CN113008816A - 一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面,其包括:铝超表面芯片、生物试剂;所述铝超表面芯片由上下两层结构复合组成,下层是图案化聚碳酸酯基片201IPS,上层是铝膜,其中图案化聚碳酸酯基片上有镍模压印形成的周期性纳米柱阵列;所述周期性纳米柱阵列直径为250nm,周期为500nm,所述铝膜厚度为100‑200nm,优选的厚度为150nm,所述生物试剂包括3‑氨丙基三乙氧基硅烷APTES、戊二醛、捕获蛋白、待测蛋白,所述捕获蛋白包括:新型冠状病毒单抗F1208SARS‑CoV‑2IGg‑F1208,所述待测蛋白由上述捕获蛋白中的一种或几种组合组成,采用地壳中含量丰富的铝来取代传统金、银等贵金属制备超表面,实现铝基等离激元超表面在新型冠状病毒和肿瘤标志物检测中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及等离激元超表面和生物医学检测等技术领域,具体为一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面。
背景技术
目前,COVID-19大流行是由人与人之间的SARS-CoV-2病毒呼吸道感染引起的,通过快速和大规模的早期诊断检测,可以有效地减少感染并最终控制感染。当前的检测方法包括PCR核酸检测、血清学IgM/IgG抗体检测以及抗原检测等。基于PCR的核酸检测在早期感染诊断中非常敏感和准确,但一般需要病毒裂解、RNA提取、逆转录和扩增等多个漫长过程,容易造成样本污染。血清学IgM/IgG抗体检测虽然可以用于快检测,但被感染者产生抗体的时间存在滞后性,这显然不利于早期诊断的普及。
发明内容
(一)解决的技术问题
本发明提供一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面,实现铝基等离激元超表面在新型冠状病毒和肿瘤标志物检测中的应用。
(二)技术方案
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面,其包括:铝超表面芯片、生物试剂;所述铝超表面芯片由上下两层结构复合组成,下层是图案化聚碳酸酯基片(IPS),上层是铝膜,其中图案化聚碳酸酯基片上有镍模压印形成的周期性纳米柱阵列;所述周期性纳米柱阵列直径为250nm,周期为500nm,所述铝膜厚度为100-200nm,优选的厚度为150nm,所述生物试剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、戊二醛、捕获蛋白、待测蛋白,所述捕获蛋白包括:新型冠状病毒单抗F1208(SARS-CoV-2IGg-F1208)、新型冠状病毒单抗F1209(SARS-CoV-2IGg-F1209)、抗牛血清蛋白(anti-BSA)、抗癌胚抗原(anti-CEA)、抗甲胎蛋白(anti-AFP)、抗糖类抗原19-9(anti-CA199)、抗β2微球蛋白(anti-β2-MG)、抗肿瘤坏死因子(anti-TNF)、抗前列腺特异性抗原(anti-PSA)、抗人绒毛膜促性腺激素(anti-HCG)、抗甲胎蛋白(anti-AFP)、抗神经元特异烯醇化酶(anti-NSF)、抗糖类抗原242(anti-CA242)、抗糖类抗原125(anti-CA125)、抗糖类抗原50(anti-CA50)、抗糖类抗原153(anti-CA153)、抗铁蛋白(anti-FER),所述待测蛋白包括:新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、新型冠状病毒RBD蛋白、牛血清蛋白(BSA)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、糖类抗原19-9(CA199)、β2微球蛋白(β2-MG)、肿瘤坏死因子(TNF)、前列腺特异性抗原(PSA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(AFP)、神经元特异烯醇化酶(NSF)、糖类抗原242(CA242)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原50(CA50)、糖类抗原153(CA153)、铁蛋白(FER),所述待测蛋白由上述捕获蛋白中的一种或几种组合组成。
一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面的制作方法,包括以下步骤:
步骤一:纳米压印,在150℃的温度和40bar的压力下,采用热纳米压印技术对IPS进行处理,形成周期纳米柱阵列;
步骤二:等离子刻蚀,采用0-425s的刻蚀时间,将步骤一中的周期性纳米柱阵列采用氧等离子刻蚀,将纳米柱阵列刻蚀为纳米凸起;
步骤三:金属层沉积,采用电子束蒸发或磁控溅射在步骤二形成的所述纳米凸起上蒸镀50-200nm铝膜;
步骤四:表面钝化,在氧等离子刻蚀机处理20-30分钟,使铝表面形成一层致密三氧化二铝氧化层,提升器件稳定性。
一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面的检测方法,包括以下步骤:
步骤一:形成氨基自组装层,配制10%的3-氨丙基三乙氧基硅溶液,将所述铝超表面置于室温27℃和潮湿环境下,在3-氨丙基三乙氧基硅溶液中孵育30-60分钟,从而在铝超表面表面上形成氨基自组装层,并用去离子水清洗和氮气干燥处理;
步骤二:活化氨基,配制5%的戊二醛溶液,然后将所述铝超表面置于室温27℃和潮湿环境下,放在5%的戊二醛溶液孵育30-60分钟,将氨基活化;
步骤三:固定捕获蛋白,用10-100ug/mL捕获蛋白溶液孵育30-60分钟,使捕获蛋白与表面的氨基结合,从而固定捕获蛋白;
步骤四:检测待测蛋白,将所述铝超表面在待测蛋白溶液中孵育30-60分钟,采用光谱仪检测计算谱线偏移量。
优选的,当所述待测蛋白为新型冠状病毒RBD蛋白时,所述铝超表面分别测试了浓度为100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL待测溶液,分别产生6.42nm、5.81nm、4.20nm、2.56nm、0.58nm偏移量。
(三)有益效果
与现有技术相比,本发明提供了一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面,具备以下有益效果:
本发明提供一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面,采用地壳中含量丰富的铝来取代传统金、银等贵金属制备超表面,实现铝基等离激元超表面在新型冠状病毒和肿瘤标志物检测中的应用。本发明为可以弥补上述两种方法学的缺陷,同时具有检测速度快和适用于早期新冠病毒检测的优势。
附图说明
图1为本发明铝超表面加工工艺示意图;
图2为本发明铝超表面不同刻蚀时间扫描电镜图,不同的刻蚀时间分别为0s、300s、425s;
图3为本发明铝超表面在不同刻蚀时间条件下的体灵敏度传感曲线;
图4为本发明的铝超表面在最优刻蚀时间下与金超表面的体灵敏度对比图;
图5为本发明面灵敏度测试实验示意图;
图6为本发明铝超表面在最优刻蚀时间下与金超表面的表面灵敏度对比图;
图7为本发明生物传感示意图;
图8为本发明铝超表面与金超表面的希尔函数拟合曲线,以及检测极限结果对比;
图9为本发明铝超表面检测不同浓度新型冠状病毒RBD蛋白偏移量柱状图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明揭示了一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面,实现了实现铝基等离激元超表面在新型冠状病毒和肿瘤标志物检测中的应用。
请参阅图1,使用镍模板1热压形成图案化聚碳酸酯基片201,蒸镀或沉积共形上铝膜202,图案化聚碳酸酯基片201和铝膜202自下而上复合形成铝超表面芯片,所述图案化聚碳酸酯基片201上有压印形成的周期性纳米柱阵列;所述阵列周期为500nm,柱子直径250nm。所述铝膜厚度为100-200nm,优选的,厚度为150nm。
进一步的,所述周期性纳米柱阵列直径为250nm,周期为500nm。
进一步的,一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面还包括生物试剂:3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、戊二醛、聚丙烯胺3、聚苯乙烯磺酸水溶液4,捕获蛋白、待测蛋白,所述聚丙烯胺英文简称为PAH,所述聚苯乙烯磺酸水溶液英文简称为PSS,所述捕获蛋白包括:新型冠状病毒单抗F1208(SARS-CoV-2IGg-F1208)、新型冠状病毒单抗F1209(SARS-CoV-2IGg-F1209)、抗牛血清蛋白(anti-BSA)、抗癌胚抗原(anti-CEA)、抗甲胎蛋白(anti-AFP)、抗糖类抗原19-9(anti-CA199)、抗β2微球蛋白(anti-β2-MG)、抗肿瘤坏死因子(anti-TNF)、抗前列腺特异性抗原(anti-PSA)、抗人绒毛膜促性腺激素(anti-HCG)、抗甲胎蛋白(anti-AFP)、抗神经元特异烯醇化酶(anti-NSF)、抗糖类抗原242(anti-CA242)、抗糖类抗原125(anti-CA125)、抗糖类抗原50(anti-CA50)、抗糖类抗原153(anti-CA153)、抗铁蛋白(anti-FER),所述待测蛋白包括:新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、新型冠状病毒RBD蛋白、牛血清蛋白(BSA)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、糖类抗原19-9(CA199)、β2微球蛋白(β2-MG)、肿瘤坏死因子(TNF)、前列腺特异性抗原(PSA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(AFP)、神经元特异烯醇化酶(NSF)、糖类抗原242(CA242)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原50(CA50)、糖类抗原153(CA153)、铁蛋白(FER)。
进一步的,所述待测蛋白由上述捕获蛋白中的一种或几种组合组成。
一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面的制作方法,包括以下步骤:
步骤一:纳米压印,在150℃的温度和40bar的压力下,采用热纳米压印技术对IPS进行处理,形成周期纳米柱阵列;
步骤二:等离子刻蚀,采用0-425s的刻蚀时间,将步骤一中的周期性纳米柱阵列采用氧等离子刻蚀,将纳米柱阵列刻蚀为纳米凸起;
步骤三:金属层沉积,采用电子束蒸发或磁控溅射在步骤二形成的所述纳米凸起上蒸镀50-200nm铝膜;
步骤四:表面钝化,在氧等离子刻蚀机处理20-30分钟,使铝表面形成一层致密三氧化二铝氧化层,提升器件稳定性。
请参阅图2,分别为无刻蚀、300s刻蚀和425s刻蚀下的铝超表面扫描电镜图,随着刻蚀时间的增加,纳米凸起的直径会变小,不同的刻蚀时间呈现出不同的纳米结构,采用调整刻蚀时间的方式进行结构参数优化设计。
具体实施例一
请参阅图3,分别在去离子水、无水乙醇、异丙醇、乙二醇溶液中测量铝超表面反射谱。随着溶液折射率的增加,共振波长呈线性增加。折射率变化相同时,刻蚀300s铝超表面共振波长偏移量最大,其次为刻蚀425s,无刻蚀超表面表现最差;无刻蚀铝超表面灵敏度为480nm/RIU、刻蚀300s铝超表面灵敏度为553nm/RIU、刻蚀425s铝超表面灵敏度为446nm/RIU。
请参阅图4,在同样最优刻蚀条件下的金超表面的体灵敏度只有424nm/RIU,铝超表面体灵敏度性能优于金。
请参阅图5,展示了本发明面灵敏度测试实验示意图。通过使用两种分别带有正负电荷的聚电解质(PAH和PSS),以自组装的方式形成正负电荷层,其中PAH用于使超表面附着正电荷,PSS用于使超表面附着负电荷。在测量过程中,铝超表面在乙醇中洗涤20分钟,并用氮气干燥。随后,将样品浸没在1.0mmol中的PAH溶液5分钟,形成带正电荷的层。然后用去离子水彻底清洗样品,除去多余的PAH。然后将样品浸没在1.0mmol PSS溶液5分钟,通过静电相互作用形成聚电解质双层。多层聚电解质通过这种逐层方法交替组装,在吸附下一层之前用去离子水冲洗。电解质每增加一层,记录样品的反射光谱。
请参阅图6为本发明与金超表面的面灵敏度的拟合曲线对比。随着电子层数的不断增加,传感芯片的波谷偏移量先不断增加,后趋向稳定;对于金超表面,经过10层环芳烃/聚苯乙烯双层膜后,波长偏移量变得稳定,饱和波长偏移量为14.46纳米。相比之下,铝超表面的波长偏移在15层后趋于稳定,饱和波长偏移量为49.69nm。这表明铝超表面有一个更大的近场感应区。此外,前几层中的波长偏移与PAH/PSS层数线性相关。在线性范围内,金超表面上涂覆的每个双层导致谐振点光谱偏移约为1.9纳米;而组装在铝超表面上的每个双层导致大约4.1纳米的光谱偏移,这比金超表面大2.16倍,说明铝超表面具有更高的表面传感能力。
具体实施例二
请参阅图7,一种高灵敏低成本铝超表面及其生物传感方法,包括以下步骤:
步骤一:形成氨基自组装层,配制10%的3-氨丙基三乙氧基硅溶液,将所述铝超表面在室温27℃和潮湿环境下,在3-氨丙基三乙氧基硅溶液中孵育30-60分钟,从而在铝超表面表面上形成氨基自组装层,并用去离子水清洗和氮气干燥处理;
步骤二:活化氨基,配制5%的戊二醛溶液,然后将所述铝超表面在室温27℃和潮湿环境下,放在5%的戊二醛溶液孵育30-60分钟,将氨基活化;
步骤三:固定捕获蛋白,用10-100ug/mL捕获蛋白溶液孵育30-60分钟,使捕获蛋白与表面的氨基结合,从而固定捕获蛋白;
步骤四:加入待测蛋白,将所述铝超表面在待测蛋白溶液中孵育30-60分钟,采用光谱仪检测计算谱线偏移量。
请参阅图8本发明和传感芯片谐振点偏移量与抗BSA浓度拟合曲线。根据最佳拟合曲线,得到铝超面的希尔方程的Δλmax=6.43±0.53nm,k=0.14±0.02ng/mL。与金超表面相比,铝超表面的希尔曲线在较低的k值下表现出更陡的响应(约为金超表面的十分之一),这表明铝超表面有更高的生物传感灵敏度。另一方面,铝超表面的饱和波长位移Δλmax是金超表面的2.38倍。这进一步表明铝超表面具有更好的表面生物分子敏感性。此外,铝超表面显示出1pg/ml的抗牛血清白蛋白检测极限,远远小于金超表面(约为1ng/ml)。这种低检测极限优于许多其他等离子体生物传感器。因此,廉价的铝超表面显示了基于免疫特异性结合的生物分子检测的高性能,这对于未来的医学应用是有希望的。
具体实施例三
请参阅图9,具体为铝超表面检测不同浓度新型冠状病毒RBD蛋白偏移量柱状图。本发明采用新型冠状病毒单抗F1208(SARS-CoV-2IGg-F1208)作为捕获蛋白进行检测新型冠状病毒RBD蛋白,进行了铝超表面生物传感方法的进一步验证,结果标明在100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL待测溶液中产生6.42nm、5.81nm、4.20nm、2.56nm、0.58nm偏移量。
需要说明的是,在本文中,诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面,其特征在于,包括铝超表面芯片、生物试剂,所述铝超表面芯片由上下两层结构复合组成,下层是图案化聚碳酸酯基片(201),上层是铝膜(202),其中图案化聚碳酸酯基片(201)上有镍模压印形成的周期性纳米柱阵列,所述周期性纳米柱阵列直径为250nm,周期为500nm;所述铝膜(202)厚度为100-200nm,所述生物试剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷、戊二醛、捕获蛋白、待测蛋白,所述捕获蛋白包括:新型冠状病毒单抗F1208、新型冠状病毒单抗F1209、抗牛血清蛋白、抗癌胚抗原、抗甲胎蛋白、抗糖类抗原19-9、抗β2微球蛋白、抗肿瘤坏死因子、抗前列腺特异性抗原、抗人绒毛膜促性腺激素、抗甲胎蛋白、抗神经元特异烯醇化酶、抗糖类抗原242、抗糖类抗原125、抗糖类抗原50、抗糖类抗原153、抗铁蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面,其特征在于,所述铝膜(202)的优选厚度为150nm。
3.根据权利要求1所述的一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面,所述待测蛋白包括:新型冠状病毒、新型冠状病毒RBD蛋白、牛血清蛋白、癌胚抗原、甲胎蛋白、糖类抗原19-9、β2微球蛋白、肿瘤坏死因子、前列腺特异性抗原、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、神经元特异烯醇化酶、糖类抗原242、糖类抗原125、糖类抗原50、糖类抗原153、铁蛋白,所述待测蛋白由上述捕获蛋白中的一种或几种组合组成。
4.根据权利要求1、2、3所述的一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面,其特征在于,包括其制作方法,制作方法步骤如下:
步骤一:纳米压印,在150℃的温度和40bar的压力下,采用热纳米压印技术对IPS进行处理,形成周期纳米柱阵列;
步骤二:等离子刻蚀,采用0-425s的刻蚀时间,将步骤一中的周期性纳米柱阵列采用氧等离子刻蚀,将纳米柱阵列刻蚀为纳米凸起;
步骤三:金属层沉积,采用电子束蒸发或磁控溅射在步骤二形成的所述纳米凸起上蒸镀50-200nm铝膜(202);
步骤四:表面钝化,在氧等离子刻蚀机处理20-30分钟,使铝表面形成一层致密三氧化二铝氧化层,提升器件稳定性。
5.根据权利要求1、2、3所述的一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面,其特征在于,包括其检测方法,检测步骤如下:
步骤一:形成氨基自组装层,配制10%的3-氨丙基三乙氧基硅溶液,将所述铝超表面置于室温27℃和潮湿环境下,在3-氨丙基三乙氧基硅溶液中孵育30-60分钟,从而在铝超表面表面上形成氨基自组装层,并用去离子水清洗和氮气干燥处理;
步骤二:活化氨基,配制5%的戊二醛溶液,然后将所述铝超表面置于室温27℃和潮湿环境下,放在5%的戊二醛溶液孵育30-60分钟,将氨基活化;
步骤三:固定捕获蛋白,用10-100ug/mL捕获蛋白溶液孵育30-60分钟,使捕获蛋白与表面的氨基结合,从而固定捕获蛋白;
步骤四:检测待测蛋白,将所述铝超表面在待测蛋白溶液中孵育30-60分钟,采用光谱仪检测计算谱线偏移量。
6.根据权利要求5所述的一种用于新型冠状病毒和肿瘤标志物检测的铝超表面,其特征在于,所述待测蛋白为新型冠状病毒RBD蛋白时,所述铝超表面分别测试了浓度为100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL待测溶液,分别产生6.42nm、5.81nm、4.20nm、2.56nm、0.58nm偏移量。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210622 |
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