蛋白寡聚化并形成ASC瘢痕图片；
图10a～图10b为western blot实验证实p-PRKCDBP促进caspase1、IL-1β和GSDMD蛋白剪切的图片；
图11为免疫荧光染色证实p-PRKCDBP促进NLRP3炎症小体释放图片；
图12a～图12c为293T、A549和NCI-H1299细胞中，双荧光素酶报告基因实验证实miR-1228-5p与PRKCDBP的结合位点的图片；
图13为western blot实验证实miR-1228-5p inhibitors上调PRKCDBP蛋白表达。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的解释说明。
实施例1
miR-1228-5p的RT-qPCR引物设计。
实验方法：依据RT-qPCR引物设计原则，使用Primer5.0软件设计实时定量荧光PCR引物。
实验结果：得到miR-1228-5p的RT-qPCR引物，引物序列如SEQ ID NO：4-6所示。
实施例2
miR-1228-5p敲减所用抑制剂即miR-1228-5p inhibitors构建。
实验方法：根据miR-1228-5p序列，设计miR-1228-5p/NC inhibitors，化学合成。通过NCI-H1299细胞转染及RT-qPCR对所得inhibitors抑制效率进行检测。
实验结果：得到miR-1228-5p/NC inhibitor，序列如SEQ ID NO：2-3所示。所得inhibitors转染后，miR-1228-5p基因较正常细胞及空载质粒转染组显著下降，抑制后如图1所示，miR-1228-5p表达水平为空白细胞的0.14-0.25，miR-1228-5p inhibitors构建成功。
实施例3
miR-1228-5p inhibitors转染NCI-H1299细胞后，Annexin V/PI流式细胞术细胞死亡检测。
实验方法：将正常培养的NCI-H1299细胞以5×105 个/ml密度，2ml/孔种入6孔板。24 H贴壁培养后，运用Lipofectamine 2000及Opti MEM将miR-1228-5p/NC inhibitors转染入细胞。24 H干预后收集细胞，运用FITC-Annexin V流式细胞检测试剂盒，检测细胞死亡情况。
实验结果：如图2所示，肺腺癌NCI-H1299细胞在miR-1228-5p inhibitors转染的死亡数量较正常培养及空载质粒转染有显著上升，表明miR-1228-5p inhibitors对肺腺癌NCI-H1299细胞具有显著的抑制作用。
实施例4
miR-1228-5p inhibitors转染NCI-H1299细胞后，细胞炎症因子IL-1β和IL-18检测。
实验方法：将正常培养的NCI-H1299细胞以5×105 个/ml密度，2ml/孔种入6孔板。24 H贴壁培养后，运用Lipofectamine 2000及Opti MEM将miR-1228-5p/NC inhibitors转染入细胞。24 H干预后收集细胞，运用IL-1β和IL-18的ELISA检测试剂盒，检测细胞炎症因子IL-1β和IL-18释放情况。
实验结果：如图3所示，肺腺癌NCI-H1299细胞炎症因子IL-1β和IL-18在miR-1228-5p inhibitors组释放升高，表明miR-1228-5p inhibitors对肺腺癌NCI-H1299细胞具有显著的促炎症因子释放作用，而IL-1β和IL-18释放现象为细胞焦亡的特征炎症因子。
实施例5
miR-1228-5p inhibitors转染NCI-H1299细胞后，ASC蛋白免疫荧光检测。
实验方法：将正常培养的NCI-H1299细胞以5×105 个/ml密度，2ml/孔种入激光共聚焦皿。24 H贴壁培养后，运用Lipofectamine 2000及Opti MEM将miR-1228-5p/NCinhibitors转染至NCI-H1299细胞中。24 H干预后固定，并孵育ASC蛋白一抗，水平摇床过夜。孵育荧光二抗，激光共聚焦显微镜观察拍照。
实验结果：如图4所示，miR-1228-5p inhibitors转染肺腺癌NCI-H1299细胞形成ASC瘢痕，表明miR-1228-5p inhibitors对肺腺癌NCI-H1299细胞中ASC蛋白寡聚化具有促进作用，为细胞焦亡的典型特征。
实施例6
miR-1228-5p inhibitors转染NCI-H1299细胞后，caspase1、IL-1β和GSDMD蛋白剪切检测。
实验方法：将正常培养的NCI-H1299细胞以5×105 个/ml密度，2ml/孔种入六孔板。24 H贴壁培养后，运用Lipofectamine 2000及Opti MEM将miR-1228-5p/NC inhibitors转染至NCI-H1299细胞中。24 H干预后提取细胞总蛋白，以β-actin为内参，western blot检测caspase1、IL-1β和GSDMD前体蛋白及剪切蛋白量。
实验结果：如图5a～图5b所示，miR-1228-5p inhibitors转染肺腺癌NCI-H1299细胞使cleaved-caspase1、cleaved-IL-1β和cleaved-GSDMD蛋白量显著上升，表明miR-1228-5p inhibitors促进肺腺癌NCI-H1299细胞中caspase1、IL-1β和GSDMD蛋白剪切，为细胞焦亡经典通路被激活。
实施例7
miR-1228-5p inhibitors转染NCI-H1299细胞后，NLRP3炎症小体免疫荧光检测。
实验方法：将正常培养的NCI-H1299细胞以5×105 个/ml密度，2ml/孔种入激光共聚焦皿。24 H贴壁培养后，运用Lipofectamine 2000及Opti MEM将miR-1228-5p/NCinhibitors转染至NCI-H1299细胞中。24 H干预后固定，并孵育NLRP3炎症小体一抗，水平摇床过夜。孵育荧光二抗，激光共聚焦显微镜观察拍照。
实验结果：如图6所示，miR-1228-5p inhibitors转染肺腺癌NCI-H1299细胞使NLRP3表达上调，表明miR-1228-5p inhibitors钠促进肺腺癌NCI-H1299细胞NLRP3炎症小体释放，而炎症小体释放为细胞焦亡必经之路。
实施例8
PRKCDBP的RT-qPCR引物设计。
实验方法：依据RT-qPCR引物设计原则，使用Primer5.0软件设计实时定量荧光PCR引物。
实验结果：得到PRKCDBP的RT-qPCR引物，引物序列如SEQ ID NO：8-9所示。
实施例9
PRKCDBP过表达质粒构建。
实验方法：依据PCR引物设计原则，设计PCR扩增片段引物，并在引物5’端引入线性化克隆载体末端的同源序列。利用稀释的引物及模板进行PCR扩增。将载体质粒（PGMLV-6395）进行扩增、双酶切后，加入目标片段，无缝克隆，转化。
实验结果：得到PRKCDBP过表达质粒p-PRKCDBP，其所包含序列如SEQ ID NO：7所示。同时留存空载质粒p-NC。
实施例10
p-PRKCDBP转染NCI-H1299细胞后，Annexin V/PI流式细胞术细胞死亡检测。
实验方法：将正常培养的NCI-H1299细胞以5×105 个/ml密度，2ml/孔种入6孔板。24 H贴壁培养后，运用Lipofectamine 2000及Opti MEM将p-PRKCDBP/NC转染入细胞。24 H干预后收集细胞，运用FITC-Annexin V流式细胞检测试剂盒，检测细胞死亡情况。
实验结果：如图7所示，肺腺癌NCI-H1299细胞在p-PRKCDBP转染的死亡数量较正常培养及空载质粒转染有显著上升，表明p-PRKCDBP对肺腺癌NCI-H1299细胞具有显著的抑制作用。
实施例11
p-PRKCDBP转染NCI-H1299细胞后，细胞炎症因子IL-1β和IL-18检测。
实验方法：将正常培养的NCI-H1299细胞以5×105 个/ml密度，2ml/孔种入6孔板。24 H贴壁培养后，运用Lipofectamine 2000及Opti MEM将p-PRKCDBP/NC转染入细胞。24 H干预后收集细胞，运用IL-1β和IL-18的ELISA检测试剂盒，检测细胞炎症因子IL-1β和IL-18释放情况。
实验结果：如图8所示，肺腺癌NCI-H1299细胞炎症因子IL-1β和IL-18在p-PRKCDBP组释放升高，表明p-PRKCDBP对肺腺癌NCI-H1299细胞具有显著的促炎症因子释放作用，而IL-1β和IL-18释放现象为细胞焦亡的特征炎症因子。
实施例12
p-PRKCDBP转染NCI-H1299细胞后，ASC蛋白免疫荧光检测。
实验方法：将正常培养的NCI-H1299细胞以5×105 个/ml密度，2ml/孔种入激光共聚焦皿。24 H贴壁培养后，运用Lipofectamine 2000及Opti MEM将p-PRKCDBP/NC转染至NCI-H1299细胞中。24 H干预后固定，并孵育ASC蛋白一抗，水平摇床过夜。孵育荧光二抗，激光共聚焦显微镜观察拍照。
实验结果：如图9所示，p-PRKCDBP转染肺腺癌NCI-H1299细胞形成ASC瘢痕，表明p-PRKCDBP对肺腺癌NCI-H1299细胞中ASC蛋白寡聚化具有促进作用，为细胞焦亡的典型特征。
实施例13
p-PRKCDBP转染NCI-H1299细胞后，caspase1、IL-1β和GSDMD蛋白剪切检测。
实验方法：将正常培养的NCI-H1299细胞以5×105 个/ml密度，2ml/孔种入六孔板。24 H贴壁培养后，运用Lipofectamine 2000及Opti MEM将p-PRKCDBP/NC转染至NCI-H1299细胞中。24 H干预后提取细胞总蛋白，以β-actin为内参，western blot检测caspase1、IL-1β和GSDMD前体蛋白及剪切蛋白量。
实验结果：如图10a～图10b所示，p-PRKCDBP转染肺腺癌NCI-H1299细胞使cleaved-caspase1、cleaved-IL-1β和cleaved-GSDMD蛋白量显著上升，表明p-PRKCDBP促进肺腺癌NCI-H1299细胞中caspase1、IL-1β和GSDMD蛋白剪切，为细胞焦亡经典通路被激活。
实施例14
p-PRKCDBP转染NCI-H1299细胞后，NLRP3炎症小体免疫荧光检测。
实验方法：将正常培养的NCI-H1299细胞以5×105 个/ml密度，2ml/孔种入激光共聚焦皿。24 H贴壁培养后，运用Lipofectamine 2000及Opti MEM将p-PRKCDBP/NC转染至NCI-H1299细胞中。24 H干预后固定，并孵育NLRP3炎症小体一抗，水平摇床过夜。孵育荧光二抗，激光共聚焦显微镜观察拍照。
实验结果：如图11所示，p-PRKCDBP转染肺腺癌NCI-H1299细胞使NLRP3表达上调，表明p-PRKCDBP钠促进肺腺癌NCI-H1299细胞NLRP3炎症小体释放，而炎症小体释放为细胞焦亡必经之路。
实施例15
miR-1228-5p mimics模拟物构建。
实验方法：根据miR-1228-5p序列，设计miR-1228-5p/NC mimics序列，化学合成。
实验结果：得到miR-1228-5p/NC mimics，序列如SEQ ID NO：12-13所示。
实施例16
包含miR-1228-5p与PRKCDBP的结合位点的pmirGLO载体构建的野生型（pmirGLO-PRKCDBP-WT）和突变型（pmirGLO-PRKCDBP-MUT）双荧光素酶报告基因质粒构建。
实验方法：依据PCR引物设计原则，设计PCR扩增片段引物，并在引物5’端引入线性化克隆载体末端的同源序列。利用稀释的引物及模板进行PCR扩增。将载体质粒（pmirGLO）进行扩增、双酶切后，加入目标片段，无缝克隆，转化。
实验结果：得到pmirGLO-PRKCDBP-WT和pmirGLO-PRKCDBP-MUT质粒，其所包含序列如SEQ ID NO：14-15所示。同时留存空载质粒pmirGLO质粒。
实施例17
pmirGLO-PRKCDBP-WT/pmirGLO-PRKCDBP-MUT/pmirGLO与miR-1228-5p/NC mimics共转染后，双荧光素酶报告基因实验荧光强度检测。
实验方法：将正常培养的293T、A549和NCI-H1299细胞以5×105 个/ml密度，2ml/孔种入6孔板。24 H贴壁培养后，运用Lipofectamine 2000及Opti MEM将pmirGLO-PRKCDBP-WT/pmirGLO-PRKCDBP-MUT/pmirGLO与miR-1228-5p/NC mimics共转染入细胞。24 H干预后收集细胞，运用Dual-Luciferase Reporter Assay System检测试剂盒，检测细胞荧光强度变化。
实验结果：如图12a～图12c所示，在293T、A549和NCI-H1299细胞中，miR-1228-5pmimics与pmirGLO-PRKCDBP-WT共转染组luciferase荧光强度下降明显，具有统计学意义，表明所假设的miR-1228-5p和PRKCDBP的mRNA结合位点成立。
实施例18
miR-1228-5p inhibitors转染NCI-H1299细胞后，PRKCDBP蛋白检测。
实验方法：将正常培养的NCI-H1299细胞以5×105 个/ml密度，2ml/孔种入六孔板。24 H贴壁培养后，运用Lipofectamine 2000及Opti MEM将miR-1228-5p/NC inhibitors转染至NCI-H1299细胞中。24 H干预后提取细胞总蛋白，以β-actin为内参，western blot检测PRKCDBP蛋白量。
实验结果：如图13所示，miR-1228-5p inhibitors转染肺腺癌NCI-H1299细胞使PRKCDBP蛋白量显著上升，表明miR-1228-5p与PRKCDBP蛋白具有负向调节作用。
综上实验可见，miR-1228-5p-PRKCDBP调控轴中的关键基因miR-1228-5p敲减和PRKCDBP过表达能够促进肺腺癌NCI-H1299细胞释放炎症因子IL-1β和IL-18，以炎症小体NLRP3为介导，通过ASC蛋白寡聚化、caspase1、IL-1β和GSDMD蛋白剪切，激活细胞焦亡经典通路，导致NCI-H1299细胞焦亡发生，且miR-1228-5p与PRKCDBP直接结合能力明确，负向调控关系成立。因此，本发明所述miR-1228-5p-PRKCDBP调控轴有望作为作用靶点，开发活性成分，用于制备抗肺腺癌药物，具有明显的临床应用价值。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
序列表
<110> 上海中医药大学
<120> 一种新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法
<141> 2021-04-13
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gugggcgggg gcaggugugu g 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cacacaccug cccccgccca c 21
<210> 3
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ucuacucuuu cuaggagguu guga 24
<210> 4
<211> 16
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agtgggcggg ggcagg 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
agtgcagggt ccgaggtatt 20
<210> 6
<211> 50
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccacaca 50
<210> 7
<211> 792
<212> DNA/RNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
gccaccatga gggagagtgc gttggagcgg gggcctgtgc ccgaggcgcc ggcggggggt 60
cccgtgcacg ccgtgacggt ggtgaccctg ctggagaagc tggcctccat gctggagact 120
ctgcgggagc ggcagggagg cctggctcga aggcagggag gcctggcagg gtccgtgcgc 180
cgcatccaga gcggcctggg cgctctgagt cgcagccacg acaccaccag caacaccttg 240
gcgcagctgc tggccaaggc ggagcgcgtg agctcgcacg ccaacgccgc ccaagagcgc 300
gcggtgcgcc gcgcagccca ggtgcagcgg ctggaggcca accacgggct gctggtggcg 360
cgcgggaagc tccacgttct gctcttcaag gaggagggtg aagtcccagc cagcgctttc 420
cagaaggcac cagagccctt gggcccggcg gaccagtccg agctgggccc agagcagctg 480
gaggccgaag ttggagagag ctcggacgag gagccggtgg agtccagggc ccagcggctg 540
cggcgcaccg gattgcagaa ggtacagagc ctccgaaggg ccctttcggg ccggaaaggc 600
cctgcagcgc caccgcccac cccggtcaag ccgcctcgcc ttgggcctgg ccggagcgct 660
gaagcccagc cggaagccca gcctgcgctg gagcccacgc tggagccaga gcctccgcag 720
gacaccgagg aagatcccgg gagacctggg gctgccgaag aagctctgct ccaaatggag 780
agtgtagcct ga 792
<210> 8
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gctccacgtt ctgctcttca agg 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
tctctccaac ttcggcctcc ag 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gugggcgggg gcaggugugu g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cucacaccug cuugcgcuca c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gugggcgggg gcaggugugu g 21
<210> 13
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ucacaaccuc cuagaaagag uaga 24
<210> 14
<211> 559
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gctagcctgg gcccagagca gctggaggcc gaagttggag agagctcgga cgaggagccg 60
gtggagtcca gggcccagcg gctgcggcgc accggattgc agaaggtaca gagcctccga 120
agggcccttt cgggccggaa aggccctgca gcgccaccgc ccaccccggt caagccgcct 180
cgccttgggc ctggccggag cgctgaagcc cagccggaag cccagcctgc gctggagccc 240
acgctggagc cagagcctcc gcaggacacc gaggaagatc ccgggagacc tggggctgcc 300
gaagaagctc tgctccaaat ggagagtgta gcctgagggc tggtgttgcc tgcctcccct 360
gtgcttgtgc cttgtcccaa aataaatcct ttcagaatgt agcactcacg ccctaataag 420
gagcgaatcc tacatccacc aaggcgggcg ctctggccct cccttcctta agcccagtcc 480
tgtgtcctct gaaagaggtg cagtcactca cacctgcttg cgctcaccat caataaaagt 540
aatttcaccc gaactcgag 559
<210> 15
<211> 559
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
gctagcctgg gcccagagca gctggaggcc gaagttggag agagctcgga cgaggagccg 60
gtggagtcca gggcccagcg gctgcggcgc accggattgc agaaggtaca gagcctccga 120
agggcccttt cgggccggaa aggccctgca gcgccaccgc ccaccccggt caagccgcct 180
cgccttgggc ctggccggag cgctgaagcc cagccggaag cccagcctgc gctggagccc 240
acgctggagc cagagcctcc gcaggacacc gaggaagatc ccgggagacc tggggctgcc 300
gaagaagctc tgctccaaat ggagagtgta gcctgagggc tggtgttgcc tgcctcccct 360
gtgcttgtgc cttgtcccaa aataaatcct ttcagaatgt agcactcacg ccctaataag 420
gagcgaatcc tacatccacc aaggcgggcg ctctggccct cccttcctta agcccagtcc 480
tgtgtcctct gaaagaggtg cagtcagtgt gtggacgttg gcgtgtgcat caataaaagt 540
aatttcaccc gaactcgag 559

Claims (10)

1.一种新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法，其特征在于：所述新发现miRNA–mRNA调控轴为miR-1228-5p–PRKCDBP调控轴，通过miR-1228-5p–PRKCDBP调控轴诱导NCI-H1299细胞焦亡。
2.根据权利要求1所述的新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法，其特征在于：所述NCI-H1299细胞焦亡的诱导方法包括miR-1228-5p敲减、PRKCDBP过表达及miR-1228-5p与PRKCDBP之间相互作用。
3.根据权利要求2所述的新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法，其特征在于：所述miR-1228-5p敲减是指，miR-1228-5p的基因序列如SEQ ID NO：1所示；所述miR-1228-5p敲减所用抑制剂miR-1228-5p inhibitors的基因序列如SEQ ID NO：2所示，对照组NC inhibitors的基因序列如SEQ ID NO：3所示；所述miR-1228-5p表达水平的特异性扩增引物序列如SEQ ID NO：4-6所示。
4.根据权利要求3所述的新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法，其特征在于：miR-1228-5p inhibitors转染NCI-H1299细胞诱导细胞死亡、细胞炎症因子IL-1β和IL-18释放、细胞ASC蛋白寡聚化，ASC瘢痕形成、细胞中caspase1、IL-1β和GSDMD蛋白剪切和细胞释放NLRP3炎症小体。
5.根据权利要求2所述的新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法，其特征在于：所述PRKCDBP过表达，PRKCDBP的基因序列如SEQ ID NO：7所示；所述PRKCDBP过表达所用过表达质粒p-PRKCDBP通过PGMLV-6395载体构建；所述PRKCDBP表达水平的特异性扩增引物序列如SEQ ID NO：8-9所示。
6.根据权利要求5所述的新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法，其特征在于：p-PRKCDBP转染NCI-H1299细胞诱导细胞死亡、细胞炎症因子IL-1β和IL-18释放、细胞ASC蛋白寡聚化，ASC瘢痕形成、细胞中caspase1、IL-1β和GSDMD蛋白剪切和细胞释放NLRP3炎症小体。
7.根据权利要求2所述的新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法，其特征在于：所述miR-1228-5p与PRKCDBP之间相互作用，miR-1228-5p与PRKCDBP在结合位点进行RNA序列结合，其中miR-1228-5p的结合位点序列如SEQ ID NO：10所示，PRKCDBP的结合位点序列如SEQ ID NO：11所示；所述miR-1228-5p与PRKCDBP之间相互作用，miR-1228-5p模拟物miR-1228-5p mimics的基因序列如SEQ ID NO：12所示，对照组NC mimics的基因序列如SEQ ID NO：13所示；所述miR-1228-5p与PRKCDBP之间相互作用，运用pmirGLO载体构建包含PRKCDBP结合位点的野生型pmirGLO-PRKCDBP-WT和突变型pmirGLO-PRKCDBP-MUT双荧光素酶报告基因质粒，所包含的基因序列如SEQ ID NO：14-15所示。
8.根据权利要求7所述的新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法，其特征在于：miR-1228-5p与PRKCDBP之间相互作用，miR-1228-5p与PRKCDBP结合位点双荧光素酶报告基因应用在293T、A549和NCI-H1299细胞中。
9.根据权利要求2所述的新发现miRNA–mRNA调控轴介导肺腺癌NCI-H1299细胞焦亡的方法，其特征在于：miR-1228-5p与PRKCDBP之间相互作用，miR-1228-5p inhibitors转染NCI-H1299细胞后，PRKCDBP蛋白表达上调。
10.将权利要求1所述的miR-1228-5p–PRKCDBP调控轴应用于制备抗癌药物及开发抗癌方法中。
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