CN112997728B - 多壁碳纳米管在调控凤丹高温胁迫中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了多壁碳纳米管在调控凤丹高温胁迫中的应用，所采用的主要技术方案如下：在高温来临之前，对凤丹植株浇灌多壁碳纳米管溶液，多壁碳纳米管溶液为10～200mg·L‑1，浇灌频率为每天浇一次，连续浇3次，每次必须使根际周围土壤湿润。本发明方法操作简便、周期短、见效快和易于推广利用等优点，可在凤丹抗高温栽培中规模化应用，对凤丹在我国长江中下游及以南地区栽培具有积极的推动作用。

Description

多壁碳纳米管在调控凤丹高温胁迫中的应用
技术领域
本发明涉及多壁碳纳米管在调控凤丹高温胁迫中的应用，属于凤丹栽培技术领域。
背景技术
凤丹（Paeonia ostii）属于芍药科芍药属的多年生木本植物，具有很高观赏价值、药用价值和油用价值。凤丹作为国家卫生部批准的油用牡丹资源，因其易成活、结籽量大、富含不饱和脂肪酸和a-亚麻酸等优点而在全国大范围推广种植。我国长江中下游及以南地区夏季气温高，持续时间长，较高的夏季高温严重影响了凤丹在本地区的生长发育，叶片过早出现黄化，严重时甚至导致死亡。而如何缓解高温胁迫对凤丹的伤害已成为目前亟待解决的问题。
在凤丹的高温胁迫研究方面，骞光耀等对植株采用了40℃高温胁迫处理，叶片的细胞膜相对透性、脯氨酸含量、可溶性糖含量、丙二醛含量均显著高于对照，而净光合速率、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶活性显著低于对照（骞光耀, 孔祥生, 张淑玲. 3个牡丹品种对高温胁迫的生理响应. 江苏农业科学, 2017, 45(12): 103-105）。采用水杨酸、氯化钙和脱落酸进行外源处理，均能诱导凤丹幼苗的耐热性（吴莎. 外源物质对牡丹幼苗耐热性的诱导. 硕士学位论文, 中南林业科技大学, 2018）。此外，任增斌等发现适宜浓度的外源表油菜素内酯处理可增强凤丹的耐热能力，以1.0mg/L浓度处理效果最佳（任增斌, 陈法志, 舒常庆, 李秀丽, 刘克华, 戢小梅. 外源表油菜素内酯对牡丹耐热性的影响. 江汉大学学报（自然科学版）, 2018, 16(5): 446-453）。
碳纳米管是一种新型纳米材料，根据石墨烯的片层数，碳纳米管可分为单壁碳纳米管和多壁碳纳米管。由于力学性能、导热性能、导电性能以及化学和电化学性能等多方面的特性，碳纳米管被广泛应用于新能源、新材料、生物传感器等领域。在环境胁迫方面，前期研究发现多壁碳纳米管可以缓解大麦的盐胁迫伤害（Karami Afshin, Sepehri Ali.Beneficial role of MWCNTs and SNP on growth, physiological and photosynthesisperformance of barley under NaCl stress. Journal of Soil Science and PlantNutrition, 2018, 18: 752-771），而加重水分胁迫对西葫芦的伤害（Hatami Mehrnaz.Toxicity assessment of multi-walled carbon nanotubes on Cucurbita pepo L.under well-watered and water-stressed conditions. Ecotoxicology andEnvironmental Safety, 2017, 142: 274-283）。而能否将多壁碳纳米管应用于缓解植物的高温胁迫伤害尚未知晓。
发明内容
发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了多壁碳纳米管在调控凤丹高温胁迫中的应用，该方法操作简便，效果明显，可在凤丹抗高温栽培中规模化应用。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
在高温来临之前，对凤丹植株浇灌多壁碳纳米管溶液。
所述多壁碳纳米管溶液为10～200mg·L-1。
所述浇灌频率为每天浇一次，连续浇3次。
所述浇灌方法为浇灌溶液必须使根际周围土壤湿润。
技术效果：相对于现有技术，本发明方法具有以下优势：
该方法操作简便、周期短、见效快和易于推广利用等优点，可在凤丹抗高温栽培中规模化应用，对凤丹在我国长江中下游及以南地区栽培具有积极的推动作用。
附图说明
图1是200mg·L-1多壁碳纳米管溶液处理下凤丹植株表型，图左为适温处理对照（浇水，20/15℃处理），图中为高温处理对照（浇水，40/35℃处理），图右为多壁碳纳米管溶液处理（浇多壁碳纳米管溶液，40/35℃处理）。
图2是200mg·L-1多壁碳纳米管溶液处理下凤丹中ROS积累水平观察。
图3是200mg·L-1多壁碳纳米管溶液处理下凤丹叶片SPAD值。
图4是200mg·L-1多壁碳纳米管溶液处理下凤丹叶片相对含水量。
图5是200mg·L-1多壁碳纳米管溶液处理下凤丹叶片相对电导率。
图6是200mg·L-1多壁碳纳米管溶液处理下凤丹叶片游离脯氨酸含量。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
以盆栽（园土、泥炭和珍珠岩，体积为1：1：1）的三年生凤丹为材料开展本研究。
多壁碳纳米管溶液的配制：本发明所使用的多壁碳纳米管溶液购于江苏先丰纳米材料科技有限公司，外径为4～6nm，长度为0.5～2μm，纯度＞98%，在使用时将多壁碳纳米管溶液采用蒸馏水稀释成200mg·L-1，所有溶液现配现用。
处理时间：在6月份开展本实验，将制备的多壁碳纳米管溶液在晴天的傍晚进行浇灌，以花盆底孔溶液流出为宜，每个处理设置3个重复，连续浇灌3天，以蒸馏水为对照。处理结束后随即进入光照培养箱，将浇灌蒸馏水的植株分为适温处理对照（20/15℃处理）和高温处理对照（40/35℃处理），而将浇灌多壁碳纳米管溶液的植株直接进行高温处理（40/35℃处理），湿度均设置为60%。在处理15天后观察其生长状态，并取植株叶片用于胁迫相关生理指标测定。
ROS积累水平观察：
（1）H2O2积累水平：采用二氨基联苯胺（DAB）染色法观察H2O2的积累量。使用50 mM的Tris-acetate缓冲液来配制浓度为0.1mg/mL、pH为5.0的DAB染色液。用染色液在黑暗中充分浸泡叶片24h后，取出叶片放入95%（v/v）酒精中进行沸水浴，在15 min后进行拍照。
（2）O2 ·-积累水平：采用荧光探针法观察O2 ·-积累量，具体操作参照活体细胞氧化应激ROS原位染色试剂盒（上海哈灵公司）说明书并稍作修改，具体步骤如下：①滴100μL清理液于载玻片上，捏紧2片不锈钢双面剃须刀片快速切割滤纸上的新鲜叶片，避开主叶脉；②用细头毛笔沾取切好的样品放于载玻片清理液中，并调整好位置；③叶片样品全部放好后将载玻片上清理液尽量吸取干净，然后加入10μL荧光染色剂二氢溴化乙啶（DHE），37℃孵育20min；④在荧光显微镜（Axio Imager D2，ZEISS，德国）下观察并且拍照。
SPAD值测定：采用叶绿素仪（SPAD-502，日本Koinca Mi-nolia Sensing公司）测定叶片的SPAD值。
叶片相对含水量测定：取适量新鲜叶片称重并记为鲜重（FW），而后将其在烘箱（9423A，上海精宏实验设备有限公司）中105℃处理5min，再在65℃处理2h以上，将烘干恒重的样品称量并记为干重（DW），并按下列公式计算叶片相对含水量：叶片相对含水量（%）=（FW-DW）/FW×100%。
叶片相对电导率测定：称取0.1g用直径1cm打孔器获得的叶片圆片，放入含有适量去离子水的注射器中，堵住注射器前端抽真空直至叶片沉入水下。然后一起倒入玻璃试管中，加去离子水至总体积达为20mL。室温静置4h，摇匀后用电导率仪（DDS-307A，上海雷磁仪器有限公司）测定溶液电导率C1。接下来将试管封口，沸水浴30min，等温度冷却至室温后测定此时溶液电导率为C2。每个处理按下列公式计算叶片相对电导率：相对电导率（%）=C1/C2×100%。
叶片游离脯氨酸含量测定：采用脯氨酸（Pro）试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）进行测定，具体步骤如下：（1）样品制备：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；之后置 90℃振荡提取 10min；10000g，25℃离心 10min， 取上清，冷却后待测。（2）测定：①取 0.5mL 样本+0.5mL试剂一+0.5mL试剂二于有盖试管中，置沸水浴中保温30min（盖紧，防止水分散失），每10min振荡一次。②待冷却后，在试管中加入 1mL 试剂三，振荡 30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.8-1mL上层溶液于1mL玻璃比色皿中，于520nm波长处比色，记录吸光值 A。（3）计算公式：Pro 含量(µg/g 鲜重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷0.1。
测定结果：多壁碳纳米管溶液调控凤丹植株高温胁迫的表型如图1所示，适温处理的植株生长健壮、叶片墨绿色，高温处理的植株生长受到抑制、叶片黄化并下垂，而多壁碳纳米管溶液处理的植株生长状态明显好于高温处理的植株，叶片只有少部分出现黄化现象。H2O2和O2 ·-积累水平呈现高温处理﹥多壁碳纳米管溶液处理﹥适温处理。SPAD值和叶片相对含水量表现为适温处理﹥多壁碳纳米管溶液处理﹥高温处理，并且与高温处理相比，多壁碳纳米管溶液处理的SPAD值和叶片相对含水量分别提高了117.27%和142.23%。而叶片相对电导率和叶片游离脯氨酸含量则表现为高温处理﹥多壁碳纳米管溶液处理﹥适温处理，并且与高温处理相比，多壁碳纳米管溶液处理的叶片相对电导率和叶片游离脯氨酸含量分别降低了47.10%和49.25%。
实施例2
与实施例1基本相同，不同之处仅在于，多壁碳纳米管溶液的浓度为10mg·L-1，按照实施例1方法进行处理和测定，结果显示，多壁碳纳米管溶液处理的植株生长状态同样好于高温处理的植株。H2O2和O2 ·-积累水平同样呈现高温处理﹥多壁碳纳米管溶液处理﹥适温处理。SPAD值和叶片相对含水量表现为适温处理﹥多壁碳纳米管溶液处理﹥高温处理，并且与高温处理相比，多壁碳纳米管溶液处理的SPAD值和叶片相对含水量分别提高了13.18%和36.87%。而叶片相对电导率和叶片游离脯氨酸含量则表现为高温处理﹥多壁碳纳米管溶液处理﹥适温处理，并且与高温处理相比，多壁碳纳米管溶液处理的叶片相对电导率和叶片游离脯氨酸含量分别降低了7.55%和2.99%。
尽管本发明已通过上述实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应该被认为是本发明的限制，在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (1)

1.多壁碳纳米管在调控凤丹高温胁迫中的应用，其特征在于，在高温来临之前，对凤丹植株浇灌多壁碳纳米管溶液，其中将多壁碳纳米管溶液采用蒸馏水稀释成10～200mg·L-1，浇灌频率为每天浇一次，连续浇灌3次，浇灌溶液必须使根际周围土壤湿润。
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