CN113035356A - 一种大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及大气颗粒性毒性评价技术领域，为衡量大气颗粒物对心血管和神经系统损伤的影响，公开一种大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，以斑马鱼为模型生物，包括以下步骤：（1）设置心血管和神经系统的评价指标；（2）将受试剂量的大气颗粒物以溶剂的形式注射到斑马鱼体内，测试斑马鱼的各评价指标；（3）在统计学上分析斑马鱼受试组相比对照组的各评价指标的变化的显著性水平，并就不同的显著性水平赋予分值，然后计算各评价指标的总分，确定毒害等级。本发明的评价方法实现对大气颗粒物就心血管和神经系统损伤等级的判定，还可实现不同大气颗粒物的毒性程度的比较，而且周期短、成本低、准确性高。
Description
技术领域
本发明涉及大气颗粒性毒性评价技术领域，具体涉及一种大气颗粒物对心血管及神经 系统损伤的评价方法。
背景技术
大气颗粒物是重要的空气污染物，其大小、形态和组成与健康密切相关。目前大气颗 粒物对健康影响的研究主要集中在呼吸系统、肺部等。但是大部分的颗粒物在经呼吸沉积到 肺泡后可以经肺换气后通过血液输送到达其他器官，尤其是这些颗粒的表面还吸附大量的有 毒有害物质，从而对其他器官带来有害影响，比如雾霾天气下容易出现头疼、头晕等神经方 面的症状。所以势必需要开展大气颗粒物对心血管、神经方面的损伤影响研究。
利用动物模型研究发病机制、病理生理改变等是现代生物学研究中的重要方法和手 段。如目前以小鼠等为模型动物研究大气颗粒物对于肺部、呼吸系统的影响，并建立评价体 系。但是采用小鼠等动物的成本较高、时间周期长，而且不能直观的表征器官的毒性变化。
发明内容
为衡量大气颗粒物对心血管和神经系统损伤的影响，本发明的目的在于提供一种大气 颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，以准确、简洁的反应大气颗粒物尤其是不同类 型的大气颗粒物对心血管和神经系统的损失影响。
本发明提供如下的技术方案：
一种大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，以斑马鱼为模型生物，测试大气颗粒 物不同受试剂量下对斑马鱼的心血管、神经系统不同评价指标的毒害影响，并将结果量化后 确定受试剂量下大气颗粒物对心血管的毒害等级和神经系统的毒害等级，包括以下步骤：
(1)设置心血管和神经系统的评价指标；
(2)将受试剂量的大气颗粒物以溶剂的形式注射到斑马鱼体内，测试斑马鱼的各评价指标；
(3)在统计学上分析斑马鱼受试组相比对照组的各评价指标的变化的显著性水平，并就不同 的显著性水平赋予分值，然后计算各评价指标的总分，确定毒害等级。
作为本发明方法的优选，步骤(1)中心血管的评价指标包括：心率减慢、心律不齐、心包水肿、血流异常、血流缺失、血栓和出血；
神经系统的评价指标包括外周神经损伤、脑变性、中枢神经细胞凋亡、轴索损伤、髓鞘和行 为毒性。
作为本发明方法的优选，步骤(2)中的受试剂量以大气颗粒物对斑马鱼的最大非致 死剂量或最大无可见毒害反应剂量为基准设置，其中所述最大无可见毒害反应剂量为受试组 斑马鱼相对于对照组斑马鱼的心脏、循环系统、身体水肿、出血、脑部、下颚、眼、肝脏、 肠、躯干/尾/脊索、肌肉、身体着色、尾鳍、鳔均未出现任何毒性表型的剂量。研究最大无可 见毒害反应剂量内的剂量影响可以更好的反映大气颗粒物对于心血管和神经系统的长期、缓 慢影响。最大无可见毒害反应剂量内虽然有可能对斑马鱼造成损伤，但是并不易观察和比较， 本发明方法可以针对这些不易观察的损伤进行量化，从而确定伤害等级。
作为本发明方法的优选，步骤(2)中依据评价指标的不同选用不同品系和/或者不同 阶段的斑马鱼。
作为本发明方法的优选，步骤(3)中依据显著性水平赋分的方法为，
就心血管而言：p>0.05，各评价指标为0分；p<0.05，各评价指标为1～3分；p<0.01，各评 价指标为2～4分；p<0.001，各评价指标为3～5分；
就神经系统而言：p>0.05，各评价指标为0分；p<0.05，各评价指标为1～3分；p<0.01，各 评价指标为2～4分；p<0.001，各评价指标为3～5分。
作为本发明方法的优选，因各评价指标的毒性表型的发生概率不同，各评价指标在同 一分值范围内的得分不同。根据此前实验数据显示，某些毒性表型在大多数样品中都不会被 诱发，故毒性等级的计分标准不同，具体如下表1和表2所示。
表1心血管各评价指标分值
神经系统各评价指标的具体得分情况见下表2所示。
表2神经系统各评价指标分值
| p | 外周神经损伤 | 脑变性 | 中枢神经细胞凋亡 | 轴索损伤 | 髓鞘 | 行为毒性 |
| p>0.05 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| p<0.05 | 1 | 2 | 2 | 1 | 2 | 1 |
| p<0.01 | 2 | 3 | 3 | 2 | 3 | 2 |
| p<0.001 | 3 | 4 | 4 | 3 | 4 | 3 |
上表2中，外周神经损伤以运动神经元轴突长度变化衡量，脑变性以脑细胞凋亡程度衡量， 行为毒性以总运动距离衡量。
作为本发明方法的优选，独立评价心血管和神经系统的毒性等级，评价方法为，就心血管而言：将各评价指标的分值加和，0～2，毒性不明显；3～5，I级心血管毒性；6～8II级心血管毒性；9～14，III级心血管毒性；15～26，IV级心血管毒性；当斑马鱼出现心律不齐或出血时，直接定义为IV级；
就神经系统而言：将各评价指标的分值加和，0，毒性不明显；2～3，I级神经毒性；4～8， II级神经毒性；9～13，III级神经毒性；14～21，IV级神经毒性；当出现脑变性时，直接定 义为IV级。
作为本发明方法的优选，联合评价心血管和神经系统的毒性等级，评价方法为，将心血管和神经系统的各评价指标的分值加和：总分0，心血管且神经系统毒性不明显；总分为5～8，I级神经及心血管毒性；总分为9～17，II级神经及心血管毒性；总分为18～27，III级神经及心血管毒性；总分为28～47，IV级神经及心血管毒性。
作为本发明方法的优选，所述大气颗粒物包括但不限于纳米粒子、有毒化合物、PM2.5、 PM10中至少一种。
作为本发明方法的优选，所述有毒化合物包括但不限于醋酸铅、氯化甲基汞、苯并芘 中的至少一种；所述纳米粒子包括但不限于纳米二氧化硅颗粒、SiNPs、PDA、PEG中的至少 一种。
本发明的有益效果如下：
本发明的评价方法确定了对大气颗粒物就心血管和神经系统损伤的评价指标，并将各评价指 标量化后根据显著性进行赋分，实现对大气颗粒物就心血管和神经系统损伤等级的判定，并 且还可实现不同大气颗粒物的毒性程度的比较，而且周期短、成本低、准确性高，从而提供 了一种对大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法。
附图说明
图1为纳米二氧化硅和三种化合物处理后对斑马鱼心包水肿影响图，其中H所在区域 表示心脏。
图2为纳米二氧化硅和三种化合物处理后对斑马鱼血栓产生的影响图。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特 别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
本发明中所用心血管损伤的评价指标包括：心率减慢、心律不齐、心包水肿、血流异 常、血流缺失、血栓和出血；
神经系统的评价指标包括外周神经损伤、脑变性、中枢神经细胞凋亡、轴索损伤、髓鞘和行 为毒性。
心血管和神经系统就显著性水平的赋分原则为：
各评价指标的量化结果用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显 著性差异。
就心血管而言：p>0.05，各评价指标为0分；p<0.05，各评价指标为1～3分；p<0.01，各评价指标为2～4分；p<0.001，各评价指标为3～5分；
就神经系统而言：p>0.05，各评价指标为0分；p<0.05，各评价指标为1～3分；p<0.01，各 评价指标为2～4分；p<0.001，各评价指标为3～5分。
根据此前实验数据显示，某些毒性表型在大多数样品中都不会被诱发，故毒性等级的 计分标准不同，具体见表1和表2。
毒性等级的判断可以采用独立毒性评价和联合毒性评价两种机制，具体内容如下。
独立评价心血管和神经系统的毒性等级，评价方法为，
就心血管而言：将各评价指标的分值加和，0～2，毒性不明显；3～5，I级心血管毒性；6～8 II级心血管毒性；9～14，III级心血管毒性；15～26，IV级心血管毒性；当斑马鱼出现心律 不齐或出血时，直接定义为IV级；
就神经系统而言：将各评价指标的分值加和，0，毒性不明显；2～3，I级神经毒性；4～8， II级神经毒性；9～13，III级神经毒性；14～21，IV级神经毒性；当出现脑变性时，直接定 义为IV级。
联合评价心血管和神经系统的毒性等级，评价方法为，
将心血管和神经系统的各评价指标的分值加和：总分0，心血管且神经系统毒性不明显；总 分为5～8，I级神经及心血管毒性；总分为9～17，II级神经及心血管毒性；总分为18～27， III级神经及心血管毒性；总分为28～47，IV级神经及心血管毒性。
实施例1纳米二氧化硅和有毒化合物的评价
本实施例中所用有毒化合物为醋酸铅、氯化甲基汞、苯并芘。
第一部分，确定最大非致死剂量和最大无可见毒害反应剂量：
纳米二氧化硅母液(分散浓度12mg/mL)由首都医科大学提供，使用时采用超纯水稀释。醋 酸铅和氯化甲基汞均用超纯水溶解，母液剂量分别为10mg/mL和3mg/mL。苯并芘由纯 DMSO溶解，母液剂量为10mg/mL，使用时用10％DMSO按需稀释(DMSO终剂量10％)； 将配制的上述试剂按照不同阶梯剂量注射到1dpf的Albino品系斑马鱼幼鱼中至3dpf阶段， 并同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)、超纯水对照组(注射15nL)和DMSO对照 组(注射15nL)，每个剂量下处理30尾斑马鱼，显微注射处理为单次注射处理。纳米二氧化 硅和醋酸铅、氯化甲基汞对照超纯水对照组，苯并芘对照DMSO对照组。
每天统计各实验组斑马鱼死亡数量并及时移除；测试结束后统计各实验组斑马鱼死亡 数量，从而获得纳米二氧化硅颗粒和各化合物对斑马鱼的最大非致死剂量和最大无可见毒害 反应剂量，其中最大无可见毒害反应剂量的毒性器官判断指标为14个，分别为：心脏，循环 系统，身体水肿，出血，脑部，下颚，眼，肝脏，肠，躯干/尾/脊索，肌肉，身体着色，尾鳍， 鳔无异常。
结果纳米二氧化硅的最大非致死剂量为720mg/kg(斑马鱼)，纳米二氧化硅颗粒、醋 酸铅、氯化甲基汞和苯并芘的最大无可见毒害反应剂量NOAEL分别为：180mg/kg、30mg/kg、 0.6mg/kg和7.5mg/kg。
第二部分，斑马鱼静脉注射：
纳米二氧化硅注射剂量为最大无可见毒害反应剂量的1/3、2/3、1、2、3倍；
醋酸铅、氯化甲基汞和苯并芘分别为最大无可见毒害反应剂量；
上述试剂经静脉注射到斑马鱼幼鱼体内至培养到3dpf阶段，每个处理组均处理30尾斑马鱼， 每个组均设置4个平行组，并设置空白对照组、超纯水对照组(注射15nL)和DMSO对照 组(注射15nL)，然后按照要求检测。
第三部分，心血管影响：
(1)处理4h后对心率进行计数，如发生心律不齐，分别计数心房率和心室率：
就纳米二氧化硅而言，注射剂量不超过180mg/kg时，对心律和心率无明显影响，p>0.05；注 射剂量为360mg/kg及以上时，心率减慢，p<0.001；心律无明显影响，p>0.05；
就醋酸铅、氯化甲基汞和苯并芘而言，注射剂量下对心律和心率无明显影响，p>0.05；
三种有毒化合物分别和纳米二氧化硅在NOAEL剂量下联合使用均不导致心率和心律异常， p>0.05。
(2)处理24小时后，在立体解剖显微镜下观察有无心包水肿、血流速度变化、有无出血和有无血栓形成。
就有无心包水肿而言，心包水肿以心脏面积变化表示，见说明书附图1和表3所示：纳米二氧化硅注射剂量不超过180mg/kg时，不会导致心包水肿，p>0.05；注射剂量为360mg/kg 及以上时导致心包水肿，p<0.001；
醋酸铅、氯化甲基汞和苯并芘在注射剂量下不会导致心包水肿，p>0.05；
三种有毒化合物分别和纳米二氧化硅在NOAEL剂量下联合使用均不导致心包水肿，p>0.05。
就血流速度变化而言，纳米二氧化硅注射剂量不超过180mg/kg时，血流正常，p>0.05； 注射剂量为360mg/kg及以上时导致血流变慢p<0.001或血液循环缺失(720mg/kg，p<0.05)； 醋酸铅、氯化甲基汞和苯并芘在注射剂量下不会导致血流异常，p>0.05；
三种有毒化合物分别和纳米二氧化硅在NOAEL剂量下联合使用均不导致血流异常，p>0.05。 见表3所示。
表3各处理组(心包水肿、血流变慢及缺失)毒性表型发生率统计表
表中，*表示p<0.05，***表示p<0.001。
就出血而言，纳米二氧化硅、醋酸铅、氯化甲基汞和苯并芘均不导致出血，p>0.05；三种有毒化合物分别和纳米二氧化硅在NOAEL剂量下联合使用均不导致出血，p>0.05。
就血栓形成而言，处理结束后，将斑马鱼进行整体红细胞染色，利用图像处理软件进 行图像分析，定量计算心脏红细胞相对数量(用红细胞染色不透光度总和表示(Overallopacity sum)，缩写为S)，结果如图2所示(图中虚线区域内的暗色区域，照片上实际为红色区域越 小，表示血栓程度越严重)定量评价药物诱发血栓形成强弱；计算公式为：血栓形成率(％) ＝(1-S药物/S溶剂)×100％。
纳米二氧化硅剂量180mg/kg时导致血栓形成，p<0.01；纳米二氧化硅剂量360mg/kg 及以上时导致血栓形成，p<0.001；
醋酸铅和甲基氯化汞注射剂量下不诱导血栓形成，p>0.05；二者分别与纳米二氧化硅颗粒 (NOAEL注射剂量)联合处理，均诱发斑马鱼血栓形成P<0.01；并且纳米二氧化硅颗粒180 mg/kg(NOAEL注射剂量)处理组比较，没有统计学差异(p≧0.05)；
苯并芘注射剂量下诱导血栓形成，p<0.001；苯并芘与纳米二氧化硅颗粒(NOAEL注射剂量) 联合处理，诱发血栓形成，P<0.01，联合处理后血栓诱发率降低，与纳米二氧化硅颗粒180 mg/kg(NOAEL注射剂量)处理组比较，没有统计学差异(p≧0.05)。
(3)心血管损伤统计赋分
结合上述结果得到上述试剂对心血管各评价指标的分值以及总分统计，结果见下表4所示。
表4心血管各评价指标得分
从上表中可以看出，纳米二氧化硅、醋酸铅、氯甲甲基汞和苯并芘的NOAEL剂量下的总分 分别为2、0、0、3，纳米二氧化硅、醋酸铅、氯甲甲基汞在NOAEL剂量时对心血管均无明 显毒性，而苯并芘表现为I级心血管毒性。纳米二氧化硅的NOAEL剂量内对心血管均无明显毒性，两倍或三倍NOAEL剂量时，纳米二氧化硅表现为III级心血管毒性。
第四部分纳米二氧化硅对神经系统的损伤评价
本部分在第二部分纳米二氧化硅注射的基础上省略了DMSO对照组
(1)外周神经损伤，以运动神经元轴突长度变化表示，以1dpf运动神经元转基因斑马鱼为 模型动物；注射后将各实验组斑马鱼继续置于28℃培养至3dpf后，每个实验(剂量)组随 机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康NIS-Elements D 3.10 高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼运动神经元轴突长度(S)，评价纳米二氧化硅 对斑马鱼运动神经元轴突生长的影响。
结果显示，超纯水对照组的斑马鱼运动神经元轴突长度为102像素，与正常对照组(103 像素)比较p>0.05，说明超纯水对斑马鱼运动神经元轴突生长无显著影响。纳米二氧化硅在 60、120、180、360和720mg/kg剂量下，斑马鱼运动神经元轴突长度分别为100、99、95、95和92像素，与溶剂对照组比较，60和120mg/kg剂量组p>0.05，轴突生长抑制作用分别为2％和3％，180、360和720mg/kg剂量组p<0.001，轴突生长抑制作用分别为7％、7％ 和10％。
(2)脑变性，以脑细胞死亡程度表示，以1dpf野生型AB系斑马鱼为模型动物，注 射后将各实验组斑马鱼继续置于28℃培养至2dpf后，吖啶橙染色，每个实验(剂量)组随 机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼脑凋亡细胞荧光强度值总和(S)，评价纳米二氧化硅对脑细胞凋亡的影响。
溶剂对照组即超纯水对照组斑马鱼脑凋亡细胞荧光强度值总和为505513像素，与正 常对照组(508550像素)比较p>0.05，说明溶剂对不会引起斑马鱼脑细胞凋亡。纳米二氧化 硅在60、120、180、360和720mg/kg剂量下，斑马鱼脑凋亡细胞荧光强度值总和分别为509297、 506582、507180、512385和525658像素，与溶剂对照组比较p>0.05，凋亡诱导作用分别为 1％、0％、0％、1％和4％。
(3)中枢神经细胞凋亡，以1dpf野生型AB系斑马鱼为模型动物，注射后将各实验组斑马鱼继续置于28℃培养至2dpf后，吖啶橙染色，每个实验(剂量)组随机选择10尾 斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度值总和(S)，评价纳米二氧化硅对中枢神经细胞凋亡的影响。
溶剂对照组即超纯水对照组斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度值总和为26957像素， 与正常对照组(26973像素)比较p>0.05，说明溶剂即超纯水对不会引起斑马鱼中枢神经细 胞凋亡。纳米二氧化硅在60、120、180、360和720mg/kg剂量下，斑马鱼中枢神经凋亡细胞 荧光强度值总和分别为27870、27798、28419、28442和28525像素，与溶剂对照组比较p>0.05， 凋亡诱导作用分别为3％、3％、5％、6％和6％。
(4)轴索损伤，以1dpf野生型AB系斑马鱼为模型动物，注射后将各实验组斑马鱼继续置于28℃培养至3dpf后，用轴索特异性抗体进行免疫组化染色，每个实验组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康NIS-Elements D 3.10高级 图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼轴索荧光强度值总和(S)，评价纳米二氧化硅对轴 索的损伤作用。
溶剂对照组斑马鱼轴索荧光强度值总和为314628像素，与正常对照组(314583像素) 比较p>0.05，说明溶剂对不会引起斑马鱼轴索损伤。纳米二氧化硅在60、120、180、360和720mg/kg剂量下，斑马鱼轴索荧光强度值总和分别为314339、313998、310158、284563 和265991像素，与溶剂对照组比较，60、120、180mg/kg剂量组p>0.05，轴索损伤作用分别 为0％、0％和1％；360mg/kg剂量组p<0.01，轴索损伤作用为10％；720mg/kg剂量组p<0.001，轴索损伤作用为15％。
(5)行为毒性以总运动距离变化表示，二氧化硅60mg/kg的注射剂量下，总运动距离相对超纯水对照组即出现明显变化，p<0.001。进一步的研究发现，30mg/kg时也出现了较明显变化，p<0.05。
(6)以1dpf野生型AB系斑马鱼为模型动物对髓鞘和进行研究，各剂量无明显变化，下均为p>0.05。
(7)神经系统损伤统计赋分
表5神经系统各评价指标得分
从上表中可以看出，当注射剂量为60～120mg/kg时，纳米二氧化硅的神经毒性为I级神经毒 性；当注射剂量为180～720mg/kg时，纳米二氧化硅的神经毒性等级为II级神经毒性等级。
第五部分纳米二氧化硅对心血管和神经系统损伤的联合评价
表6心血管和神经系统联合得分
| 试剂mg/kg | 心血管总分 | 神经系统总分 | 总分 |
| 60 | 0 | 3 | 3 |
| 120 | 0 | 3 | 3 |
| 180 | 2 | 6 | 8 |
| 360 | 13 | 8 | 21 |
| 720 | 13 | 9 | 22 |
从上表中可以看出，60～120mg/kg剂量范围内，纳米二氧化硅对心血管和神经系统的毒性不 明显；NOAEL剂量下，纳米二氧化硅为I级神经及心血管毒性；360～720mg/kg剂量范围内， 米二氧化硅为III级神经及心血管毒性。
实施例2“PM2.5”对心血管和神经系统损伤的评价
所用“PM2.5”为黑色固体，由首都医科大学提供，使用时用超纯水配制成10mg/mL母液。
第一部分：最高暴露浓度确定
以受精后6小时(6hpf)黑色素等位基因突变型Albino系斑马鱼为模型动物，每组30尾/3mL， 以PM2.5水溶的方式暴露给斑马鱼，且PM2.5剂量浓度呈阶梯分布，并设置正常对照组(即 养鱼用水处理斑马鱼。在实验过程中，每天观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死亡的斑马鱼， 每天更换新鲜的“PM2.5”溶液，直至120hpf。供试品处理结束后，统计各实验组的斑马鱼 死亡数量和毒性情况，选择斑马鱼出现畸形、但死亡率不超过50％的最高浓度作为后续 “PM2.5”毒性评价的上限浓度。
结果显示：“PM2.5”25μg/mL浓度时，对斑马鱼无任何毒性表型出现；50μg/mL， 对斑马鱼出现卵黄囊吸收延迟的毒性表型，未引起斑马鱼死亡；100μg/mL浓度时，对斑马 鱼出现心包水肿、血流变慢、卵黄囊吸收延迟、肝脏变小等的毒性表型，但未引起斑马鱼死亡；200μg/mL浓度时，对斑马鱼出现心包水肿、血流缺失、血流变慢、卵黄囊吸收延迟、 肝脏变小等的毒性表型，并引起6.67％斑马鱼死亡；400μg/mL浓度时出现100％斑马鱼死亡。 根据斑马鱼毒性表型和死亡情况，确定“PM2.5”对黑色素等位基因突变型Albino系斑马鱼 的最高暴露浓度为200μg/mL，主要毒性表型为：心包水肿、血流缺失、血流变慢、血栓、 肝脏变小、卵黄囊吸收延迟。
第二部分：斑马鱼在不同浓度“PM2.5”水溶液中暴露处理：
选取受精后6小时(6hpf)黑色素等位基因突变型Albino系斑马鱼300尾于六孔板中，每孔 30尾，分别水溶给予“PM2.5”25、50、100和200μg/mL浓度，同时设置正常对照组(即养鱼用水处理斑马鱼)，每孔容量为3mL。在实验过程中，每天观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死亡的斑马鱼，每天更换新鲜的“PM2.5”溶液，直至72hpf，然后按照要求检测，每 个实验组均设置两个平行浓度。
第三部分：心血管损伤影响
“PM2.5”处理斑马鱼72小时后，每个实验组随机选择10尾斑马鱼在显微镜下统计并记录 斑马鱼心率，计算相对心率，并观察有无心律不齐；另每个实验组随机选择10尾斑马鱼，在 显微镜下观察有无心包水肿、血流异常、血栓形成及出血，并统计其发生率(％)。观察指标 与正常对照组进行统计分析，以统计学意义评价实验结果。
(1)“PM2.5”的25、50、100和200μg/mL浓度组斑马鱼心房率均与各自心室率 相同，提示“PM2.5”不诱发斑马鱼心律不齐，p>0.05；25、50、100μg/mL浓度组斑马鱼 心率相对对照组无明显变化，p>0.05；200μg/mL相对心率为97％，可诱发心率减慢，p﹤0.05。
(2)就心包水肿而言，25、50μg/mL组斑马鱼未出现心包水肿，p>0.05；100、200μg/mL 组斑马鱼出现心包水肿，发生率为20％&p﹤0.05、80％&p﹤0.001。
(3)就血流减慢和血流缺失而言，25、50μg/mL组斑马鱼未出现血流减慢、血流缺失，p>0.05；100μg/mL组斑马鱼出现血流减慢，发生率56.7％，p﹤0.001，未出现血流缺失， p>0.05；200μg/mL组斑马鱼出现血流减慢和血流缺失，发生率83.3％，p﹤0.001，出现血流 缺失，发生率16.6％，p>0.05。
(4)就血栓而言，“PM2.5”处理斑马鱼72小时后，用邻联茴香胺进行染色，染色 后每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照并采集数据，分析统计心脏红细胞染色强度，以心脏红细胞染色强度平均值定量评价“PM2.5”对斑马鱼诱发血栓形成毒性。结果显示：“PM2.5”在25、50、100和200μg/mL浓度时，对斑马鱼心脏红细胞染色平均值 分别为0.295、0.290、0.251和0.191像素，其血栓诱发率分别为1.3％、3.0％、16.1％和36.1％， 与正常对照组(0.299像素)比较，100和200μg/mL浓度组p<0.001，其余浓度组p>0.05， 提示“PM2.5”在100和200μg/mL浓度时能诱发斑马鱼血栓形成。
(5)四个浓度组均未出现出血。
(6)心血管损伤统计赋分
结合上述结果得到上述试剂对心血管各评价指标的分值以及总分统计，结果见下表。
表7PM2.5下心血管各评价指标的分值
从上表中可以看出，“PM2.5”在最高暴露浓度下对心血管有明显毒性，为III级心血管毒性； 1/2最高暴露浓度下对心血管毒性为II级心血管毒性；1/4倍及以下浓度对心血管毒性不明显。
第四部分神经系统损伤评价
(1)外周神经损伤，以运动神经元轴突长度变化表示，以6hpf转基因运动神经元荧光斑马 鱼为模型动物，注射后观察5天后，每个实验(浓度)组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜 下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分 析，计算斑马鱼运动神经元轴突长度(S)，评价“PM2.5”对斑马鱼运动神经元轴突生长的 影响。
结果显示：“PM2.5”在25、50、100和200μg/mL浓度下，斑马鱼运动神经元轴突 长度分别为120、116、109和94像素，与正常对照组(120像素)比较，25μg/mL组p>0.05， 轴突生长抑制作用为0％；50μg/mL组p<0.05，轴突生长抑制作用为3％；100和200μg/mL 组p<0.001，轴突生长抑制作用分别为9％和22％。
(2)轴索损伤以6hpf转基因运动神经元荧光斑马鱼为模型动物，注射后观察5天后，用轴索特异性抗体进行免疫组化染色，每个实验(浓度)组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行 图像分析，计算斑马鱼轴索荧光强度值总和(S)，评价“PM2.5”对斑马鱼轴索的损伤作用。
结果显示：“PM2.5”在25、50、100和200μg/mL浓度下，斑马鱼轴索荧光强度值 总和分别为390649、384250、380070和241249像素，与正常对照组(392102像素)比较， 25、50和100μg/mL组p>0.05，轴索损伤作用分别为0％、2％和3％；200μg/mL浓度组 p<0.001，轴索损伤作用为38％。
(3)行为毒性以总运动距离变化表示，50μg/mL及以下浓度无明显变化，p>0.05；100ug/mL出现明显变化，p<0.01，200ug/mL出现显著变化，p<0.001。
(4)脑变性、中枢神经细胞凋亡和髓鞘在剂量浓度下均无明显变化，p>0.05。
(5)神经系统损伤统计赋分
表8PM2.5下各评价指标的分值
从上表中可以看出，当暴露浓度为25～50μg/mL时，神经毒性不明显，当注射剂量为100～ 200μg/mL时，等级为II级神经毒性等级。
第五部分对心血管和神经系统损伤的联合评价
表9PM2.5下心血管和神经系统联合得分
| 试剂μg/mL | 心血管总分 | 神经系统总分 | 总分 |
| 25 | 0 | 0 | 0 |
| 50 | 0 | 1 | 1 |
| 100 | 7 | 5 | 12 |
| 200 | 10 | 9 | 19 |
从上表中可以看出，当暴露浓度为25～50μg/mL时，心血管和神经系统的毒性不明显；暴 露浓度100μg/mL时，为II级神经及心血管毒性；当暴露浓度为200μg/mL，为III级神经 及心血管毒性。
实施例3PDA对心血管和神经系统损伤的评价
所用PDA为深褐色液体，浓度4mg/mL，由首都医科大学提供，使用时超纯水稀释。
第一部分最大非致死浓度MNLD和10％致死量浓度LD10确定 以2dpf黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼为模型生物，静脉注射阶梯浓度，并设置 正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和超纯水对照组(即溶剂对照组)。实验期间，每天对死 亡的斑马鱼计数并移除死鱼；PDA处理斑马鱼至6dpf后，统计斑马鱼的死亡情况及死亡数， 根据斑马鱼毒性反应和死亡情况确定PDA对斑马鱼的MNLD和LD10。结果显示，PDA对斑 马鱼的MNLD为0.5mg/mL，LD10为4mg/mL。
第二部分：斑马鱼静脉注射：
将PDA液体经超纯水稀释后，分别阶梯浓度注射到1dpf黑色素等位基因突变型Albino品系 斑马鱼中，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和超纯水对照组，每组30尾。PDA 处理斑马鱼一段时间后每个实验组分别随机选择20尾斑马鱼在显微镜下观察并拍照，观察毒 性表型。
第三部分：对心血管损伤的影响
(1)PDA静脉注射量为5、10、20、30和40ng/尾剂量，注射容量均为10nL/尾，即PAD溶液浓度为：0.5、1、2、3、4mg/mL，处理至3pdf。
(2)在立体解剖显微镜下观察有无心包水肿、血流速度变化、有无出血和有无血栓形成，结果显示：
0.5、1mg/mL分别出现心包水肿的几率为10％、13.3％，相对对照组p>0.05；2mg/mL出现心 包水肿的几率为23.3％，p<0.05；3mg/mL出现心包水肿的几率为66.7％，p<0.001；4mg/mL 出现心包水肿的几率为73.3％，p<0.001。
同时就心率减慢、心律不齐、血流速度变化以及有无出血、血栓而言，均无明显影响， p>0.05。
(3)心血管损伤统计赋分
结合上述结果得到上述试剂对心血管各评价指标的分值以及总分统计，结果见下表。
表10PDA下心血管各评价指标分值
从上表中可以看出，在注射后的48小时内，PDA注射浓度2mg/mL以下时对心血管没有明 显毒性，当注射浓度为3、4mg/mL，显示为I级心血管毒性。
第四部分：对神经系统损伤的影响
注射浓度为0.056mg/mL、0.167mg/mL、0.5mg/mL和4mg/mL。
(1)外周神经损伤，以运动神经元轴突长度变化表示，以6hpf转基因运动神经元荧光斑马鱼为模型生物，每孔(浓度组)30尾，分别静脉注射给予PDA，注射体积均为10nL/ 尾，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和超纯水对照组。PDA处理斑马鱼至3dpf 后，每个浓度组随机选择15尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼运动神经元轴突长度，评 价PDA对斑马鱼运动神经元轴突生长的影响。
结果显示：超纯水对照组斑马鱼运动神经元轴突长度(213像素)与正常对照组(209 像素)比较p>0.05，提示溶剂对斑马鱼运动神经元轴突生长无影响；PDA 0.056mg/mL、0.167 mg/mL、0.5mg/mL和4mg/mL浓度组斑马鱼动神经元轴突长度分别为212、210、207和195 像素，与溶剂对照组(213像素)比较，0.056mg/mL、0.167mg/mL和0.5mg/mL浓度组p>0.05， 4mg/mL浓度组p<0.001，说明PDA在4mg/mL浓度条件下对斑马鱼运动神经元轴突生长有 抑制作用。
(2)中枢神经细胞凋亡，以2dpf黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼为模型生 物，每孔(浓度组)30尾，分别静脉注射给予PDA，注射体积均为10nL/尾，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和溶剂对照组。PDA处理斑马鱼至3dpf后，用吖啶橙染色， 每个浓度组随机选择15尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康 NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度值总和，评价PDA对中枢神经细胞凋亡的影响。
结果显示：溶剂对照组斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度(228327像素)与正常对照组(230386像素)比较p>0.05，提示溶剂不诱发斑马鱼中枢神经细胞凋亡；PDA 0.056 mg/mL、0.167mg/mL、0.5mg/mL和4mg/mL浓度组斑马鱼中枢神经凋亡细胞荧光强度分别 为225839、235895、244980和241785像素，与溶剂对照组(228327像素)比较，各浓度 组p均>0.05，说明PDA本实验浓度条件下不诱发斑马鱼中枢神经细胞凋亡。
(3)行为毒性影响，以运动总距离为指标，以2dpf黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼为模型生物，每孔(浓度组)30尾，分别静脉注射给予PDA，注射体积均为10nL/ 尾，同时设置正常对照组(养鱼用水处理斑马鱼)和超纯水对照组。PDA处理斑马鱼至6dpf 后，每个实验组随机选取12尾斑马鱼，利用行为分析仪测定斑马鱼的运动总距离，评价PDA 对斑马鱼运动功能的影响。
结果显示：溶剂对照组斑马鱼运动距离(3722mm)与正常对照组(3961mm)比较 p>0.05，提示溶剂对斑马鱼运动功能无影响；PDA 0.056mg/mL、0.167mg/mL、0.5mg/mL 和4mg/mL浓度组斑马鱼运动距离分别为3769、3446、2994和2280mm，与溶剂对照组(3722 mm)比较，0.056mg/mL、0.167mg/mL和0.5mg/mL浓度组p>0.05，4mg/mL浓度组p<0.001， 说明PDA在4mg/mL浓度条件下对斑马鱼运动距离有影响。
(4)以1dpf黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼为模型生物，研究脑变性、轴索损伤髓鞘影响，结果显示测试浓度下均无明显影响，p>0.05。
(6)神经系统损伤统计赋分
表11 PDA下各评价指标的分值
从上表中可以看出，当注射剂量为0.5mg/mL及以内时，测试条件下PDA的神经毒性不明显； 当注射剂量为4mg/mL时，神经毒性等级为II级。
实施例4纳米粒子“SiNPs”和“SiNPs+PEG”对心血管损伤的评价 所用“SiNPs”为粉红色液体，3mg/mL，由首都医科大学提供，临用时超纯水稀释。
“SiNPs+PEG”为粉红色液体，6.8mg/mL，由首都医科大学提供，临用时超纯水稀释。
所用斑马鱼为24hpf野生型AB品系斑马鱼。
采用静脉注射，注射体积为10nL/尾，注射量分别为：“SiNPS”5ng/尾、10ng/尾、20ng/尾、30ng/尾；“SiNPs+PEG”5ng/尾、10ng/尾、20ng/尾、30ng/尾、40ng/尾， 并设置超纯水对照组和正常对照组，每孔养鱼水容量为3mL，同时设置正常对照组和溶剂对 照组。处理期间，每天整体观察并记录斑马鱼毒性表型和死亡情况，对有毒性表型的实验组 每组拍一张整体图片，同时清除死亡的斑马鱼。处理结束，在显微镜下观察记录“PDA”实 验组斑马鱼脑部(大小、变性)、躯干(弯曲)、运动(侧翻)等反应情况，“SiNPs+PEG” 和“SiNPs”实验组斑马鱼心脏、血液循环等反应情况。以各器官的反应情况统计各实验组的 毒性发生率，对典型毒性器官进行拍照，结果见图。心血管各评价指标具体结果见表11和表 12所示。
表12“SiNPs”毒性发生率(％)统计表(n＝30)
备注：“-”表示未见异常；表格中数字表示：发生率。
表13“SiNPs+PEG”毒性发生率(％)统计表(n＝30)
备注：“-”表示未见异常；表格中数字表示：发生率。
从上表中可以看出，“SiNPs”和“SiNPs+PEG”的主要毒性靶器官为心血管系统，主要表现为心包水肿，但由于心包水肿程度轻微，在实验终点时各个浓度几乎都已经恢复。因此在测试范围内，“SiNPs”和“SiNPs+PEG”对心血管的毒性不明显。
实施例5供试品II对心血管损伤评价
供试品II由首都医科大学提供，为白色液体，25mg/mL，临用前养鱼用水稀释成10mg/mL 子母液，现配现用。
第一部分NOAEL浓度剂量确定
以6hpf黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼为模型生物，每孔随机挑选30尾，每孔药 液体积为3mL水溶方式给予阶梯浓度的供试品II，并设置正常对照组(养鱼用水处理组)。 各浓度组置于28℃培养箱中孵育至96hpf，期间每天记录和移除死亡斑马鱼，并进行半静态 药液更换。实验结束后，观察和统计斑马鱼的毒性表型和死亡情况，确定供试品NOAEL。
结果显示：供试品II在25和50μg/mL浓度斑马鱼均未见明显异常；100μg/mL浓 度诱发斑马鱼23.3％(7/30尾)心包水肿；200μg/mL浓度诱发斑马鱼36.7(11/30尾)心包 水肿；400和600μg/mL浓度均诱发斑马鱼100％(30/30尾)心包水肿；800和1000μg/mL 浓度均诱发斑马鱼100％(30/30尾)心包水肿和100％(30/30尾)卵黄囊变性。因此供试品 II的NOAEL为50μg/mL。
第二部分试验部分
设置25、50、100和200μg/mL水溶给予浓度作为测试浓度，以6hpf黑色素等位基因突变 型Albino品系斑马鱼为模型生物，并设置正常对照组，处理至96hpf。
第三部分对心血管损伤的评价
(1)心率减慢和心律不齐
将处理的斑马鱼置于28℃培育箱中孵育至48hpf时，每个实验组随机选择15尾斑马鱼在解 剖显微镜下记录并统计心率，并观察有无心律不齐。
结果显示：各实验组处理至48hpf后，供试品II在25、50、100和200μg/mL浓度 组斑马鱼心率分别为172、172、173和172次/分钟，与正常对照组(171次/分钟)比较均p> 0.05。提示在本实验条件下，供试品II在对斑马鱼心率没有影响。各浓度组斑马鱼心房率均 与各自心室率相同，提示在本实验条件下，供试品II不诱发斑马鱼房室传导阻滞(A/V block)。
(2)心包水肿
处理后在28℃培育箱中孵育至96hpf，供试品II在25、50、100和200μg/mL浓度组斑马鱼 心脏面积分别为14904、15309、16016和16715像素，与正常对照组(14141像素)比较p>0.05&p>0.05&p<0.01&p<0.001，心包水肿诱发作用分别为5％、8％、13％和18％。提 示在本实验条件下，供试品II在100和200μg/mL浓度条件下均可诱发斑马鱼心包水肿。
(3)血栓
处理后在28℃培育箱中孵育至96hpf，正常对照组血栓发生数为3尾，血栓发生率为10％； 供试品II在25、50、100和200μg/mL浓度组血栓发生数分别为5、6、6和7尾，与正常对 照组(3尾)比较均p>0.05，血栓发生率分别为17％、20％、20％和23％。提示在本实验浓度条件下，供试品II不诱发斑马鱼血栓毒性。
(4)处理后在28℃培育箱中孵育至96hpf，经检测，各测试组别均未出血，与正常对照组相比，血流减慢和血流缺失均不明显，p>0.05。
(5)心血管损伤统计赋分
结合上述结果得到上述试剂对心血管各评价指标的分值以及总分统计，结果见下表13。
表14供试品II下心血管各评价指标分值
从上表中可以看出，在试验范围内，水溶浓度为100μg/mL及以下时对心血管没有明显毒性， 当浓度为200μg/mL，显示为I级心血管毒性。
综上所述，本发明提供了一种对大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，实 现对大气颗粒物就心血管和神经系统损伤等级的判定，还可实现不同大气颗粒物的毒性程度 的比较，而且周期短、成本低、准确性高。
Claims (10)
1.一种大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，其特征在于，以斑马鱼为模型生物，测试大气颗粒物不同受试剂量下对斑马鱼的心血管、神经系统不同评价指标的毒害影响，并将结果量化后确定受试剂量下大气颗粒物对心血管的毒害等级和神经系统的毒害等级，包括以下步骤：
（1）设置心血管和神经系统的评价指标；
（2）将受试剂量的大气颗粒物以注射或水溶的方式暴露给斑马鱼，测试斑马鱼各评价指标；
（3）在统计学上分析斑马鱼受试组相比对照组的各评价指标的变化的显著性水平，并就不同的显著性水平赋予分值，然后计算各评价指标的总分，确定毒害等级。
2.根据权利要求1所述的大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，其特征在于，
步骤（1）中心血管的评价指标包括：心率减慢、心律不齐、心包水肿、血流异常、血流缺少、血栓和出血；
神经系统的评价指标包括外周神经损伤、脑变性、中枢神经细胞凋亡、轴索损伤、髓鞘和行为毒性。
3.根据权利要求1所述的大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，其特征在于，步骤（2）中的受试剂量以大气颗粒物对斑马鱼的最大非致死剂量或最大无可见毒害反应剂量为基准设置，其中所述最大无可见毒害反应剂量为受试组斑马鱼相对于对照组斑马鱼的心脏、循环系统、身体水肿、出血、脑部、下颚、眼、肝脏、肠、躯干/尾/脊索、肌肉、身体着色、尾鳍、鳔均未出现任何毒性表型的剂量。
4.根据权利要求1所述的大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，其特征在于，步骤（2）中依据评价指标的不同选用不同品系和/或者不同阶段的斑马鱼。
5.根据权利要求1所述的大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，其特征在于，步骤（3）中依据显著性水平赋分的方法为，
就心血管而言：p>0.05，各评价指标为0分；p<0.05，各评价指标为1～3分；p<0.01，各评价指标为2～4分；p<0.001，各评价指标为3～5分；
就神经系统而言：p>0.05，各评价指标为0分；p<0.05，各评价指标为1～3分；p<0.01，各评价指标为2～4分；p<0.001，各评价指标为3～5分。
6.根据权利要求5所述的大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，其特征在于，因各评价指标的毒性表型的发生概率不同，各评价指标在同一分值范围内的得分不同。
7.根据权利要求1或5或6所述的大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，其特征在于，独立评价心血管和神经系统的毒性等级，评价方法为，
就心血管而言：将各评价指标的分值加和，0～2，毒性不明显；3～5，I级心血管毒性；6～8 II级心血管毒性；9～14，III级心血管毒性；15～26，IV级心血管毒性；当斑马鱼出现心律不齐或出血时，直接定义为IV级；
就神经系统而言：将各评价指标的分值加和，0，毒性不明显；2～3，I级神经毒性；4～8，II级神经毒性；9～13，III级神经毒性；14～21，IV级神经毒性；当出现脑变性时，直接定义为IV级。
8.根据权利要求1或5或6所述的大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，其特征在于，联合评价心血管和神经系统的毒性等级，评价方法为，
将心血管和神经系统的各评价指标的分值加和：总分0，心血管且神经系统毒性不明显；总分为5～8，I级神经及心血管毒性；总分为9～17，II级神经及心血管毒性；总分为18～27，III级神经及心血管毒性；总分为28～47，IV级神经及心血管毒性。
9.根据权利要求1所述的大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，其特征在于，所述大气颗粒物包括但不限于纳米粒子、有毒化合物、PM2.5、PM10中至少一种。
10.根据权利要求9所述的大气颗粒物对心血管及神经系统损伤的评价方法，其特征在于，所述有毒化合物包括但不限于醋酸铅、氯化甲基汞、苯并芘中的至少一种；所述纳米粒子包括但不限于纳米二氧化硅颗粒、SiNPs、PDA、PEG中的至少一种。
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