CN113030236A - 一种生物组织中脂质化合物的原位分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种生物组织中脂质化合物的原位分析方法，包括：将生物组织切片贴在透明基片上，在真空环境下干燥，然后对其进行扫描；提供质量浓度为0.5‑15mg/mL的黑磷烯溶液作为基质；将扫描后的生物组织切片置于基质喷涂仪中，将黑磷烯溶液喷涂在生物组织切片表面；将喷涂后的生物组织切片装载在靶架上，并进行原位的基质辅助激光解析电离质谱成像分析。该分析方法采用黑磷烯作为MALDI‑MSI的基质，其在小分子区域的干扰低，质谱成像的重现性好、信号强，能提高对生物组织中脂质化合物分析的准确度。

Description

一种生物组织中脂质化合物的原位分析方法
技术领域
本发明涉及生化分析技术领域，具体涉及一种生物组织中脂质化合物的原位分析方法。
背景技术
质谱成像技术(mass spectrometry imaging，MSI)是目前应用广泛的一种新型分子可视化技术，是将组织切片上化合物形成的离子或碎片离子，按质荷比的不同进行测定，再由成像软件将测得的质谱数据转化成相应像素点并重构出目标化合物在组织表面的空间分布图像。该技术被广泛地应用于生物分析的各个领域。其中，基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight，MALDI-TOF)等软电离技术的出现使得生物大分子可以被电离，进而使质谱在测定复杂的生物样品领域(特别是核酸、蛋白质等)得到了广泛的应用，并具有分析速度快、信噪比高、质量范围宽等优点。这些优势使得于基质辅助激光解析电离-质谱成像(MALDI-MSI)技术成为了生化领域不可或缺的分析手段。
脂质组学作为代谢组学的重要分支，其研究对象为生物体的所有脂质化合物，主要表征生物体受到扰动后脂质代谢的变化以及介导信号转导的变化。协调的脂质代谢是能量平衡、膜结构及其动态改变信号、转导、自噬等重要生命过程中不可或缺的环节，因此分析生物组织中多种脂质组分具有重要意义。
对于MALDI-MSI，最大的挑战来自于基质效应，即由于基质对样品的溶解而引起被测组分的移位现象，导致空间匹配错误等问题。一来，传统的MALDI基质(如常用的2,5-二羟基苯甲酸、芥子酸等有机基质)在低分子量范围内(m/z<700Da)会产生大量的碎片离子，严重干扰小分子物质的测定。二来，由于样品与基质的共混结晶不均匀，会导致信号重现性差，难以用于准确的分析。
因此，有必要提供一种能准确、高效地分析组织样品中脂质化合物的方法。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种生物组织中脂质化合物的原位分析方法，其利用二维材料黑磷烯作为MALDI-MSI技术的基质来检测生物组织中脂质化合物及质谱成像分析，黑磷烯基质在小分子区域的干扰低，信噪比高、信号重现性好，大大提高脂质化合物的分析效率和准确度。
具体地，本发明提供了一种生物组织中脂质化合物的原位分析方法，包括以下步骤：
提供生物组织切片，将所述生物组织切片融裱在透明基片上，在真空环境下干燥，去除所述生物组织中的水分，并使其贴紧所述透明基片，然后对所述生物组织切片进行扫描，以定位待成像的生物组织切片；
提供质量浓度为0.5-15mg/mL的黑磷烯溶液作为基质；将扫描后的所述生物组织切片置于基质喷涂仪中，将所述黑磷烯溶液喷涂在所述生物组织切片表面；
将喷涂后的生物组织切片装载在靶架上，并进行原位的基质辅助激光解析电离质谱成像(MALDI-MSI)分析。
其中，所述生物组织切片的厚度为2-20μm。优选为5-20μm。进一步优选为5-10μm。所述生物组织切片为离体的组织切片。生物组织切片可以是脑组织切片、肺组织切片、心脏组织切片等。
其中，所述真空环境下干燥的温度为15-25℃，所述干燥的时间为0.5-3h。
可选地，所述导电涂层的材质为氧化铟锡(ITO)、掺铝氧化锌(AZO)、掺氟二氧化锡(FTO)、掺磷二氧化锡(PTO)、氮化钛(TixNy)和氧化铱(IrOx)中的至少一种，但不限于此。所述生物组织切片与导电涂层接触。
可选地，所述基片为单面设置有ITO涂层的玻璃片。进一步地，所述透明基片的厚度为0.5-3mm。在本发明一实施方式中，所述基片的横向尺寸为75×25mm，厚度为1mm。
本发明中，对所述生物组织切片进行扫描可以采用扫描仪进行，也可以采用手机、相机等成像设备。扫描的结果用于后续作为MALDI-MSI的比对基础，更好地确认生物组织。
其中，所述黑磷烯溶液的溶剂为水、乙醇、甲醇、丙酮中的一种或多种。可选地，所述黑磷烯溶液的溶剂为体积比1:1的乙醇和水。
其中，所述黑磷烯溶液的喷涂方式为60-80个喷涂循环，每个循环包括1-3s的喷涂，15s的孵化和60-65s的氮气吹干。该喷涂方式可以保证在组织切片表面形成均匀、细密的黑磷烯膜。
可选地，所述喷涂过程的时间为80-110min。
其中，所述黑磷烯为黑磷纳米片或黑磷量子点。
其中，所述黑磷烯的纵向尺寸为0.5-100nm。可以为0.5-5nm(优选为0.8-2nm)，也可以为10-100nm。
可选地，所述黑磷烯的层数为1-12层。
其中，所述MALDI-MSI的质谱分析条件包括：采用正离子反射模式检测，质谱全扫描范围为m/z 50～1200Da，激光强度为55％，激光激发源为激光波长355nm的Nd:YAG固态激光器，MALDI-MSI的空间分辨率为20-200μm。进一步可选地，所述MALDI-MSI的空间分辨率为100μm。
可选地，所述激光激发源的输出功率为2kHz。
在本发明一实施方式中，所述靶架为布鲁克的MTP Slide Adapter II靶架。
本发明提供的生物组织中脂质化合物的原位分析方法中，生物组织样品的处理简单，在其表面喷涂二维层状材料黑磷烯后，再进行MALDI-MSI分析，其中，黑磷烯作为MALDI-MSI技术的基质，其具有全光谱范围的吸收，作为基质在小分子区域的干扰低，校准准确，能有效原位分析生物组织中多种脂质化合物，检测脂质化合物的信噪比高、信号重现性好，大大提高脂质化合物的分析效率和准确度，拓展了黑磷烯作为MALDI-MSI的基质的应用范围。所述分析方法在代谢组学和疾病预防诊断方面具有潜在的应用价值。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
图1为小鼠脑组织中的质谱分析数据图；
图2为小鼠脑组织中的质谱成像图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例1
一种生物组织中脂质化合物的原位分析方法，包括以下步骤：
1、解剖小鼠，取其脑组织，用液氮速冻后转移到-80℃下保存，放入在冷冻切片机内进行组织切片的制备，切片厚度：10μm。
将得到的小鼠脑组织切片融裱在单面包被有ITO的玻璃片上(横向尺寸为75×25mm，厚度为1mm)，在真空环境下干燥1h，以去除小鼠脑组织的水分，并使其贴紧玻璃片，然后在扫描仪上对该小鼠脑组织切片进行扫描。
2、提供喷涂用的基质溶液：
在充氮气的手套箱称取25mg的黑磷块体，将其碾磨并分散到25mL的N-甲基吡咯烷酮(NMP)，密封，得到1mg/mL的分散液；在1200W探针超声功率下超声3小时，然后紧接着300W功率下水浴超声10小时，整个超声过程都是通过冰浴来控制在277K以下完成的；然后在7000rpm转速下离心20分钟，取上层清液，得到分散在NMP中的黑磷纳米片溶液。该黑磷纳米片的横向尺寸在2.6nm左右、纵向尺寸在1nm。
将上述黑磷纳米片的NMP溶液在10000rpm下离心15min，分散到体积比1:1的乙醇和水构成的混合溶剂中，得到的浓缩溶液作为喷涂用基质。该基质溶液中黑磷纳米片的质量浓度约为10mg/mL。
3、将步骤1中扫描后的小鼠脑组织切片置于布鲁克的imagePrep自动基质喷涂仪中，并将步骤2中的5mL基质溶液装到自动基质喷涂仪中，将该基质溶液喷涂在小鼠脑组织切片表面，喷涂方法为70个喷涂循环，每个循环包括1s的喷涂，15s的孵化和60s的干燥，喷涂时间为88min。
4、将喷涂基质溶液后的小鼠脑组织切片装载在MALDI源适用靶架上(具体为布鲁克的MTP Slide Adapter II靶架)，并进行原位的基质辅助激光解析电离质谱成像(MALDI-MSI)分析，以获得多种脂质化合物的分析数据，并进行信号离子图像重构。其中，MALDI-MSI的质谱分析条件包括：采用正离子反射模式检测，质谱全扫描范围为m/z 50～1200Da，激光强度为55％，激光激发源为Nd:YAG固态激光器，其激光波长355nm，激光的输出功率为2kHz；MALDI-MSI的空间分辨率为100μm。
图1为小鼠脑组织中的质谱分析数据图，图2为小鼠脑组织中的质谱成像图。从图1可以看出不同脂质化合物在MALDI-MSI上的出峰，从图2可以看出不同脂质化合物在小鼠脑组织上的分布。
以上结果表明，本发明提供的分析方法中，采用黑磷作为MALDI-MSI检测脂质化合物的基质，可实现生物组织样品中脂质化合物的准确成像分析，背景干扰小。
实施例2
一种生物组织中脂质化合物的原位分析方法，包括以下步骤：
1、提供切片厚度为15μm的小鼠脑组织切片，并将融裱在单面包被有AZO涂层的玻璃片上，在真空环境下干燥2h，使小鼠脑组织切片融紧贴玻璃片，然后在扫描仪上对该小鼠脑组织切片进行扫描。
2、提供喷涂用的基质溶液：
在充氮气的手套箱中称取30mg的块体黑磷，将其研磨并分散到25mL的N-甲基吡咯烷酮中，密封，得到1.2mg/mL的第一分散液；取上述第一分散液4mL，加入36mL的N-甲基吡咯烷酮，另外加入400mg的氢氧化钠，搅拌均匀得到第二分散液；将上述第二分散液加入到高压反应釜中，在温度为120℃中加热反应14h，加热完毕、待体系冷却至室温后，对所得反应液在9000rpm的转速下离心10分钟，收集上清液；再对收集的上清液在12000rpm下进行高速离心20min，将所得固体产物分散到无水乙醇中，得到尺寸为4nm的黑磷量子点的无水乙醇溶液。该溶液可作为喷涂用基质。其中，该基质溶液中黑磷量子点的质量浓度约为12mg/mL。
3、将步骤1中扫描后的小鼠脑组织切片置于布鲁克的imagePrep自动基质喷涂仪中，并将步骤2中的基质溶液装到自动基质喷涂仪中，将该基质溶液喷涂在小鼠脑组织切片表面，喷涂方式为80个喷涂循环，每个循环包括2s的喷涂，15s的沉积和65s干燥；喷涂过程的总时间为110min。
4、将喷涂基质溶液后的小鼠脑组织切片装载在MALDI源适用靶架上(具体为布鲁克的MTP Slide Adapter II靶架)，并进行原位的MALDI-MSI分析。其中，MALDI-MSI的质谱分析条件包括：采用正离子反射模式检测，质谱全扫描范围为m/z 50～1200Da，激光强度为55％，激光激发源为Nd:YAG固态激光器，其激光波长355nm，激光的输出功率为2kHz；MALDI-MSI的空间分辨率为150μm。
需要说明的是，根据上述说明书的揭示和和阐述，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些等同修改和变更也应当在本发明的权利要求的保护范围之内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (10)

1.一种生物组织中脂质化合物的原位分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供生物组织切片，将所述生物组织切片贴在具有导电涂层的基片上，在真空环境下干燥，去除所述生物组织中的水分，并使其贴紧所述透明基片，然后对所述生物组织切片进行扫描，以定位待成像的生物组织切片；
提供质量浓度为0.5-15mg/mL的黑磷烯溶液作为基质；将扫描后的所述生物组织切片置于基质喷涂仪中，将所述黑磷烯溶液喷涂在所述生物组织切片表面；
将喷涂后的生物组织切片装载在靶架上，并进行原位的基质辅助激光解析电离质谱成像分析。
2.如权利要求1所述的原位分析方法，其特征在于，所述生物组织切片的厚度为2-20μm。
3.如权利要求1所述的原位分析方法，其特征在于，所述基片为单面设置有氧化铟锡、掺铝氧化锌、掺氟二氧化锡、掺磷二氧化锡、氮化钛和氧化铱(IrOx)中的一种的玻璃片。
4.如权利要求1所述的原位分析方法，其特征在于，所述黑磷烯溶液的喷涂方式为60-80个喷涂循环，每个循环包括1-3s的喷涂，15s的孵化和60-65s的氮气吹干。
5.如权利要求1所述的原位分析方法，其特征在于，所述喷涂的时间为80-110min。
6.如权利要求1所述的原位分析方法，其特征在于，所述黑磷烯溶液的溶剂为水、乙醇、甲醇和丙酮中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的原位分析方法，其特征在于，所述真空环境下干燥的温度为15-25℃，所述干燥的时间为0.5-3h。
8.如权利要求1所述的原位分析方法，其特征在于，所述黑磷烯为黑磷纳米片或黑磷量子点。
9.如权利要求8所述的原位分析方法，其特征在于，所述黑磷烯的层数为1-12层。
10.如权利要求1-9任一项所述的原位分析方法，其特征在于，所述基质辅助激光解析电离质谱成像的分析条件包括：采用正离子反射模式检测，质谱全扫描范围为m/z 50～1200Da，激光强度为55％，激光激发源为激光波长355nm的Nd:YAG固态激光器，成像的空间分辨率为20-200μm。
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