CN112996500A - 用于调节elovl2的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了能够增加本文描述的表观遗传标志物的表达水平的治疗剂。本文还描述了减少或减缓衰老表型的治疗剂。

Description

用于调节ELOVL2的组合物和方法

交叉引用

本申请要求2018年6月15日提交的美国临时申请第62/685,768号的权益，该申请通过引用并入本文。

本公开内容的背景

衰老的速度和进程因人而异，并进一步受到环境因素、生活方式选择和/或体能(physical fitness)的影响。在一些情况下，研究已表明表观基因组的状态(例如基因组内的突变和/或甲基化)与年龄相关。因此，DNA甲基化被用于例如基于环境因素、生活方式选择和/或体能来确定年龄或衰老速度的变化。

本公开内容的概述

本文提供了能够增加本文描述的表观遗传标志物的表达水平的治疗剂。本文还描述了减少或减缓衰老表型的治疗剂。

在某些实施方案中，本文公开了一种治疗有相应需要的受试者的方法，所述方法包括：向受试者施用组合物，所述组合物包含上调ELOVL脂肪酸延长酶2(ELOVL2)表达的活性剂和药学上可接受的载体(carrier)。

在一些实施方案中，活性剂包括载体(vector)，所述载体包含编码ELOVL2或其功能活性片段的多核苷酸。

在一些实施方案中，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的多肽。

在一些实施方案中，载体包括病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体包括基于腺相关病毒(AAV)的载体。在一些实施方案中，基于AAV的载体包括血清型1的基于AAV的载体(AAV1)、血清型2的基于AAV的载体(AAV2)、血清型3的基于AAV的载体(AAV3)、血清型4的基于AAV的载体(AAV4)、血清型5的基于AAV的载体(AAV5)、血清型6的基于AAV的载体(AAV6)、血清型7的基于AAV的载体(AAV7)、血清型8的基于AAV的载体(AAV8)、血清型9的基于AAV的载体(AAV9)或基于人源化的AAV的载体。在一些实施方案中，病毒载体包括基于腺病毒的载体、基于甲病毒(alphavirus)的载体、基于疱疹病毒的载体、基于逆转录病毒的载体、基于慢病毒的载体或基于痘苗病毒(vaccinia virus)的载体。

在一些实施方案中，载体包含细胞或组织特异性启动子。在一些实施方案中，细胞或组织特异性启动子是对感兴趣的细胞类型特异性的内源启动子。在一些实施方案中，细胞或组织特异性启动子是对感兴趣的细胞类型特异性的外源启动子。

在一些实施方案中，载体包含微生物启动子。在一些实施方案中，微生物启动子包括SV40或巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子。

在一些实施方案中，载体包含增强子、反向末端重复序列(ITR)、衣壳、多腺苷酸化信号、信号序列或其组合。

在一些实施方案中，载体包含选择标记(selectable marker)。在一些实施方案中，选择标记包括编码荧光蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、超折叠型GFP(Superfolder GFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)、DsRed荧光蛋白(DsRed2FP)、mTurquoise、mVenus、Emerald、Azami Green、mWasabi、TagFGP、TurboFGP、AcGFP、ZsGreen、T-Sapphire、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、Azurite、mTagBFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl、Midori-Ishi Cyan、TagCFP、mTFPl、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、Topaz、MCitrine、YPet、TagYFP、PhiYFP、ZsYellowl、mBanana、KusabiraOrange、Kusabira Orange2、mOrange、dTomato、TagRFP、TagRFP-T、DsRed、DsRed-Express(T1)、mTangerine、mRuby、mApple、mStrawberry、AsRed2、mRFPl、JRed、mCherry、HcRedl、mRaspberry、dKeima-Tandem、mPlum或AQ143。

在一些实施方案中，载体包含编码延长因子(elongation factor)1-α(EFlα)的多核苷酸。

在一些实施方案中，载体包含编码Klarsicht、ANC-1、Syne同源(KASH)结构域的多核苷酸。

在一些实施方案中，活性剂抑制染色质域-解旋酶-DNA结合蛋白4(chromodomain-helicase-DNA-binding protein 4；CHD4)的激活。

在一些实施方案中，组合物被全身施用。在一些实施方案中，组合物作为局部注射剂(local injection)施用。在一些实施方案中，组合物被配制用于胃肠外施用。在一些实施方案中，组合物被配制用于口服或鼻内施用。

在一些实施方案中，ELOVL2表达水平的降低与具有少于22个碳链的多于一种脂肪酸的积累的增加相关。在一些实施方案中，多于一种脂肪酸包括饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或其组合。

在一些实施方案中，ELOVL2表达的升高减少或减缓衰老表型。在一些实施方案中，衰老表型包括脱发、骨密度降低、耐力降低、肌力降低或神经退化(neurodegeneration)。在一些实施方案中，ELOVL2表达的升高治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)。

在一些实施方案中，受试者是人类。

在某些实施方案中，本文公开了一种减少或减缓有相应需要的受试者中的衰老表型的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含减少或减缓衰老表型的治疗剂。

在一些实施方案中，治疗剂包括C₁₈-C₂₈多不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，治疗剂包括C₂₀-C₂₂多不饱和脂肪酸。

在一些实施方案中，治疗剂包括亚甲基中断的多烯(methylene-interruptedpolyene)。在一些实施方案中，亚甲基中断的多烯包括多不饱和ω-3脂肪酸、多不饱和ω-6脂肪酸或多不饱和ω-9脂肪酸。在一些实施方案中，多不饱和ω-3脂肪酸包括α-亚麻酸(ALA)(全顺式-9,12,15-十八碳三烯酸)、硬脂四烯酸(stearidonic acid)(SDA)(全顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸)、二十碳三烯酸(ETE)(全顺式-11,14,17-二十碳三烯酸)、二十碳四烯酸(ETA)(全顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸)、二十碳五烯酸(EPA，Timnodonicacid)(全顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)、二十一碳五烯酸(HPA)(全顺式-6,9,12,15,18-二十一碳五烯酸)、二十二碳五烯酸(DPA，鰶鱼酸(Clupanodonic acid))(全顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸)、二十二碳六烯酸(DHA,Cervonic acid)(全顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸)、二十四碳五烯酸(全顺式-9,12,15,18,21-二十四碳五烯酸)或二十四碳六烯酸(鲱酸(Nisinic acid))(全顺式-6,9,12,15,18,21-二十四碳六烯酸)。在一些实施方案中，多不饱和ω-6脂肪酸包括亚油酸(全顺式-9,12-十八碳二烯酸)、γ-亚麻酸(GLA)(全顺式-6,9,12-十八碳三烯酸)、二十碳二烯酸(全顺式-11,14-二十碳二烯酸)、二高-γ-亚麻酸(DGLA)(全顺式-8,11,14-二十碳三烯酸)、花生四烯酸(AA)(全顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸)、二十二碳二烯酸(全顺式-13,16-二十二碳二烯酸)、肾上腺酸(全顺式-7,10,13,16-二十二碳四烯酸)、二十二碳五烯酸(Osbond acid)(全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸)、二十四碳四烯酸(全顺式-9,12,15,18-二十四碳四烯酸)或二十四碳五烯酸(全顺式-6,9,12,15,18-二十四碳五烯酸)。在一些实施方案中，多不饱和ω-9脂肪酸包括米德酸(mead acid)(全顺式-5,8,11-二十碳三烯酸)。

在一些实施方案中，治疗剂包括共轭脂肪酸。在一些实施方案中，共轭脂肪酸包括瘤胃酸(9Z,11E-十八碳-9,11-二烯酸或10E,12Z-十八碳-10,12-二烯酸)、α-金盏酸(calendic acid)(8E,10E,12Z-十八碳三烯酸)、β-金盏酸(8E,10E,12E-十八碳三烯酸)、兰花酸(jacaric acid)(8Z,10E,12Z-十八碳三烯酸)、α-桐酸(9Z,11E,13E-十八碳-9,11,13-三烯酸)、β-桐酸(9E,11E,13E-十八碳-9,11,13-三烯酸)、梓树酸(9Z,11Z,13E-十八碳-9,11,13-三烯酸)、石榴酸(9Z,11E,13Z-十八碳-9,11,13-三烯酸)、茹米烯酸(rumelenicacid)(9E,11Z,15E-十八碳-9,11,15-三烯酸)、α-杷荏酸(parinaric acid)(9E,11Z,13Z,15E-十八碳-9,11,13,15-四烯酸)、β-杷荏酸(全反式-十八碳-9,11,13,15-四烯酸)或bosseopentaenoic acid(5Z,8Z,10E,12E,14Z-二十碳五烯酸)。

在一些实施方案中，治疗剂包括皮诺敛酸(pinolenic acid)((5Z,9Z,12Z)-十八碳-5,9,12-三烯酸)或罗汉松酸((5Z,11Z,14Z)-二十碳-5,11,14-三烯酸。

在一些实施方案中，治疗剂包括烟酰胺、姜黄素或其组合。

在一些实施方案中，治疗剂包括载体，所述载体包含编码ELOVL2或其功能活性片段的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的多肽。在一些实施方案中，载体包括病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体包括基于腺相关病毒(AAV)的载体。在一些实施方案中，病毒载体包括基于腺病毒的载体、基于甲病毒的载体、基于疱疹病毒的载体、基于逆转录病毒的载体、基于慢病毒的载体或基于痘苗病毒的载体。

在一些实施方案中，载体包含启动子、增强子、反向末端重复序列(ITR)、衣壳、多腺苷酸化信号、信号序列或其组合。

在一些实施方案中，治疗剂包括载体，所述载体包含编码KLF14或其功能活性片段的多核苷酸。

在一些实施方案中，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:2的至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的多肽。

在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，组合物被配制用于口服施用。

在一些实施方案中，衰老表型包括脱发、骨密度降低、耐力降低、肌力降低或神经退化。

在一些实施方案中，受试者是人类。

附图简述

本公开内容的多个方面在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下详述以及附图将获得对本公开内容的特征和优点的更好的理解，详述阐述了其中使用了本公开内容的原理的说明性实施方案，在附图中：

图1A-图1I图示了Elovl2作为一种代谢基因，其充当衰老标志物。图1A示出了基因的DNA甲基化和衰老之间的相关性。感兴趣的位点被标记出。图1B示出了人类成纤维细胞中Elovl2的MeDip-qPCR和qPCR。误差条，平均值的标准误差(SEM)。图1C示出了l29/sv小鼠的脑和肝中Elovl2的内含子1(CGI-I1)中的CpG岛的DNA甲基化水平。误差条，SEM。不同字母(a、b)，p<0.05。图1D示出了对进行或未进行过氧化氢(H₂O₂)处理的年轻(p5)人类成纤维细胞进行的β-半乳糖苷酶(β-GAL)染色。比例尺，100μm。图1E示出了显示正常和H₂O₂处理的人类成纤维细胞中细胞衰老标志物的转录变化的qPCR。误差条，SEM。*，P＜0.05。图1F示出了H₂O₂处理的人类成纤维细胞中Elovl2的MeDip-qPCR。误差条，SEM。图1G示出了对进行或未进行H₂O₂处理的人类成纤维细胞进行的免疫共沉淀。图1H示出了蛋白质印迹，其显示H₂O₂诱导的DNMT在染色质上的积累是CHD4依赖性的。图1I示出了CHD4和5mC在用450nm激光照射的细胞的DNA损伤部位的募集。比例尺，5μm。

图2A-图2H图示了Elovl2的缺失导致小鼠的严重加速衰老的表型和代谢功能障碍。图2A示出了年轻(8月龄)Elovl2敲除(-/-Y)l29/sv小鼠而不是野生型(WT-Y)l29/sv小鼠的脱发。图2B示出了显示小鼠股骨中的骨体积/总体积(BV/TV)和骨小梁厚度(Tb.Th.)的微计算机断层扫描(微CT(micro-CT))。误差条，SEM。不同字母(a、b)，p<0.05。图2C示出了不同组的l29/sv小鼠中的旷场测试(Open-field test)结果。误差条，SEM。不同字母(a、b、c)，p<0.05。图2D示出了肝组织的苏木精和伊红染色以及病理切片分析。绿色圈示出异常结构。不同字母(a、b)，p<0.05。比例尺，100μm。图2E示出了l29/sv小鼠的肝、脑和血浆中的脂肪酸种类的热图。图2F示出了肝的油红O(ORO)染色。误差条，SEM。不同字母(a、b、c)，p<0.05。比例尺，100μm。图2G示出了超声测试结果。误差条，SEM。不同字母(a、b、c、d)，p<0.05。图2H示出了葡萄糖耐量试验(glucose tolerance test；GTT)和胰岛素耐量试验(insulintolerance test；ITT)结果。误差条，SEM。*，p＜0.05。

图3A-图3G图示了Elovl2的消耗导致慢性炎症、细胞衰老和成体干细胞衰竭。图3A示出了血液中的炎性因子水平。误差条，SEM。不同字母(a、b、c)，p<0.05。图3B示出了TNF-α和MCP-1的蛋白质印迹和qPCR。误差条，SEM，并且，*，p<0.05。图3C示出了对肝进行的马松三色(Masson’s trichrome)染色。误差条，SEM。不同字母(a、b、c)，p<0.05。比例尺，100μm。图3D示出了用上皮祖细胞标志物染色的毛囊和肠。比例尺，100μm。误差条，SEM。不同字母(a、b、c)，p<0.05。图3E示出了眼底玻璃疣(fundus drusen)的自发荧光图像；丙锭染色(红色)显示视网膜的不同层，包括神经节细胞层(GCL)、内丛状层(OPL)、外核层(ONL)、视杆和视锥层(RCL)和视网膜色素上皮(RPE)；TUNEL染色(绿色)显示凋亡。误差条，SEM。不同字母(a、b、c)，p<0.05。比例尺，自发荧光图像为800μm；切片为100μm。图3F示出了NRL层的厚度。误差条，SEM。不同字母(a、b、c)，p<0.05。图3G示出了视觉功能分析。误差条，SEM。*，p＜0.05。

图4A-图4I图示了Elovl2缺陷导致ER应激和线粒体功能障碍。图4A示出了-/-Y样品中富集的差异表达的基因的基因集。横轴表示与WT-O样品相比，-/-Y中差异表达的基因，所述基因根据在-/-Y中上调或下调进行排序，并且分别以红色和蓝色标记。归一化富集分数(NES)和错误发现率(FDR)被标记出。图4B示出了-/-Y中上调或下调的基因中富集的基因本体术语。图4C示出了衰老相关途径中的基因的表达模式。图4D示出了肝中的HSPA5染色。误差条，SEM。不同字母(a、b)，p<0.05。图4E示出了ER应激标志物的蛋白质印迹和qPCR。误差条，SEM。*，p＜0.05。图4F示出了线粒体功能分析。误差条，SEM。*，p＜0.05。图4G示出了Seahorse XF线粒体应激测试。误差条，SEM。*，p＜0.05。图4H示出了HIF1α、ANT2、UCP2和COX5b的蛋白质印迹和RT-qPCR。误差条，SEM。不同字母(a、b)，p<0.05。图4I示出了SeahorseXF糖酵解测试。误差条，SEM。*，p＜0.05。

图5A-图5J图示了人类RPE细胞中由Elovl2消耗诱导的AMD表型。图5A示出了对未经处理(空白，蓝色)或进行Elovl2敲低(KE，紫色)的人类RPE细胞进行的β-半乳糖苷酶染色。图5B示出了细胞倍增时间分析。误差条，SEM。*，p＜0.05。图5C和图5D示出了空白和KE细胞中衰老和AMD标志物的蛋白质印迹(图5C)和qPCR(图5D)。*，p＜0.05。图5E示出了ER应激相关途径和细胞衰老相关途径中的基因的表达模式。图5F示出了KE RPE细胞中上调的基因中富集的基因本体术语。图5G示出了线粒体功能分析。误差条，SEM。*，p＜0.05。图5H示出了mitoSOX染色结果。比例尺，100μm。图5I示出了用烟酰胺核苷(nicotinamide riboside)(Ni)以及VEGF和Aβ抗体处理的空白和KE RPE细胞的免疫荧光。比例尺，100μm。图5J示出了对进行各种处理的细胞进行qPCR分析以确定细胞衰老、AMD和线粒体功能相关基因。误差条，SEM。不同字母(a、b、c)，p<0.05。

图6A-图6H图示了Elovl2作为一种代谢基因，其充当衰老标志物。图6A示出了Elovl2基因的结构示意图。图6B示出了l29/sv和ICR小鼠的脑和肝中通过亚硫酸氢盐测序(bisulfite-sequencing)测量的Elovl2的内含子1(I1)和外显子3、4和8(E3、E4、E8)的CpG岛的DNA甲基化水平。误差条表示平均值的标准误差(SEM)。不同字母(a、b)表示p<0.05。图6C示出了1周龄或18月龄的小鼠的脑和肝中CGi-Il的DNA甲基化水平。18M小鼠的脑和肝中的甲基化水平显著更高。图6D示出了1周龄或18月龄的小鼠的脑、肝和睾丸中的Elovl2表达水平。这表明，Elovl2表达水平随年龄降低。图6E示出了对年轻(p5)和年老(p38)人类成纤维细胞进行的β-半乳糖苷酶(β-GAL)染色。比例尺＝100um。图6F示出了进行或未进行过氧化氢(H₂O₂)处理的人类成纤维细胞的细胞增殖(细胞数目倍增时间)的代表性统计图。图6G示出了进行或未进行H₂O₂处理的人类成纤维细胞的免疫共沉淀结果。使用了CHD4、G9a和Ezh2的抗体。这表明，CDH4可以募集G9a和Ezh2。图6H示出了在DNMT1、DNMT3A或DNMT3B而不是CHD4被敲低的组中，在H₂O₂处理后，Elovl2表达水平显著降低。

图7A-图7H图示了Elovl2的消耗导致小鼠中衰老的急剧加速。图7A示出了不同组中小鼠的sgRNA设计和基因型。图7B示出了显示WT或-/-小鼠的不同器官中ELOVL2的表达的蛋白质印迹。图7C示出了显示WT-O或-/-小鼠脱发的代表性图像。WT-Y、WT-O和-/-Y的骨体积/总体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th.)、骨小梁数目(Tb.Nu.)和骨小梁间距(Tb.Sp.)通过微CT测量。误差条表示SEM。不同字母(a、b、c)表示p<0.05。(D&E)-/-Y小鼠表现出耐力(图7D)和肌力(图7E)的降低。误差条表示SEM。不同字母(a、b、c)表示p<0.05。图7F示出了Morris水迷宫测试，其中池的不同地点处的平台显示WT-Y、WT-O和-/-Y(n＝20)中的小鼠的空间学习和记忆。不论平台位置如何，这都示出了WT-O和-/-小鼠的空间学习和记忆显著降低。误差条表示SEM。不同字母(a、b、c)表示p<0.05。图7G和图7H示出了肾和坐骨神经的苏木精和伊红染色以及病理切片分析的代表性图像；绿色圈示出异常结构。比例尺＝100μm。不同字母(a、b)表示p<0.05。

图8A-图8E图示了在Elovl2 KO小鼠中发现的多种代谢紊乱。图8A示出了显示ELOVL家族在脂质代谢中的作用的示意图。图8B示出了ICR小鼠的肝、脑和血浆中的脂肪酸种类(饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA))的热图。图8C示出了常规饮食(玉米油)和添加PUFA饮食(鱼油)的小鼠的示例性葡萄糖耐量试验(GTT)(左)和示例性胰岛素耐量试验(ITT)(右)。对于GTT，将ICR小鼠在16小时过夜禁食后的零时注射1g/kg葡萄糖，并测量多达2h的血清葡萄糖(n＝12/组)。对于ITT，将ICR小鼠在从光周期开始禁食5小时后，在零时注射1.6U/kg胰岛素(n＝12/组)。误差条表示SEM。*，p＜0.05。(D).在旷场测试中，饲喂玉米油或鱼油的不同组的l29/sv小鼠和ICR小鼠的距离、速度和转向计数(turn count)。图8E示出了来自饲喂补充有玉米油的饮食的WT-Y、-/-Y和饲喂补充有鱼油的饮食的-/-Y的肝和肾的苏木精和伊红染色以及病理切片分析的代表性图像。

图9A-图9F图示了小鼠中Elovl2的消耗导致慢性炎症以及眼和脑的功能下降。图9A示出了对来自不同组的ICR小鼠的血液样品中的炎性因子进行的ELISA测试。误差条表示SEM。不同字母(a、b、c)表示p<0.05。图9B示出了ERG和VEP记录方法学分析，其显示眼功能下降。误差条表示SEM。不同字母(a、b、c)表示p<0.05。图9C示出了眼底自发荧光成像，其显示-/-Y小鼠中的玻璃疣的出现。图9D示出了对大脑皮层和海马进行的磁共振成像(MRI)分析。这揭示了-/-Y和WT-O小鼠中的显著异常。误差条表示SEM。不同字母(a、b、c)表示p<0.05。图9E和图9F示出了RNA-Seq数据的基因本体分析，其揭示-/-Y小鼠的脑中的功能障碍。

图10A-图10F图示了Elovl2消融导致细胞水平的严重氧化损伤。图10A示出了-/-Y样品中富集的差异表达的基因的基因集。横轴表示与高脂肪饮食(HFD)小鼠样品相比，-/-Y中差异表达的基因，所述基因根据在-/-Y中上调或下调进行排序。归一化富集分数(NES)和错误发现率(FDR)被标记出。图10B示出了WT-Y和-/-Y肝样品中ER应激途径中的基因的表达模式。图10C示出了验证RNA-Seq数据的qPCR结果。误差条表示SEM。*表示p＜0.05。图10D分别示出了MitoSOX染色和γH2A.X染色，其显示-/-Y小鼠中在线粒体和核中的严重氧化损伤。误差条表示SEM。不同字母(a、b)表示p<0.05。图10E示出了对来自不同组的肝样品中的氧化损伤因子进行的ELISA测试。这表明了氧化损伤影响蛋白质(AOPP)、脂质(MDA)和RNA(8-OHG)。误差条表示SEM。不同字母(a、b)表示p<0.05。图10F示出了通过蛋白质印迹和qPCR在-/-Y和WT-O小鼠中检测到更高的细胞衰老标志物。误差条表示SEM。不同字母(a、b)表示p<0.05。

图11A-图11D图示了由Elovl2缺陷诱导的AMD表型。图11A和图11B示出了显示空白和KE人类RPE细胞中的ELOVL2表达的qPCR(图11A)和蛋白质印迹(图11B)结果。图11C示出了显示在空白和KE人类RPE细胞之间具有变化的细胞衰老相关基因的簇的热图。图11D示出了RNA-seq数据，其揭示了KE人类RPE细胞中的上调基因和下调基因。

图12图示了年龄相关的DNA甲基化介导的加速衰老过程的模型示意图。

图13图示了具有衰老标志物CpG位点的基因的相关性和功能。各基因的P值从最大到最小排序，并且位于前面的基因(top genes)的功能显示在右侧。

图14图示了本文描述的示例性的基于AAV的ELOVL2构建体。

本公开内容的详述

ELOVL脂肪酸延长酶2(ELOVL2)编码参与催化长链脂肪酸延长循环的限速步骤的跨膜蛋白。在一些情况下，ELOVL2的甲基化水平或甲基化状态与ELOVL2蛋白表达的降低相关。例如，ELOVL2的甲基化状态或水平随受试者年龄而增加，并且相反地，蛋白表达也降低。

在一些情况下，ELOVL2甲基化状态的增加和ELOVL2表达的减少与衰老过程的增加相关。例如，ELOVL2的消耗中止了多不饱和脂肪酸(PUFA)合成，并通过将细胞能量代谢转换为糖酵解状态、内质网(ER)应激的增加和线粒体功能障碍来加速小鼠模型的衰老。

在一些实施方案中，本文公开了一种通过增加ELOVL2的表达和/或通过调节PUFA合成途径来延缓和/或逆转衰老表型的方法。

使用方法

在一些实施方案中，本文公开了一种减少或减缓有相应需要的受试者中的衰老表型的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含减少或减缓衰老表型的治疗剂。在一些情况下，治疗剂包括C₁₈-C₂₈多不饱和脂肪酸。在一些情况下，治疗剂包括C₂₀-C₂₈多不饱和脂肪酸、C₂₀-C₂₂多不饱和脂肪酸、C₂₂-C₂₈多不饱和脂肪酸或C₂₂-C₂₄多不饱和脂肪酸。在一些情况下，治疗剂包括C₁₈多不饱和脂肪酸。在一些情况下，治疗剂包括C₂₀多不饱和脂肪酸。在一些情况下，治疗剂包括C₂₁多不饱和脂肪酸。在一些情况下，治疗剂包括C₂₂多不饱和脂肪酸。在一些情况下，治疗剂包括C₂₄多不饱和脂肪酸。在一些情况下，治疗剂包括C₂₆多不饱和脂肪酸。在一些情况下，治疗剂包括C₂₈多不饱和脂肪酸。

在一些情况下，治疗剂包括亚甲基中断的多烯。在一些情况下，亚甲基中断的多烯包括多不饱和ω-3脂肪酸、多不饱和ω-6脂肪酸或多不饱和ω-9脂肪酸。示例性的多不饱和ω-3脂肪酸包括但不限于α-亚麻酸(ALA)(全顺式-9,12,15-十八碳三烯酸)、硬脂四烯酸(SDA)(全顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸)、二十碳三烯酸(ETE)(全顺式-11,14,17-二十碳三烯酸)、二十碳四烯酸(ETA)(全顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸)、二十碳五烯酸(EPA，Timnodonic acid)(全顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)、二十一碳五烯酸(HPA)(全顺式-6,9,12,15,18-二十一碳五烯酸)、二十二碳五烯酸(DPA，鰶鱼酸)(全顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸)、二十二碳六烯酸(DHA,Cervonic acid)(全顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸)、二十四碳五烯酸(全顺式-9,12,15,18,21-二十四碳五烯酸)或二十四碳六烯酸(鲱酸)(全顺式-6,9,12,15,18,21-二十四碳六烯酸)。

示例性的多不饱和ω-6脂肪酸包括但不限于亚油酸(全顺式-9,12-十八碳二烯酸)、γ-亚麻酸(GLA)(全顺式-6,9,12-十八碳三烯酸)、二十碳二烯酸(全顺式-11,14-二十碳二烯酸)、二高-γ-亚麻酸(DGLA)(全顺式-8,11,14-二十碳三烯酸)、花生四烯酸(AA)(全顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸)、二十二碳二烯酸(全顺式-13,16-二十二碳二烯酸)、肾上腺酸(全顺式-7,10,13,16-二十二碳四烯酸)、二十二碳五烯酸(Osbond acid)(全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸)、二十四碳四烯酸(全顺式-9,12,15,18-二十四碳四烯酸)或二十四碳五烯酸(全顺式-6,9,12,15,18-二十四碳五烯酸)。

示例性的多不饱和ω-9脂肪酸包括但不限于米德酸(全顺式-5,8,11-二十碳三烯酸)。

在一些情况下，治疗剂包括多不饱和ω-3脂肪酸。在一些情况下，治疗剂包括α-亚麻酸(ALA)(全顺式-9,12,15-十八碳三烯酸)、硬脂四烯酸(SDA)(全顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸)、二十碳三烯酸(ETE)(全顺式-11,14,17-二十碳三烯酸)、二十碳四烯酸(ETA)(全顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸)、二十碳五烯酸(EPA，Timnodonic acid)(全顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)、二十一碳五烯酸(HPA)(全顺式-6,9,12,15,18-二十一碳五烯酸)、二十二碳五烯酸(DPA，鰶鱼酸)(全顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸)、二十二碳六烯酸(DHA,Cervonic acid)(全顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸)、二十四碳五烯酸(全顺式-9,12,15,18,21-二十四碳五烯酸)或二十四碳六烯酸(鲱酸)(全顺式-6,9,12,15,18,21-二十四碳六烯酸)。

在一些情况下，治疗剂包括多不饱和ω-6脂肪酸。在一些情况下，治疗剂包括亚油酸(全顺式-9,12-十八碳二烯酸)、γ-亚麻酸(GLA)(全顺式-6,9,12-十八碳三烯酸)、二十碳二烯酸(全顺式-11,14-二十碳二烯酸)、二高-γ-亚麻酸(DGLA)(全顺式-8,11,14-二十碳三烯酸)、花生四烯酸(AA)(全顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸)、二十二碳二烯酸(全顺式-13,16-二十二碳二烯酸)、肾上腺酸(全顺式-7,10,13,16-二十二碳四烯酸)、二十二碳五烯酸(Osbond acid)(全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸)、二十四碳四烯酸(全顺式-9,12,15,18-二十四碳四烯酸)或二十四碳五烯酸(全顺式-6,9,12,15,18-二十四碳五烯酸)。

在一些情况下，治疗剂包括多不饱和ω-9脂肪酸。在一些情况下，治疗剂包括米德酸(全顺式-5,8,11-二十碳三烯酸)。

在一些情况下，治疗剂包括共轭脂肪酸。示例性的共轭脂肪酸包括但不限于瘤胃酸(9Z,11E-十八碳-9,11-二烯酸或10E,12Z-十八碳-10,12-二烯酸)、α-金盏酸(8E,10E,12Z-十八碳三烯酸)、β-金盏酸(8E,10E,12E-十八碳三烯酸)、兰花酸(8Z,10E,12Z-十八碳三烯酸)、α-桐酸(9Z,11E,13E-十八碳-9,11,13-三烯酸)、β-桐酸(9E,11E,13E-十八碳-9,11,13-三烯酸)、梓树酸(9Z,11Z,13E-十八碳-9,11,13-三烯酸)、石榴酸(9Z,11E,13Z-十八碳-9,11,13-三烯酸)、茹米烯酸(9E,11Z,15E-十八碳-9,11,15-三烯酸)、α-杷荏酸(9E,11Z,13Z,15E-十八碳-9,11,13,15-四烯酸)、β-杷荏酸(全反式-十八碳-9,11,13,15-四烯酸)或bosseopentaenoic acid(5Z,8Z,10E,12E,14Z-二十碳五烯酸)。在一些情况下，治疗剂包括瘤胃酸(9Z,11E-十八碳-9,11-二烯酸或10E,12Z-十八碳-10,12-二烯酸)、α-金盏酸(8E,10E,12Z-十八碳三烯酸)、β-金盏酸(8E,10E,12E-十八碳三烯酸)、兰花酸(8Z,10E,12Z-十八碳三烯酸)、α-桐酸(9Z,11E,13E-十八碳-9,11,13-三烯酸)、β-桐酸(9E,11E,13E-十八碳-9,11,13-三烯酸)、梓树酸(9Z,11Z,13E-十八碳-9,11,13-三烯酸)、石榴酸(9Z,11E,13Z-十八碳-9,11,13-三烯酸)、茹米烯酸(9E,11Z,15E-十八碳-9,11,15-三烯酸)、α-杷荏酸(9E,11Z,13Z,15E-十八碳-9,11,13,15-四烯酸)、β-杷荏酸(全反式-十八碳-9,11,13,15-四烯酸)或bosseopentaenoic acid(5Z,8Z,10E,12E,14Z-二十碳五烯酸)。

在一些情况下，治疗剂包括皮诺敛酸((5Z,9Z,12Z)-十八碳-5,9,12-三烯酸)或罗汉松酸((5Z,11Z,14Z)-二十碳-5,11,14-三烯酸)。

在一些情况下，治疗剂包括烟酰胺、姜黄素或其组合。

在一些实施方案中，治疗剂包括载体，所述载体包含编码ELOVL2或其功能活性片段的多核苷酸。在一些情况下，治疗剂被进一步配制为用于上调ELOVL2表达的组合物。在这样的情况下，方法包括治疗有相应需要的受试者，其包括向受试者施用包含载体的组合物，所述载体包含编码ELOVL2或其功能活性片段的多核苷酸。

在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少80％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少85％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少90％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少91％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少92％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少93％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ IDNO:1的至少94％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少95％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少96％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少97％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少98％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少99％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1100％的序列同一性的多肽。在一些情况下，多核苷酸编码由SEQ ID NO:1中列出的序列组成的多肽。

在一些情况下，载体包括病毒载体。在一些情况下，病毒载体包括基于腺相关病毒(AAV)的载体。示例性的基于AAV的载体包括但不限于血清型1的基于AAV的载体(AAV1)、血清型2的基于AAV的载体(AAV2)、血清型3的基于AAV的载体(AAV3)、血清型4的基于AAV的载体(AAV4)、血清型5的基于AAV的载体(AAV5)、血清型6的基于AAV的载体(AAV6)、血清型7的基于AAV的载体(AAV7)、血清型8的基于AAV的载体(AAV8)、血清型9的基于AAV的载体(AAV9)或基于人源化的AAV的载体。

在一些情况下，载体包括血清型1的基于AAV的载体(AAV1)、血清型2的基于AAV的载体(AAV2)、血清型3的基于AAV的载体(AAV3)、血清型4的基于AAV的载体(AAV4)、血清型5的基于AAV的载体(AAV5)、血清型6的基于AAV的载体(AAV6)、血清型7的基于AAV的载体(AAV7)、血清型8的基于AAV的载体(AAV8)、血清型9的基于AAV的载体(AAV9)或基于人源化的AAV的载体。

在一些情况下，病毒载体包括基于腺病毒的载体、基于甲病毒的载体、基于疱疹病毒的载体、基于逆转录病毒的载体、基于慢病毒的载体或基于痘苗病毒的载体。

在一些情况下，载体包含与上文描述的多核苷酸可操作地连接的细胞或组织特异性启动子。在一些情况下，细胞或组织特异性启动子是对感兴趣的细胞类型特异性的内源启动子。在其他情况下，细胞或组织特异性启动子是对感兴趣的细胞类型特异性的外源启动子。

在一些情况下，载体包含微生物启动子。在一些情况下，微生物启动子包括SV40。在其他情况下，微生物启动子包括巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子。

在一些情况下，载体包含增强子、反向末端重复序列(ITR)、衣壳、多腺苷酸化信号、信号序列或其组合。

在一些实施方案中，载体包含选择标记。在一些情况下，选择标记包括编码荧光蛋白的多核苷酸。在一些情况下，荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、超折叠型GFP、增强型青色荧光蛋白(ECFP)、DsRed荧光蛋白(DsRed2FP)、mTurquoise、mVenus、Emerald、Azami Green、mWasabi、TagFGP、TurboFGP、AcGFP、ZsGreen、T-Sapphire、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、Azurite、mTagBFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl、Midori-Ishi Cyan、TagCFP、mTFPl、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、Topaz、MCitrine、YPet、TagYFP、PhiYFP、ZsYellowl、mBanana、Kusabira Orange、Kusabira Orange2、mOrange、dTomato、TagRFP、TagRFP-T、DsRed、DsRed-Express(T1)、mTangerine、mRuby、mApple、mStrawberry、AsRed2、mRFPl、JRed、mCherry、HcRedl、mRaspberry、dKeima-Tandem、mPlum或AQ143。

在一些实施方案中，载体包含编码延长因子1-α(EFlα)的多核苷酸。

在一些实施方案中，载体包含编码Klarsicht、ANC-1、Syne同源(KASH)结构域的多核苷酸。

在一些实施方案中，治疗剂包括载体，所述载体包含编码KLF14或其功能活性片段的多核苷酸。Kruppel样因子14(KLF14)又称为基本转录元件结合蛋白5(BTEB5)，编码Kruppel样转录因子家族的成员。在一些情况下，KLF14蛋白调节TGFβRII的转录，并且是脂肪组织中基因表达的主要调节物。在一些情况下，KLF14的甲基化水平或甲基化状态与KLF14蛋白表达的降低相关。

在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调KLF14表达的组合物。在这样的情况下，方法包括治疗有相应需要的受试者，其包括向受试者施用包含载体的组合物，所述载体包含编码KLF14或其功能活性片段的多核苷酸。在一些情况下，多核苷酸编码包含与SEQ IDNO:2的至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的多肽。

在一些实施方案中，组合物包含抑制染色质域-解旋酶-DNA结合蛋白4(CHD4)的激活的活性剂。

在一些实施方案中，ELOVL2表达水平的降低与具有少于22个碳链的多于一种脂肪酸的积累的增加相关。在一些情况下，多于一种脂肪酸包括饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或其组合。

在一些实施方案中，ELOVL2表达的升高减少或减缓衰老表型。在一些情况下，衰老表型包括脱发、骨密度降低、耐力降低、肌力降低或神经退化。在一些情况下，ELOVL2表达的升高减少或减缓脱发、骨密度降低、耐力降低、肌力降低、神经退化或其组合。

在一些实施方案中，ELOVL2表达的升高治疗衰老相关的疾病或状况。在一些情况下，衰老相关的疾病或状况是年龄相关性黄斑变性(AMD)。年龄相关性黄斑变性(也称为黄斑变性、AMD或ARMD)是一种视力恶化，导致视野中心的视力模糊或无视力。在一些情况下，氧化应激、脂质分子积累和炎症促成AMD的发展。在一些情况下，包含上文描述的载体的组合物治疗AMD。在其他情况下，包含上文描述的载体的组合物减少和/或减缓AMD的进展。

在一些情况下，衰老相关的疾病或适应症是代谢疾病或状况。在这样的情况下，代谢疾病或状况是糖尿病(diabetes、diabetes mellitus、DM)。在一些情况下，糖尿病是1型糖尿病、2型糖尿病、3型糖尿病、4型糖尿病、双重糖尿病、隐匿性自身免疫性糖尿病(LAD)、妊娠期糖尿病、新生儿糖尿病(NDM)、青少年成年发病型糖尿病(maturity onset diabetesof the young，MODY)、Wolfram综合征、

综合征、糖尿病前期或尿崩症。2型糖尿病，也称为非胰岛素依赖型糖尿病，是最常见的糖尿病类型，占所有糖尿病病例的95％。在一些情况下，2型糖尿病由多于一种因素的组合引起，包括由于胰岛β细胞功能障碍导致的胰岛素抵抗，这进而又会导致高的血液葡萄糖水平。在一些情况下，胰高血糖素水平的增加刺激肝产生异常量的不需要的葡萄糖，这促成高的血液葡萄糖水平。

1型糖尿病，也称为胰岛素依赖型糖尿病，构成所有糖尿病病例的约5％至10％。1型糖尿病是其中T细胞攻击并破坏胰腺中产生胰岛素的β细胞的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，1型糖尿病由遗传和环境因素引起。

在一些实施方案中，术语双重糖尿病被用于描述被诊断为患有1型糖尿病和2型糖尿病两者的患者。

4型糖尿病是最近发现的一种糖尿病类型，影响约20％的65岁及大于65岁的糖尿病患者。在一些实施方案中，4型糖尿病的特征是年龄相关的胰岛素抵抗。

在一些实施方案中，3型糖尿病被用作导致脑中胰岛素抵抗的阿尔茨海默病的术语。

LAD，也称为慢发型1型糖尿病，是一种缓慢发展的1型糖尿病形式，其中诊断经常发生在30岁以后。在一些实施方案中，LAD进一步分类为成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)或青少年隐匿性自身免疫性糖尿病(LADY)或儿童隐匿性自身免疫性糖尿病(LADC)。

糖尿病前期，也称为临界性糖尿病，是糖尿病的前驱阶段。在一些情况下，糖尿病前期的特征是异常的OGTT、空腹血浆葡萄糖测试和血红蛋白A1C测试结果。在一些实施方案中，糖尿病前期被进一步分类为空腹血糖受损(impaired fasting glycaemia)或空腹葡萄糖受损(impaired fasting glucose；IFG)和葡萄糖耐量受损(impaired glucosetolerance；IGT)。IFG是一种血液葡萄糖水平高于正常水平，但还没有高到足以被诊断为糖尿病的状况。IGT是具有异常血液葡萄糖水平的糖尿病前期状态，其与胰岛素抵抗和增加的心血管病症风险相关。

在一些情况下，包含上文描述的载体的组合物治疗代谢疾病或状况。在一些情况下，包含上文描述的载体的组合物治疗糖尿病。

在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调一种或更多种另外的基因的表达的组合物。在这样的情况下，方法包括治疗有相应需要的受试者，其包括向受试者施用包含载体的组合物，所述载体包含编码一种或更多种另外的基因或其功能活性片段的多核苷酸。在一些情况下，一种或更多种另外的基因选自Slc6a4、Sst、Hdac4、Nefm、Calb1、Il4i1、Grin2c、Chga、Grm2、Neurod1、Ardb1、Dio3、Ghsr、Avpr1a、Cadps2、Gria2、Irs2、Smad2、Htr7、Sypl2、Mad1l1或Vgf。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Slc6a4、Sst、Hdac4、Nefm、Calb1、Il4i1、Grin2c、Chga、Grm2、Neurod1、Ardb1、Dio3、Ghsr、Avpr1a、Cadps2、Gria2、Irs2、Smad2、Htr7、Sypl2、Mad1l1、Vgf或其组合的表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Slc6a4表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Sst表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Hdac4表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Nefm表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Calb1表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Il4i1表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Grin2c表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Chga表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Grm2表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Neurod1表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Ardb1表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Dio3表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Ghsr表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Avpr1a表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Cadps2表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Gria2表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Irs2表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Smad2表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Htr7表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Sypl2表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Mad1l1表达的组合物。在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Vgf表达的组合物。

在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Elovl2与以下的一种或更多种的组合的表达的组合物：Slc6a4、Sst、Hdac4、Nefm、Calb1、Il4i1、Grin2c、Chga、Grm2、Neurod1、Ardb1、Dio3、Ghsr、Avpr1a、Cadps2、Gria2、Irs2、Smad2、Htr7、Sypl2、Mad1l1或Vgf。

在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Elovl2和Klf14与以下的一种或更多种的组合的表达的组合物：Slc6a4、Sst、Hdac4、Nefm、Calb1、Il4i1、Grin2c、Chga、Grm2、Neurod1、Ardb1、Dio3、Ghsr、Avpr1a、Cadps2、Gria2、Irs2、Smad2、Htr7、Sypl2、Mad1l1或Vgf。

在一些情况下，治疗剂被配制为用于上调Klf14与以下的一种或更多种的组合的表达的组合物：Slc6a4、Sst、Hdac4、Nefm、Calb1、Il4i1、Grin2c、Chga、Grm2、Neurod1、Ardb1、Dio3、Ghsr、Avpr1a、Cadps2、Gria2、Irs2、Smad2、Htr7、Sypl2、Mad1l1或Vgf。

药物组合物和制剂

在一些实施方案中，包含治疗剂或活性剂(例如，C₁₈-C₂₈多不饱和脂肪酸或包含编码ELOVL2或其功能活性片段的多核苷酸的载体)的组合物通过多种施用途径施用至受试者，所述施用途径包括但不限于胃肠外(例如，静脉内、皮下、肌内)、口服、鼻内、含服(buccal)、直肠或经皮施用途径。在一些情况下，组合物(例如，药物组合物)被配制用于口服施用。在一些情况下，组合物(例如，药物组合物)被配制用于胃肠外施用。

在一些实施方案中，药物制剂包括但不限于水性液体分散剂、自乳化分散剂、固体溶液、脂质体分散剂、气雾剂、固体剂型、粉末、立即释放制剂(immediate releaseformulation)、控制释放制剂、速熔制剂(fast melt formulation)、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂(multiparticulate formulation)(例如，纳米颗粒制剂)以及混合的立即和控制释放制剂。

在一些实施方案中，药物制剂包含基于与本文公开的组合物的相容性和期望的剂型的释放分布特性而选择的载体或载体物质。示例性的载体物质包括例如粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。药学上相容的载体物质包括但不限于阿拉伯胶(acacia)、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸二钾(dipotassium phosphate)、纤维素和纤维素缀合物、糖类、硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶凝淀粉等。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版(Easton,Pa.:MackPublishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.,编著,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980,和PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版(Lippincott Williams&Wilkinsl999)。

在一些情况下，药物制剂还包含pH调节剂或缓冲剂，其包括诸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸的酸，诸如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷的碱，以及诸如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵的缓冲剂。这样的酸、碱和缓冲剂以将组合物的pH维持在可接受范围内所需的量被包含。

在一些情况下，药物制剂以使组合物的渗透压摩尔浓度(osmolality)达到可接受范围所需的量包含一种或更多种盐。这样的盐包括那些具有钠、钾或铵阳离子和氯、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的盐，合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。

在一些实施方案中，药物制剂包含但不限于糖类如海藻糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、葡萄糖，或盐类如磷酸钾、柠檬酸钠、硫酸铵和/或增加多肽的溶解度和体内稳定性的其他剂，诸如肝素。

在一些情况下，药物制剂还包含用于使化合物稳定的稀释剂，因为它们可以提供更稳定的环境。溶解在缓冲溶液(其也可以提供pH控制或维持)中的盐在本领域中用作稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些情况下，稀释剂增加组合物的体积以便于压缩或产生足够的体积以进行均匀混合以用于胶囊填充。这样的化合物可以包括例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、微晶纤维素诸如

二碱式磷酸钙(dibasic calciumphosphate)、磷酸二钙二水合物(dicalcium phosphate dihydrate)、磷酸三钙、磷酸钙、无水乳糖、喷雾干燥的乳糖、预胶凝淀粉、可压缩糖(compressible sugar)诸如

(Amstar)、甘露醇、羟丙基甲基纤维素、醋酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素酯(hydroxypropylmethylcellulose acetate stearate)、基于蔗糖的稀释剂、精制细砂糖(confectioner's sugar)、单碱式硫酸钙一水合物(monobasic calcium sulfatemonohydrate)、硫酸钙二水合物、乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂(dextrates)、水解谷物固体、直链淀粉、粉末状纤维素(powdered cellulose)、碳酸钙、甘氨酸、高岭土、甘露醇、氯化钠、肌醇、膨润土等。

在一些情况下，药物制剂包含崩解剂(disintegration agent)或崩解剂(disintegrant)，以促进物质的分解或崩解。术语“崩解”包括当与胃肠液接触时剂型的溶解和分散两者。崩解剂的实例包括淀粉，例如天然淀粉诸如玉米淀粉或马铃薯淀粉，预胶凝淀粉诸如National 1551或

或羟乙酸淀粉钠(sodium starch glycolate)诸如

或

纤维素诸如木制品(wood product)，甲基结晶纤维素例如

PH101、

PH102、

PH105、

P100、

Ming

和

甲基纤维素，交联羧甲纤维素(croscarmellose)或交联的纤维素诸如交联的羧甲基纤维素钠

交联的羧甲基纤维素(cross-linked carboxymethylcellulose)或交联的交联羧甲纤维素，交联的淀粉诸如羟乙酸淀粉钠，交联的聚合物诸如交联聚维酮(crospovidone)，交联的聚乙烯吡咯烷酮，藻酸/藻酸盐/酯诸如藻酸或藻酸的盐诸如藻酸钠，粘土诸如

HV(硅酸镁铝)，树胶诸如琼脂，瓜尔胶，刺槐豆胶，Karaya，果胶或黄芪胶，羟乙酸淀粉钠，膨润土，天然海绵，表面活性剂，树脂诸如阳离子交换树脂，柑桔渣，十二烷基硫酸钠，结合淀粉的十二烷基硫酸钠(sodium lauryl sulfate in combination starch)等。

在一些情况下，药物制剂包含填充剂，诸如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、二碱式磷酸钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶凝淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等。

润滑剂和助流剂也任选地被包含在本文描述的药物制剂中以用于防止、减少或抑制物质的粘附或摩擦。示例性的润滑剂包括例如硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂酰富马酸钠，烃(hydrocarbon)诸如矿物油，或氢化植物油诸如氢化大豆油

高级脂肪酸及其碱金属盐和碱土金属盐，诸如铝盐、钙盐、镁盐、锌盐，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡，

硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如，PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇诸如Carbowax^TM，油酸钠，苯甲酸钠，山嵛酸甘油酯，聚乙二醇，十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠，胶体二氧化硅诸如Syloid^TM、

淀粉诸如玉米淀粉、硅桐油、表面活性剂等。

增塑剂包括用于软化微囊化物质或薄膜包衣以使其不易碎的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇诸如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350和PEG 800，硬脂酸，丙二醇，油酸，三乙基纤维素和三乙酸甘油酯。增塑剂还可以作为分散剂或润湿剂发挥功能。

增溶剂包括诸如以下的化合物：三乙酸甘油酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆盐(bile salt)、聚乙二醇200-600、糖原质(glycofurol)、卡必醇(transcutol)、丙二醇和二甲基异山梨醇等。

稳定剂包括诸如任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂等的化合物。示例性的稳定剂包括L-精氨酸盐酸盐、氨丁三醇(tromethamine)、白蛋白(人类)、柠檬酸、苯甲醇、苯酚、脱水二磷酸二钠(disodium biphosphate dehydrate)、丙二醇、间甲酚(metacresol)或间甲酚(m-cresol)、乙酸锌、聚山梨酸酯-20或

20，或氨基丁三醇(trometamol)。

悬浮剂包括诸如以下的化合物：聚乙烯吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物(S630)，聚乙二醇(例如聚乙二醇可以具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量)，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，醋酸硬脂酸羟甲基纤维素酯，聚山梨酸酯-80，羟乙基纤维素，藻酸钠，树胶，诸如例如黄芪胶和阿拉伯树胶，瓜尔胶、黄原胶类(xanthans)，包括黄原胶(xanthan gum)，糖类，纤维素类(cellulosics)，诸如例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素，聚山梨酸酯-80，藻酸钠，聚乙氧基化山梨醇酐单月桂酸酯，聚乙氧基化山梨醇酐单月桂酸酯，聚维酮等。

表面活性剂包括诸如以下的化合物：十二烷基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或吐温80、三乙酸甘油酯、维生素E TPGS、山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚山梨酯、泊洛沙姆(polaxomers)、胆盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物，例如

(BASF)等。另外的表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油，以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛基酚聚醚10(octoxynol10)、辛基酚聚醚40。有时，表面活性剂被包含以增强物理稳定性或用于其他目的。

粘度增强剂(viscosity enhancing agent)包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、醋酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素酯、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素酯、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐/酯、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。

润湿剂包括诸如以下的化合物：油酸、单硬脂酸甘油酯、山梨醇酐单油酸酯、山梨醇酐单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三乙酸甘油酯、吐温80、维生素ETPGS、铵盐等。

治疗方案

在一些实施方案中，本文描述的治疗剂被每天一次或更多次施用。在一些实施方案中，本文描述的治疗剂被每天一次、每天两次、每天三次或更多次施用。在一些情况下，本文描述的治疗剂被每天(daily)、每一天(every day)、每隔一天(every alternate day)、一周五天、一周一次、每隔一周、每月两周、每月三周、每月一次、每月两次、每月三次或更多次施用。在一些情况下，本文描述的治疗剂被施用持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、2年、3年或更长时间。

在一些实施方案中，这样的治疗方案的毒性和治疗效力通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中确定，包括但不限于LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)的确定。毒性和治疗效果之间的剂量比值是治疗指数，并且其被表示为LD50与ED50之间的比值。表现出高治疗指数的化合物是优选的。从细胞培养测定和动物研究中获得的数据被用于制定用于人类的剂量范围。这样的化合物的剂量优选地在包括具有最小毒性的ED50的循环浓度范围以内。剂量取决于所采用的剂型和所利用的施用途径在该范围内变化。

某些术语

除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与所要求保护的主题所属领域内的技术人员通常理解的相同的含义。应理解，前述一般性描述和以下详细描述仅是示例性的和说明性的，而不限制任何要求保护的主题。在本申请中，除非另有特别说明，单数的使用包括复数。必须注意，除非上下文另外清楚地指示，如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。在本申请中，除非另外说明，“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括/包含/含有(including)”以及其他形式(诸如，“包括/包含/含有(include)”、“包括/包含/含有(includes)”和“包括/包含/含有(included)”)的使用是非限制性的。

如本文使用的，范围和量可以被表示为“约”特定值或范围。约也包括精确的量。因此，“约5μL”意指“约5μL”，并且也意指“5μL”。通常，术语“约”包括将被预期在实验误差以内的量。

本文中所使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。

如本文使用的，术语“个体”、“受试者”和“患者”意指任何哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人类。在一些实施方案中，哺乳动物是非人类。这些术语都不要求或都不受限于以医疗护理工作者(例如，医生、注册护士、执业护士、医师助理、勤务员或临终关怀工作者)的监管(例如持续或间歇)为特征的情况。

“位点”对应于单个位点，其在一些情况下是单个碱基位置或相关碱基位置的组，例如，CpG位点。“基因座”对应于包括多于一个位点的区域。在一些情况下，基因座包括一个位点。

术语“载体”在本文中用于指具有使其能够在宿主细胞中复制的核苷酸序列的核酸分子。在一些情况下，载体包括包含表达控制元件的核酸，所述表达控制元件诸如转录/翻译控制信号、复制起点、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点、启动子、增强子等，其中控制元件与编码基因产物的核酸可操作地连接。这些和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多这样的序列来源于商购可得的载体。参见例如Sambrook等人(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor，及其中引用的参考文献。

如本文使用的，术语“可操作地连接”是指例如启动子区域和多核苷酸(例如编码ELOVL2蛋白)之间的功能性结合，使得多核苷酸的转录由启动子区域控制和调节。

如本文使用的，“功能”蛋白是保留通常与该蛋白相关的至少一种生物活性的蛋白。优选地，“功能”蛋白保留未修饰蛋白所具有的所有活性。“无功能”蛋白是基本上不表现出可检测的通常与该蛋白相关的生物活性的蛋白(例如，最多仅无意义的(insignificant)量)。

实施例

提供这些实施例仅用于说明性目的，而不限制本文提供的权利要求的范围。

实施例1

衰老的特征是针对病症的脆弱性逐渐增加、分子保真度损失以及组织和器官功能的逐渐下降。若干研究表明，衰老还与表观遗传改变相关。表观遗传改变包括对基因组的翻译后修饰，并进一步整合环境信号以调节基因表达和衰老中的下游细胞过程。事实上，与生物年龄相关的CpG位点的甲基化水平已经被绘制出(Broer,L.,和van Duijn,C.M.(2015).GWAS and Meta-Analysis in Aging/Longevity.Adv Exp Med Biol 847,107-125；Hannum,等人(2013).Genome-wide methylation profiles reveal quantitative viewsof human aging rates.Mol Cell 49,359-367；和Stubbs,等人(2017).Multi-tissue DNAmethylation age predictor in mouse.Genome Biol 18,68)。若干年龄相关的甲基化位点也与代谢相关基因相关(Hannum,等人(2013).Genome-wide methylation profilesreveal quantitative views of human aging rates.Mol Cell49,359-367；Zbiec-Piekarska,等人(2015).Examination of DNA methylation status of the ELOVL2marker may be useful for human age prediction in forensic science.ForensicSci Int Genet 14,161-167)。

ELOVL脂肪酸延长酶2(Elovl2)参与PUFA诸如DHA和EPA的合成，并且已经观察到DHA和EPA的缺乏导致动物模型和人类二者中的年龄相关的疾病。参见例如，Pauter等人(2017).Both maternal and offspring Elov12genotypes determine systemic DHAlevels in perinatal mice.J Lipid Res 58,111-123；和Zadravec等人(2011).ELOVL2controls the level of n-6 28:5and 30:5fatty acids in testis,a prerequisitefor male fertility and sperm maturation in mice.J Lipid Res 52,245-255)。在一些情况下，PUFA参与抗炎、能量产生以及脂质代谢的内稳态(Buckley等人(2014).Proresolving lipid mediators and mechanisms in the resolution of acuteinflammation.Immunity 40,315-327；Hennebelle等人(2014).Ageing and apoE changeDHA homeostasis:relevance to age-related cognitive decline.Proc Nutr Soc 73,80-86；和Serhan,C.N.(2014).Pro-resolving lipid mediators are leads forresolution physiology.Nature 510,92-101)。以下实施例针对PUFA合成和对哺乳动物中的衰老的贡献的考察了表观遗传改变。

Elovl2+/-&-/-小鼠

所有的小鼠实验根据ARRIVE指南和规定进行。在人类绒毛膜促性腺激素(phCG)注射后21小时，从与ICR雄性小鼠杂交的6周龄ICR超数排卵的雌性小鼠中收集受精卵。在phCG25小时注射靶向Elovl2外显子3的Cas9 mRNA和sgRNA(图6，各20ng/μL)。Cas9 mRNA用

T7ULTRA试剂盒(Ambion,AMB1345-5)体外转录，并且sgRNA使用MEGAshortscript^TM试剂盒(Ambion,AM1354)通过体外转录来合成。

细胞培养和药物处理

人类RPE细胞主要来源于健康供体。人类成纤维细胞购自ATCC(WI-38，

CCL-75)，将人类成纤维细胞维持在补充有10％胎牛血清和50U/ml青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。人类RPE细胞用补充有10％胎牛血清和50U/ml青霉素-链霉素的DMEM/F-12(1:1)进行培养。

对于Elovl2敲低，制备外源表达shRNA(5’-TGGTGGTACTATTTCTCCAAA-3’)的慢病毒载体(pLL3.7-shElovl2)，并使用Lipofectamin 3000试剂(Thermo Fisher)转染到293T细胞(ATCC)中以获得慢病毒。为了建立Elovl2敲低细胞系，将6孔板中的人类RPE细胞(前一天晚上以5*10^5个细胞/孔的浓度接种)用含有Elovl2-shRNA的慢病毒感染24h，然后平衡24h。感染后48h进行药物处理。为了挽救Elovl2敲低细胞，在细胞培养基中添加l0μg/ml姜黄素(Sigma,C7727)或5mM烟酰胺(Sigma,N0636)或DMSO，并将细胞处理48h。

RNA提取、逆转录和qPCR

RNA通过RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN,74104)提取，并且使用无RNA酶的DNA酶套装(QIAGEN,79254)以确保无DNA污染。逆转录通过高容量cDNA逆转录试剂盒(ABI,4368814)进行。SYBR-qPCR通过Power

Green PCR主混合物(ABI,4367659)进行。所有引物使用PrimerPremier5设计，并且由Integrated DNA Technologies合成。

蛋白质印迹

通过机械研磨获得新鲜组织悬浮液。收集人类成纤维细胞和人类RPE细胞，并在配备有蛋白酶抑制剂混合物(Pierce,78441)和原钒酸钠(Sigma,S6508)的Pierce IP裂解缓冲液(Pierce,87787)中在冰上裂解30min。在4℃以13,000g离心10min后，收集上清液并与30μL样品缓冲液(10mL；1.25mL 0.5M-pH 6.8-Tris-HCl、2.5mL甘油、2mL 10％SDS、200μL0.5％溴酚蓝、3.55mL H₂O和0.5mLβ-巯基乙醇)混合，并在沸水中孵育5分钟。样品在SDS-PAGE上以5％浓缩胶(10mL；5.7mL ddH₂O，2.5mL 1.5M pH 6.8Tris-HCl，1.7mL 30％丙烯酰胺(丙烯酰基:双丙烯酰基＝29:1)，100μL 10％SDS，50μL 10％过硫酸铵，和10μL TEMED)和10％分离胶(10mL；4.1mL ddH₂O，2.5mL 1.5M pH 8.8Tris-HCl，3.3mL 30％丙烯酰胺(丙烯酰基:双丙烯酰基＝29:1)，100μL 10％SDS，50μL 10％过硫酸铵，和5μL TEMED)在100V分离1小时，并且然后在4℃以200mA持续1小时电泳转移到硝酸纤维素膜上。在RT将膜在含3％BSA(Sigma,B2064)的TBST缓冲液(10mM Tris,150mM NaCl,0.1％吐温20,pH 7.4)中封闭1小时，并且然后与在含1％BSA的TBST中稀释的一抗在4℃孵育过夜。在TBST中洗涤三次(每次10分钟)后，在RT将膜与在TBST中稀释的二抗孵育1小时。洗涤三次(每次10分钟)后，使用ECL和胶片检测信号。

免疫共沉淀(Co-IP)

使用核复合物Co-IP试剂盒(Active Motif,54001)，根据制造商的说明，对人类成纤维细胞和人类RPE细胞进行染色质结合蛋白的免疫共沉淀。简言之，细胞在低渗缓冲液中裂解，并且经由离心获得核提取物(紧密染色质)。提取物用酶切混合物(enzymaticshearing cocktails)消化，并与抗CHD4抗体(Sigma,SAB4200107)在4℃孵育过夜，然后用蛋白A/G磁珠(Thermo，88802)拉下(pull-down)。根据制造商的说明对拉下产物进行洗涤、变性和洗脱。

微计算机断层扫描骨密度分析

微CT使用Inveon MM系统(Siemens,Munich,Germany)进行。在360°旋转步长期间，在60kV电压、300μA电流、1,500ms曝光时间的情况下，获得具有8.82μm像素大小的图像。获得了2000层图像，体素大小为8.82μm×8.82μm×8.82μm。使用多模式3D可视化软件(InveonResearch Workplace,SIEMENS,Munich,Germany)进行3D重建。

旷场测试

装置由正方形的运动场(600×600mm2，长×宽)组成，由蓝色塑料建造，以15lux50均匀照明。将测试小鼠面向一面墙的中心放置，并允许探索装置10min。将旷场细分为两个虚拟同心正方形(中心区域和所有区域)。计算了在所有区域中花费的距离和速度。

Morris水迷宫

水迷宫在室温建造于充满水的黑色水箱中。在训练期间，将小鼠训练至找到象限之一中的在水面下的恒定位置处浸没的固定平台。将小鼠放置在水箱中的四个固定位点，并允许找到立足处。如果小鼠在90s内未能到达隐藏的平台，将其手动引导到那里，并停留15s。对小鼠进行5天的训练，每天连续试验5次。记录浮在水上的轨迹并使用图像分析进行分析以计算小鼠所做的路径长度、游动速度和转向数目。对于空间学习评价，比较了第1天和第5天的路径长度之间的差异。对于空间记忆能力测试，将平台从水箱中取出，并释放小鼠并在迷宫中自由游动90s。测量了路径长度、游动速度和转向数目。

加速旋转棒测试

使用转筒系统根据制造商的说明进行测试。简言之，将小鼠放置在旋转棒上，该旋转棒以4r.p.m.至40r.p.m.旋转5min。记录直到跌落或失去平衡的时间。连续三天，每天对每只小鼠进行三次试验，试验间隔为30min。

握力测试

使用握力测量系统对小鼠进行握力测试。允许小鼠抓住连接到力强计的感应杆。在用两只爪子对称地到达杆后，将小鼠轻轻地拉开，直到抓握破坏。

以五次连续试验的平均值作为评分。结果用体重(g)归一化。

组织病理学分析和油红O染色

从动物获取鼠(murine)组织后，将其在4％多聚甲醛(PFA)中固定，在石蜡中包埋并进行切片。HE染色遵循标准程序进行。评价病理参数，包括坏死、淋巴细胞浸润和单核细胞浸润、血管形成和纤维化。

对于油红O(ORO)染色，将肝组织在4％PFA中固定，并且用30％蔗糖平衡，然后进行最佳切割温度(OCT)复合物包埋、速冻并进行切片。使用脂质(油红O)染色试剂盒(Sigma,MAK194)对冷冻切片(cryosection)进行ORO染色。对脂肪细胞的大小和数目进行定量。

脂质组学分析

出于脂质组学分析的目的，获取小鼠的肝和脑，并立即储存在液氮中直到提取。通过离心从新鲜采集的血液中获取血浆并立即冷冻。脂质提取遵循氯仿-甲醇法的标准程序进行。根据制造商的说明，对脂肪酸提取物进行气相色谱-质谱分析。简言之，用

Mass Spec标准品(SPLASH,330707)建立标准曲线。评价了饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的水平。

葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验

在GTT期间，在6h禁食的小鼠中以2g/kg体重的单剂量进行葡萄糖(Sigma,G7528)的腹膜内注射。在葡萄糖注射前(0min)和葡萄糖注射后15min、30min、60min和120min从尾静脉采集血液样品。通过血糖仪(ONETOUCH Ultra,Lifescan)立即测量血液葡萄糖浓度。

通过腹膜内注射胰岛素(0.75IU/Kg,Aladdin,12584-58-6)进行ITT。在胰岛素注射前(0min)和胰岛素注射后30min、60min、90min和120min测量血液葡萄糖浓度。从小鼠尾静脉采集血液样品，并且通过血糖仪(ONETOUCH Ultra,Lifescan)立即测量血液葡萄糖浓度。

RNA-seq文库制备和数据处理

通过TRIzol试剂从组织或培养的细胞中提取总RNA。对于RNA序列文库构建，使用mRNA纯化试剂盒对每个样品进行PolyA+加尾的RNA纯化。cDNA文库用Stranded mRNA-Seq试剂盒生成。

在Illumina HiSeq 4000平台上通过150bp配对末端测序反应(paired-end-sequencing reaction)进行测序。通过HISAT2软件，使用注释的基因结构作为模板，将每个样品的RNA序列读段(read)独立地映射到小鼠mm9或人类hgl9基因组组装物(assembly)。除了选项“--dta-cufflinks”和“--rna-strandness RF”打开外，使用HISAT2的默认参数(HISAT:a fast spliced aligner with low memory requirements.Nature Methods 12(4):357-360；2015)。保留具有独特基因组位置的读段，以用于使用Cufflinks(版本2.0.2)以选项“--GTF”进行基因表达计算(Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during celldifferentiation,Nature Biotechnology,28(5):511-515；2010)。

通过R的heatmap.2功能产生热图。差异表达的基因的基因本体分析通过DAVID(Huang DW,Sherman BT,Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of largegene lists using DAVID Bioinformatics Resources.Nature Protoc.2009；4(l):44-57.；Huang DW,Sherman BT,Lempicki RA.Bioinformatics enrichment tools:pathstoward the comprehensive functional analysis of large gene lists.NucleicAcids Res.2009；37(l):1-13.)进行分析并且生物过程基于小于0.05的P值来选择，并且图通过ggplot2产生。通过GSEA进行基因集富集分析(Gene set enrichment analysis:Aknowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles,PNAS,102(43):15545-15550；2005)并从已发表的数据集构建基因集(Comprehensivetranscriptional landscape of aging mouse liver,BMC Genomics.16:899；2015；Themetabolic response to a high-fat diet reveals obesity-prone and-resistantphenotypes in mice with distinct mRNA-seq transcriptome profiles.Int J Obes(Lond).40:1452-1460；2016)。

免疫荧光染色和MitoSOX染色

灌注后，新鲜采集鼠组织样品，随后进行过夜PFA固定和蔗糖脱水。人类成纤维细胞、人类RPE细胞和鼠原代细胞用4％PFA固定1h。为了进行免疫荧光，将载玻片在PBS中冲洗5分钟，在室温(RT)在封闭缓冲液(具有1％BSA、0.1％吐温-20的PBS)中封闭20分钟，并且在RT与一抗在封闭缓冲液中孵育1小时。在用PBS中的0.1％吐温-20洗涤3次后，在RT将载玻片与二抗在封闭缓冲液中孵育1小时。将载玻片用DAPI-Vectashield溶液(Vectorlaboratories)封固。用共聚焦显微镜(LSM 780)采集图像。为了评估线粒体状况，根据制造商的说明，将人类RPE细胞和鼠原代细胞与MitoSOX(5uM)一起孵育。

糖酵解应激测试和Mito应激测试

用Seahorse Bioscience XF分析仪(Agilent Tech)，根据制造商的说明，对鼠原代肝细胞进行糖酵解应激测试和mito应激测试。简言之，将鼠肝细胞以100,000个细胞/孔接种于XF96细胞培养微板(Seahorse Bioscience，101085-004)中。进行测定前更换培养基，然后在37℃孵育1h。对于糖酵解应激测试，将细胞培养基更换为补充有L-谷氨酰胺的Seahorse XF Base培养基(Seahorse Bioscience)。在测定期间，依次将葡萄糖、寡霉素和2-脱氧葡萄糖添加到每个孔，然后混合并测量。对于mito应激测试，将培养基更换为补充有葡萄糖、l-谷氨酰胺和丙酮酸的Seahorse XF Base培养基。在测定期间，依次将寡霉素、FCCP和鱼藤酮添加到每个孔，然后混合并测量。混合时间、孵育时间和化学品添加时间线根据制造商的说明进行确定。

定量和统计学分析

在R中进行统计学分析。显著性水平用双尾学生t检验进行计算。在所有附图中：*，p值<0.05；**，P值<0.01。

Elovl2甲基化和表达状态与生物衰老之间的相关性

在一些情况下，人类和小鼠中的甲基化状态随着衰老而增加，并进一步用作生物年龄的预测因子。在一些情况下，对这些基因的功能的概况进一步分析，并且探索了增加的甲基化状态是否会影响基因的转录活性。分析了含有衰老标志物甲基化谱的数据集。前20个基因的功能与氧化应激、衰老和脂质代谢相关(图1A和图13)。在人类成纤维细胞中观察到Elovl2甲基化的增加，伴随着Elovl2表达水平的下调(图1B)。

在一些情况下，研究表明表观遗传时钟(epigenetic clock)也存在于小鼠中(Wang等人,Epigenetic aging signatures in mice livers are slowed by dwarfism,calorie restriction and rapamycin treatment.Genome Biol 18,57(2017)；Petkovich等人,Using DNA Methylation Profiling to Evaluate Biological Age and LongevityInterventions.Cell Metab 25,954-960e956(2017))。进一步检查了与衰老相关的人类年龄标志物在小鼠中的甲基化和表达。

检查了小鼠Elovl2基因中的四个CpG岛：第一内含子中的CGI-I1，以及第三、第四和第八外显子中的CGI-E3、E4和E8(图6A)。发现在129/sv品系中，脑和肝中CGI-I1、E3、E4和E8的甲基化随衰老而增加(图1C和图6B-6C)。qPCR分析显示，在129只小鼠中，Elovl2的表达水平随衰老而降低(图6D)。ICR品系的数据是一致的(图6B-6D)。这些结果表明，Elovl2在人类成纤维细胞模型和小鼠模型两者中都显示出增加的甲基化和降低的表达的保守模式。

CHD4在细胞衰老和DNA损伤修复过程期间的DNA甲基化的介导中起着关键作用。

CHD4(NuRD的组分)将抑制性染色质蛋白(包括DNA甲基转移酶)募集到DNA损伤修复位点，在那里它施加从头DNA甲基化。在一些情况下，CHD4包括启动和支持肿瘤抑制基因(TSG)沉默的致癌作用(Xia等人(2017).CHD4 Has Oncogenic Functions in Initiatingand Maintaining Epigenetic Suppression of Multiple Tumor SuppressorGenes.Cancer Cell 31,653-668e657)。

接下来，检查了衰老相关甲基化是如何被介导的。在一些情况下，累积的DNA损伤导致衰老中的细胞衰老。因此，检查了年龄相关的DNA甲基化是否由DNA损伤及其修复过程介导。通过过氧化氢(H₂O₂)诱导的细胞衰老已经被用作衰老研究的体外模型。本文中H₂O₂处理的人类成纤维细胞被用作衰老模型。H₂O₂处理的细胞显示出与高传代数(30-40代)细胞中的表达模式一致的衰老标志物的增加(图1D-1E和图6E-6F)。在高传代细胞和H₂O₂处理的细胞中观察到生物衰老标志物(Elovl2)的甲基化增加(图6F)，这表明在H₂O₂处理的细胞和高传代数细胞两者中都发生了DNA甲基化(图1B)。

在一些情况下，研究表明CHD4在癌细胞中的DNA损伤修复介导的基因沉默中发挥作用(Xie等人,CHD4 Has Oncogenic Functions in Initiating and MaintainingEpigenetic Suppression of Multiple Tumor Suppressor Genes.Cancer Cell 31,653-668e657(2017))。为了确定CHD4是否在年龄相关的DNA甲基化中起作用，检查了CHD4如何与DNA甲基转移酶和染色质抑制修饰物进行相互作用。使用人类成纤维细胞的免疫共沉淀测定表明，在H₂O₂处理后，CHD4与DNMT1、DNMT3A和DNMT3B相互作用(图1H)。免疫共沉淀测定表明，在H₂O₂处理后，CHD4与DNMT发生了显著的相互作用(图1G)。蛋白质印迹表明，H₂O₂处理促进了DNMT与染色质的结合(图1H，紧密染色质，对照)。此外，CHD4敲低减弱了DNMT1、DNMT3A和DNMT3B与染色质的结合(图1H，紧密染色质，iCHD4)，表明H₂O₂诱导的DNMT累积至染色质是CHD4依赖性的。除了DNMT，CHD4还募集其他抑制性组蛋白修饰物，诸如EZH2和G9a(图6G)。此外，在激光诱导的单链断裂(SSB)和双链断裂(DSB)后60分钟，在激光诱导的DNA损伤后60分钟的损伤位点处检测到内源CHD4、γH2a.X和增加的5mC信号，它们在CHD4敲低后降低(图1I)。

接下来，检查了H₂O₂处理前和H₂O₂处理后人类成纤维细胞中Elovl2的表达。在DNMT1、DNMT3A和DNMT3B敲低的组中，H₂O₂处理后Elovl2的表达降低，但在CHD4敲低的组中情况并非如此(图6H)，表明CHD4介导的DNA甲基化因此下调衰老标志物基因Elovl2的转录活性。总体而言，结果表明，在氧化损伤或DNA双链/单链断裂损伤后，CHD4在人类细胞衰老模型中发挥了相互作用和募集其他表观遗传抑制因子以在损伤位点增加甲基化的作用。

Elovl2缺失导致小鼠中的衰老表型严重加速

为了检查Elovl2在衰老中的功能，用CRISPR-Cas9产生了Elovl2敲除小鼠。sgRNA被设计为靶向第三外显子(图7A)。对129/sv和ICR小鼠两者进行了基因敲除实验。产生总计40只Elovl2^+/-和84只Elovl2^-/-首建鼠(funder mouse)。在这些Elovl2-/-小鼠中，32只小鼠在第三外显子中具有导致终止密码子的59bp缺失。因为Elovl2^+/-和Elovl2^-/-小鼠两者不论性别或品系如何均是不育的(这与诸如Zadravec等人,ELOVL2 controls the level of n-6 28:5and 30:5fatty acids in testis,a prerequisite for male fertility andsperm maturation in mice.J Lipid Res 52,245-255(2011)的研究不一致)，所以用这些59bp缺失小鼠进行实验。对幼鼠或成年小鼠使用严格的无PUFA乳和成分确定的无PUFA饮食，以防止通过食物摄取而摄入PUFA。蛋白质印迹显示Elovl2完全消耗(图7B)。在用成分确定的无PUFA饮食使之生长8个月(按年轻处理，Y)后，检查了衰老参数。Elovl2^-/-年轻小鼠(-/-Y)显示出一系列衰老加速的表型，诸如脱发(图2A)、骨密度降低(图2B和图7C)、耐力降低(图7D)和肌力降低(图7E)。由于在人类过早衰老疾病和动物模型中，进展性神经退行性变常随衰老而发生，因此进行了一系列行为和运动功能测试。旷场行为测试显示-/-Y小鼠具有减少的运动距离、速度和转向数目，这与野生型年老(WT-O，20月龄)小鼠相似(图2C)，揭示了降低的探索行为和增加的焦虑。Morris水迷宫测试表明-/-Y小鼠中的学习和记忆能力衰退(图7F)。此外，在-/-Y和WT-O小鼠中检测到衰老相关的组织病理学表型(图2D和图7G-7H)。在-/-Y和WT-O小鼠中发现了衰老相关的组织病理学表型，诸如肝细胞核大小不等(anisokaryosis)和核内包涵体，肾细胞核大小不等和坐骨神经严重轴突肿胀(图2D和图7G)。

Elovl2缺陷扰乱脂质和能量代谢

接下来，检查了Elovl2缺陷是如何使衰老加速的。Elovl2作为20:C至28:C的长脂肪酸的延长酶发挥功能(图8A)，并进一步使用气相色谱-质谱(GC-MS)对来自肝、脑和血浆的样品进行了脂质组学分析。分别分析了饱和脂肪酸(SFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)和单不饱和脂肪酸(MUFA)。结果表明，在WT-O和-/-Y小鼠的肝、脑和血浆中，少于20个碳的脂肪酸的积累，和具有长于22:C的碳链的PUFA诸如二十二碳六烯酸(DHA)的消耗(图2E和图8B)。相比之下，观察到具有长于22:C的碳链的PUFA诸如DHA的消耗(图2H和图8B)。这些结果与诸如Zadravec等人的报道一致，即Elovl2的消耗损害脂质代谢并通过上调关键转录因子SREBP1激活从头脂肪酸合成(Zadravec等人,ELOVL2 controls the level of n-6 28:5and 30:5fatty acids in testis,a prerequisite for male fertility and sperm maturationin mice.J Lipid Res 52,245-255(2011))。通过ORO(油红O)染色，鉴定出WT-O和-/-Y小鼠的肝细胞中的严重的脂肪酸积累(图2I)。使用ORO(油红O)染色，在WT-O和-/-Y小鼠两者的肝细胞中都观察到脂肪酸的积累(图2F)。此外，通过超声检查在WT-O和-/-Y小鼠中检测到脂肪性肝炎表型(图2G)。在一些情况下，研究表明，脂毒性可通过应激激酶(例如C-jun N-末端激酶，即JNK)的激活和慢性ER应激来诱导胰岛素抵抗(Ferre等人,Hepaticsteatosis:a role for de novo lipogenesis and the transcription factor SREBP-lc.Diabetes Obes Metab 12Suppl 2,83-92(2010)；Salvado等人,Targetingendoplasmic reticulum stress in insulin resistance.Trends Endocrinol Metab26,438-448(2015))。因此，进行葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT)以测试Elovl2消融是否可以诱导胰岛素抵抗。在两个品系中的-/-Y小鼠中都观察到葡萄糖耐量和胰岛素抵抗的表型(图2H和图8C)。

总之，这些结果显示Elovl2缺陷小鼠中的代谢功能障碍。

PUFA补充饮食不足以完全挽救Elvol2敲除小鼠中的衰老表型

考虑到Elovl2消耗减少了PUFA的合成，询问了饮食补充PUFA是否可以完全挽救加速衰老表型。与对照组相比，饮食补充PUFA(鱼油)可以略微改善+/-Y和-/-Y小鼠的肝中的脂肪酸积累，并改善生理葡萄糖代谢平衡，但不足以完全恢复(图2G-2H和图8C)。旷场行为测试表明，饮食补充PUFA可使衰老表型略微改善(图8D)。此外，PUFA添加后，衰老相关的组织病理学表型并未得到缓解(图8E)。这些结果表明，Elovl2的消耗促成衰老不仅仅是由于营养性PUFA的缺陷。

Elovl2消耗小鼠中诱发了慢性炎症、细胞衰老和成体干细胞衰竭

成体干细胞在维持组织功能和内稳态中发挥作用。成体干细胞大多数处于代谢失活的静息状态，但是可在应激的情况下转化为代谢活性状态以恢复组织功能。代谢在维持成体干细胞库(pool)中发挥作用。Oishi等人的研究显示，脂质代谢，例如PUFA合成，在免疫应答中发挥作用(Oishi等人,SREBP1 Contributes to Resolution of Pro-inflammatoryTLR4 Signaling by Reprogramming Fatty Acid Metabolism.Cell Metab 25,412-427(2017))。PUFA，诸如DHA和EPA，作为炎症抑制剂(诸如保护素(protectins)、消退素(resolvins)和Maresin)的前体调节炎症。考虑到在Elovl2消耗后的慢性ER应激和线粒体功能障碍诱导的氧化损伤，以及那些促消退(pro-resolving)脂质介导物(mediator)的缺乏，推测-/-Y小鼠也会经历慢性炎症。

对血液样品的分析表明，-/-Y和WT-O小鼠中炎性因子增加(图3A和图9A)。还检查了肝的炎症状态。在WT-O和-/-Y小鼠中检测到MCP1和TNF-α水平增加(图3B)。在肝、心脏和肾中检测到纤维化的增加(图3C)，并且在毛囊(CK15)和肠(LGR5)中检测到干细胞群体的损失(图3D)。

接下来，询问了Elovl2消融引起的炎症和多组织纤维化是否会损害组织和器官功能。首先，检查这些小鼠中的视网膜结构和眼功能。视网膜上尤其是RPE层上TUNEL染色的增强(图3E)，和NRL层厚度的降低(图3F)表明衰老信号的增加。在-/-Y和WT-O小鼠的视网膜中发现了感光细胞的视觉功能下降(图3G和图9B)，这与玻璃疣的出现同步(图3E和图9C)。其次，通过MRI检查大脑皮层和海马结构，并且在-/-Y和WT-O小鼠中检测到异常(图9D)。RNA序列分析还表明-/-Y小鼠的脑中明显异常的表达谱和受损的功能基因表达(图9E-9F)。这些结果表明，未能解决Elov12消耗的组织中的内源或外部炎性刺激导致了慢性炎症、干细胞衰竭和组织功能损失，这将是衰老的驱动因素。

Elovl2消耗影响多个代谢和衰老相关途径。

为了在分子水平上揭示Elovl2消耗如何通过代谢使衰老加速的机制，对来自WT-Y和-/-Y小鼠的肝和脑样品进行了RNA序列分析。与White等人报道的WT-O小鼠中上调的基因相比，本研究中鉴定出的上调的基因也在-/-Y小鼠中富集(图4A)(White等人，Comprehensive transcriptional landscape of aging mouse liver.BMC Genomics 16，899(2015))。此外，下调的基因显示出相对于White等人中鉴定出的下调的基因的一致模式(图4A)。此外，发现了-/-Y小鼠具有与HFD小鼠相似的表达谱，这证实了Elov12消融导致脂肪酸积累(图10A)。在-/-Y小鼠肝与WT-Y肝中鉴定出1,867个差异表达的基因(2倍变化，并且p值<0.05)，其中1,084个基因上调并且783个基因下调。基因本体(GO)富集分析表明，脂肪酸/脂质代谢、对胰岛素刺激物的细胞响应、线粒体功能和解偶联蛋白响应(uncoupledprotein response)被错误地调节(图4B)。值得注意的是，发现ER应激相关基因被上调(图4C和图10B)。此外，线粒体功能相关基因，诸如参与脂肪酸β-氧化过程和胰岛素受体信号传导途径的基因被下调，线粒体解偶联蛋白响应(UPR^mt)相关基因和糖酵解相关基因被上调(图4C)。与RNA-Seq数据一致，RT-qPCR也表明相同的表达模式(图10C)。

脂质代谢紊乱导致ER应激响应和线粒体功能障碍

线粒体在许多方面参与衰老过程，诸如能量产生、ROS产生和线粒体解偶联蛋白响应(Mito-UPR)。此外，线粒体也促成细胞衰老状态的转变。部分基于RNA序列数据分析，假设Elovl2消耗扰乱脂质代谢并上调脂肪酸生物合成，随后由于脂肪酸前体在ER上积累引起ER应激，并因此引起线粒体功能障碍，其随后促进衰老。为了验证该假设，测量了肝组织中的ER应激和线粒体功能。ER应激标志物，诸如HSPA5、磷酸化EIF2α(p-EIF2α)、p-ERN1和ATF6在WT-O和-/-Y小鼠中被上调(图4D-图4E)。标志物诸如mtDNA含量、ATP丰度和COX活性在WT-O和-/-Y小鼠中降低，而WT-Y和+/-Y小鼠显示出相对高水平的线粒体活性(图4F)。将AgilentSeahorse XF Cell Mito应激测试用于通过直接测量WT-O和-/-Y小鼠肝细胞的耗氧率(OCR)来测试线粒体功能的关键参数。对于基础呼吸，发现-/-Y小鼠中的耗氧率增加(图4G、4l)。寡霉素处理并未消除这种增加，这表明了增加的解偶联呼吸(uncoupledrespiration)和质子泄漏以及线粒体损害(图4G、图2)。发现HIF1α和ANT2的表达被上调，而UCP2的表达被下调(图4H)，表明-/-Y小鼠中存在低氧介导的线粒体功能障碍，这也可能是由多余的脂肪酸造成的(Lee等人，Increased Adipocyte O2 Consumption Triggers HIF-lα,Causing Inflammation and Insulin Resistance in Obesity.Cell 157,1339-1352(2014)；Hetz等人，The unfolded protein response:controlling cell fate decisionsunder ER stress and beyond.Nat Rev Mol Cell Biol 13,89-102(2012))。

在FCCP添加后，结果表明-/-Y小鼠的线粒体最大呼吸较低(图4G、图3)，这与COX5B的较低水平一致，这反映了氧化呼吸链的较低活性(图4H)。此外，发现-/-Y小鼠显示出增加的糖酵解活性(图4I)。观察到代谢由氧化磷酸化向糖酵解的转变(这在癌细胞和衰老细胞中均称为Warburg)，这也从RNA-seq数据中发现(图4C)。

这些结果证明了线粒体损伤和功能障碍的发生，其中涉及多余脂肪酸诱导的缺氧和高耗氧。慢性ER应激和线粒体功能障碍的后果之一是细胞水平的氧化损伤。通过不同的检测手段，发现线粒体(用于线粒体超氧化物的MitoSOX，图10D)和核(用于DNA氧化损伤的γ-H2AX，图10D)两者中都发生了氧化损伤。还观察到各种水平的氧化损伤，包括蛋白(图10E，AOPP)、脂质(图10E，MDA)和RNA(图10E，8-OHG)。此外，抗氧化酶也被过度激活(图10E，GSH-PX、CAT、T-SOD和TAC)。

在这样的严重氧化损伤后，通过蛋白质印迹和RT-qPCR在-/-Y和WT-O小鼠中检测到较高的细胞衰老标志物(图10F)。

人类RPE细胞中的Elovl2缺陷诱导AMD表型。

由于发现与AMD表型有关的许多代谢变化，因此进一步检查了Elovl2消融是否可以在人类中导致AMD表型。通过慢病毒将shRNA递送至人类原代RPE细胞(从健康供体产生)来开发Elovl2敲低RPE细胞系(KE)(图11A和图11B)。Elovl2的缺失导致细胞衰老(图5A)和受损的增殖(图5B)。还检测到KE细胞中包括P53、P21、IL-1b、IL-6和MCP1在内的衰老相关分泌表型(SASP)标志物的上调(图5C)。还发现另外的衰老和AMD标志物的RNA和蛋白水平在KE细胞中增加(图5D)。这些结果表明，通过人类RPE细胞中的Elovl2消耗可以产生具有增加的ASAP表型的AMD模型。

Elovl2消耗导致脂肪酸积累，其触发慢性ER应激和线粒体功能障碍(图4)。因此，假设这些损伤也参与了Elovl2缺陷诱导的人类AMD模型。事实上，根据RNA序列分析，在KE细胞中除了细胞衰老外，还检测到慢性ER应激的增加(图5E和图11C)。此外，GO术语分析表明KE细胞中的线粒体功能障碍，以及与线粒体功能诸如“NAD生物合成过程”和“凋亡的线粒体变化”相关的基因调节异常(图5F和图11D)。此外，发现随着mtDNA含量、ATP丰度、COX活性和NAD+丰度的下降，KE细胞显示出减少的线粒体量和线粒体功能损失(图5G)。此外，在线粒体中检测到氧化损伤的积累(图5H)，这反映出KE细胞中与-/-Y小鼠细胞类似的严重氧化损伤。尤其是，在小鼠模型和人类细胞模型两者中，Elovl2缺陷都导致由慢性ER应激和线粒体功能障碍引起的氧化损伤的增加。

此外，测试了线粒体激活剂烟酰胺(Ni)是否可以挽救Elovl2敲低细胞中的AMD表型。在KE细胞培养期间用Ni处理逆转了细胞衰老基因的异常表达并减少线粒体功能障碍，从而导致AMD标志物减少(图5I-5J)。这些结果表明线粒体活性的恢复和ER应激的清除可以改善由Elovl2消耗引起的AMD表型。

实施例2.

示例性的基于AAV的ELOVL2构建体的体内施用

将示例性的基于AAV的ELOVL2载体静脉内施用到20只Elovl2敲除小鼠的组中，每只小鼠接受约1×10¹²AAV载体颗粒。在注射后的各个时间点，获得血浆或组织样品并进行处理，并且随后确定ELOVL2表达。

图14图示了本文描述的示例性的基于AAV的ELOVL2构建体。

实施例3.

表1示出本文描述的ELOVL2和KLF14的示例性蛋白序列。

实施方案1:一种治疗有相应需要的受试者的方法，所述方法包括：向所述受试者施用组合物，所述组合物包含上调ELOVL脂肪酸延长酶2(ELOVL2)表达的活性剂和药学上可接受的载体(carrier)。

实施方案2:根据实施方案1所述的方法，其中所述活性剂包括载体(vector)，所述载体包含编码ELOVL2或其功能活性片段的多核苷酸。

实施方案3:根据实施方案2所述的方法，其中所述多核苷酸编码包含与SEQ IDNO:1的至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的多肽。

实施方案4:根据实施方案2或3所述的方法，其中所述载体包括病毒载体。

实施方案5:根据实施方案4所述的方法，其中所述病毒载体包括基于腺相关病毒(AAV)的载体。

实施方案6:根据实施方案5所述的方法，其中基于AAV的载体包括血清型1的基于AAV的载体(AAV1)、血清型2的基于AAV的载体(AAV2)、血清型3的基于AAV的载体(AAV3)、血清型4的基于AAV的载体(AAV4)、血清型5的基于AAV的载体(AAV5)、血清型6的基于AAV的载体(AAV6)、血清型7的基于AAV的载体(AAV7)、血清型8的基于AAV的载体(AAV8)、血清型9的基于AAV的载体(AAV9)或基于人源化的AAV的载体。

实施方案7:根据实施方案4所述的方法，其中所述病毒载体包括基于腺病毒的载体、基于甲病毒的载体、基于疱疹病毒的载体、基于逆转录病毒的载体、基于慢病毒的载体或基于痘苗病毒的载体。

实施方案8:根据实施方案2-7中任一项所述的方法，其中所述载体包含细胞或组织特异性启动子。

实施方案9:根据实施方案8所述的方法，其中所述细胞或组织特异性启动子是对感兴趣的细胞类型特异性的内源启动子。

实施方案10:根据实施方案8所述的方法，其中所述细胞或组织特异性启动子是对感兴趣的细胞类型特异性的外源启动子。

实施方案11:根据实施方案2-10中任一项所述的方法，其中所述载体包含微生物启动子。

实施方案12:根据实施方案11所述的方法，其中所述微生物启动子包括SV40或巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子。

实施方案13:根据实施方案2-12中任一项所述的方法，其中所述载体包含增强子、反向末端重复序列(ITR)、衣壳、多腺苷酸化信号、信号序列或其组合。

实施方案14:根据实施方案2-13中任一项所述的方法，其中所述载体包含选择标记。

实施方案15:根据实施方案14所述的方法，其中所述选择标记包括编码荧光蛋白的多核苷酸。

实施方案16:根据实施方案15所述的方法，其中所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、超折叠型GFP(Superfolder GFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)、DsRed荧光蛋白(DsRed2FP)、mTurquoise、mVenus、Emerald、Azami Green、mWasabi、TagFGP、TurboFGP、AcGFP、ZsGreen、T-Sapphire、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、Azurite、mTagBFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl、Midori-Ishi Cyan、TagCFP、mTFPl、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、Topaz、MCitrine、YPet、TagYFP、PhiYFP、ZsYellowl、mBanana、KusabiraOrange、Kusabira Orange2、mOrange、dTomato、TagRFP、TagRFP-T、DsRed、DsRed-Express(T1)、mTangerine、mRuby、mApple、mStrawberry、AsRed2、mRFPl、JRed、mCherry、HcRedl、mRaspberry、dKeima-Tandem、mPlum或AQ143。

实施方案17:根据实施方案2-16中任一项所述的方法，其中所述载体包含编码延长因子1-α(EF1α)的多核苷酸。

实施方案18:根据实施方案2-17中任一项所述的方法，其中所述载体包含编码Klarsicht、ANC-1、Syne同源(KASH)结构域的多核苷酸。

实施方案19:根据实施方案1所述的方法，其中所述活性剂抑制染色质域-解旋酶-DNA结合蛋白4(CHD4)的激活。

实施方案20:根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述组合物被全身施用。

实施方案21:根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述组合物作为局部注射剂施用。

实施方案22:根据实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制用于胃肠外施用。

实施方案23:根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制用于口服或鼻内施用。

实施方案24:根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中ELOVL2表达水平的降低与具有少于22个碳链的多于一种脂肪酸的积累的增加相关。

实施方案25:根据实施方案24所述的方法，其中所述多于一种脂肪酸包括饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或其组合。

实施方案26:根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中ELOVL2表达的升高减少或减缓衰老表型。

实施方案27:根据实施方案26所述的方法，其中所述衰老表型包括脱发、骨密度降低、耐力降低、肌力降低或神经退化。

实施方案28:根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中ELOVL2表达的升高治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)。

虽然在本文中已经示出和描述了本公开内容的优选的实施方案，但是对于本领域技术人员将明显的是，这样的实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换而不偏离本公开内容。应当理解，在实践本公开内容时可以采用本文描述的本公开内容的实施方案的各种替代选择。意图所附权利要求界定本公开内容的范围，并且从而在这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物被涵盖。

Claims (24)

1.一种减少或减缓有相应需要的受试者中的衰老表型的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含减少或减缓所述衰老表型的治疗剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂包括C₁₈-C₂₈多不饱和脂肪酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂包括C₂₀-C₂₂多不饱和脂肪酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂包括亚甲基中断的多烯。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述亚甲基中断的多烯包括多不饱和ω-3脂肪酸、多不饱和ω-6脂肪酸或多不饱和ω-9脂肪酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述多不饱和ω-3脂肪酸包括α-亚麻酸(ALA)(全顺式-9,12,15-十八碳三烯酸)、硬脂四烯酸(SDA)(全顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸)、二十碳三烯酸(ETE)(全顺式-11,14,17-二十碳三烯酸)、二十碳四烯酸(ETA)(全顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸)、二十碳五烯酸(EPA，Timnodonic acid)(全顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸)、二十一碳五烯酸(HPA)(全顺式-6,9,12,15,18-二十一碳五烯酸)、二十二碳五烯酸(DPA，鰶鱼酸)(全顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸)、二十二碳六烯酸(DHA，Cervonic acid)(全顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸)、二十四碳五烯酸(全顺式-9,12,15,18,21-二十四碳五烯酸)或二十四碳六烯酸(鲱酸)(全顺式-6,9,12,15,18,21-二十四碳六烯酸)。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述多不饱和ω-6脂肪酸包括亚油酸(全顺式-9,12-十八碳二烯酸)、γ-亚麻酸(GLA)(全顺式-6,9,12-十八碳三烯酸)、二十碳二烯酸(全顺式-11,14-二十碳二烯酸)、二高-γ-亚麻酸(DGLA)(全顺式-8,11,14-二十碳三烯酸)、花生四烯酸(AA)(全顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸)、二十二碳二烯酸(全顺式-13,16-二十二碳二烯酸)、肾上腺酸(全顺式-7,10,13,16-二十二碳四烯酸)、二十二碳五烯酸(Osbondacid)(全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸)、二十四碳四烯酸(全顺式-9,12,15,18-二十四碳四烯酸)或二十四碳五烯酸(全顺式-6,9,12,15,18-二十四碳五烯酸)。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述多不饱和ω-9脂肪酸包括米德酸(全顺式-5,8,11-二十碳三烯酸)。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂包括共轭脂肪酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述共轭脂肪酸包括瘤胃酸(9Z,11E-十八碳-9,11-二烯酸或10E,12Z-十八碳-10,12-二烯酸)、α-金盏酸(8E,10E,12Z-十八碳三烯酸)、β-金盏酸(8E,10E,12E-十八碳三烯酸)、兰花酸(8Z,10E,12Z-十八碳三烯酸)、α-桐酸(9Z,11E,13E-十八碳-9,11,13-三烯酸)、β-桐酸(9E,11E,13E-十八碳-9,11,13-三烯酸)、梓树酸(9Z,11Z,13E-十八碳-9,11,13-三烯酸)、石榴酸(9Z,11E,13Z-十八碳-9,11,13-三烯酸)、茹米烯酸(9E,11Z,15E-十八碳-9,11,15-三烯酸)、α-杷荏酸(9E,11Z,13Z,15E-十八碳-9,11,13,15-四烯酸)、β-杷荏酸(全反式-十八碳-9,11,13,15-四烯酸)或bosseopentaenoic acid(5Z,8Z,10E,12E,14Z-二十碳五烯酸)。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂包括皮诺敛酸((5Z,9Z,12Z)-十八碳-5,9,12-三烯酸)或罗汉松酸((5Z,11Z,14Z)-二十碳-5,11,14-三烯酸。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂包括烟酰胺、姜黄素或其组合。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂包括载体，所述载体包含编码ELOVL2或其功能活性片段的多核苷酸。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:1的至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的多肽。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述载体包括病毒载体。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述病毒载体包括基于腺相关病毒(AAV)的载体。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述病毒载体包括基于腺病毒的载体、基于甲病毒的载体、基于疱疹病毒的载体、基于逆转录病毒的载体、基于慢病毒的载体或基于痘苗病毒的载体。

18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述载体包含启动子、增强子、反向末端重复序列(ITR)、衣壳、多腺苷酸化信号、信号序列或其组合。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂包括载体，所述载体包含编码KLF14或其功能活性片段的多核苷酸。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:2的至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的多肽。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制用于口服施用。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述衰老表型包括脱发、骨密度降低、耐力降低、肌力降低或神经退化。

24.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述受试者是人类。

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