CN112980918A - 用于活菌制剂中的杂菌检测的培养基 - Google Patents

用于活菌制剂中的杂菌检测的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种培养基，所述培养基用于活菌制剂中的杂菌计数。该培养基包括：无乳糖培养基质以及脱氧胆酸钠或其立体异构体、互变异构体，所述无乳糖培养基质包括胰酪胨、大豆木瓜蛋白酶水解物和氯化钠。该培养基可有效用于活菌制剂中的杂菌的计数，克服了现有技术中活菌制剂的杂菌检测的假阴性问题，提高了活菌制剂的用药安全性。

Description

用于活菌制剂中的杂菌检测的培养基
技术领域
本发明涉及生物医药检测领域，具体地，本发明涉及用于活菌制剂中的杂菌检测的培养基，更具体地，用于活菌制剂中的杂菌检测的培养基以及活菌制剂中的杂菌进行检测的方法。
背景技术
在活菌制剂的制备过程中，由于原辅料包材中有时会含有极其微量的或者在活菌制剂的制备过程会引入微量的杂菌，如芽孢菌，其代表菌株为枯草芽孢杆菌，革兰氏阳性球菌，其代表菌株为金黄色葡萄球菌。出于药品安全的考虑，该杂菌的含量必须严格控制在安全范围内，才可上市。
目前市售含有芽孢类的产品如：思连康的双歧杆菌四联活菌片、整肠生的地衣芽孢杆菌活菌胶囊和地衣芽孢杆菌活菌颗粒、京常乐的地衣芽孢杆菌活菌胶囊、天悦婷的枯草杆菌活菌胶囊、美常安的枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊、妈咪爱的枯草杆菌、肠球菌二联活菌多维颗粒剂、源首的蜡样芽孢杆菌活菌胶囊、常复康的蜡样芽孢杆菌片、阿泰宁的酪酸梭菌活菌胶囊、常立宁的酪酸梭菌活菌片、宝乐安的酪酸梭菌活菌散、米桑的酪酸梭菌活菌胶囊、常乐康的酪酸梭菌二联活菌散和酪酸梭菌二联活菌胶囊、爽舒宝的凝结芽孢杆菌活菌片以及米雅的酪酸梭菌活菌散剂和酪酸梭菌活菌片。
而现有的活菌制剂的药典规定的杂菌的检测方法中采用的培养基无法排除含有芽孢类菌微生态制剂中芽孢杆菌对检测的干扰。因此，如果采用现有的方法检测活菌制剂的杂菌的含量，不可避免的会产生假阴性的检测结果，对药品的安全存在极大隐患；同时，活菌制剂如果含有芽孢杆菌，采用现有的方法检测活菌制剂的杂菌的含量时，芽孢杆菌会在营养琼脂培养基上生长蔓延严重，干扰杂菌辨别，故无法用现有方法进行杂菌检测，因此需要寻找一种能够抑制目的菌的物质，达到抑制微生态制剂中芽孢类菌生长，但不干扰杂菌的生长。
因此，开发一种新型的可用于活菌制剂的杂菌有效检测的培养基和方法，是保证活菌制剂用药安全的必要举措。
发明内容
本申请的发明人基于对现有抑菌剂和检测活菌制剂的杂菌培养基成分的认识，通过抑菌剂的筛选实验，并将现有培养基中加入不同量的抑菌剂，通过考察杂菌在培养基中的回收率以及培养基对该杂菌生长的影响，确定了一种可同时应用于活菌制剂中铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌含量检测的培养基和方法，克服了现有技术中活菌制剂的杂菌检测的假阴性问题和蜡样芽孢杆菌会在营养琼脂培养基上生长蔓延而干扰杂菌辨别的问题，提高了活菌制剂的用药安全性。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种培养基，所述培养基用于活菌制剂中的杂菌检测。根据本发明的实施例，所述培养基包括：无乳糖培养基质以及脱氧胆酸钠或其立体异构体、互变异构体，所述无乳糖培养基质包括胰酪胨、大豆木瓜蛋白酶水解物、氯化钠。根据本发明实施例培养基一方面通过无乳糖培养基质克服了活菌制剂中活菌对杂菌检测的干扰，另一方面脱氧胆酸钠或其立体异构体、互变异构体作为抑菌剂对活菌制剂中的活性成分菌进一步抑制而对活菌制剂中杂菌抑制作用微小，使得活菌制剂中的杂菌可在该培养基中选择性生长和扩增。根据本发明实施例的培养基可有效用于活菌制剂中的杂菌的计数，克服了现有技术中活菌制剂的杂菌检测的假阴性问题，提高了活菌制剂的用药安全性。
根据本发明的实施例，上述培养基还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述活菌制剂中至少包括芽孢杆菌活性菌。根据本发明实施例的培养基可有效抑制芽孢杆菌的生长，但不会完全抑制待检杂菌的生长，因此，根据本发明实施例的培养基可适用于包括芽孢杆菌活性菌制剂中杂菌的计数，如思连康的双歧杆菌四联活菌片、整肠生的地衣芽孢杆菌活菌胶囊和地衣芽孢杆菌活菌颗粒、京常乐的地衣芽孢杆菌活菌胶囊、天悦婷的枯草杆菌活菌胶囊、美常安的枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊、妈咪爱的枯草杆菌、肠球菌二联活菌多维颗粒剂、源首的蜡样芽孢杆菌活菌胶囊、常复康的蜡样芽孢杆菌片、阿泰宁的酪酸梭菌活菌胶囊、常立宁的酪酸梭菌活菌片、宝乐安的酪酸梭菌活菌散、米桑的酪酸梭菌活菌胶囊、常乐康的酪酸梭菌二联活菌散和酪酸梭菌二联活菌胶囊、爽舒宝的凝结芽孢杆菌活菌片以及米雅的酪酸梭菌活菌散剂和酪酸梭菌活菌片等。
根据本发明的具体实施例，所述芽孢杆菌活性菌包括选自蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的至少之一。
根据本发明的实施例，所述活菌制剂中包括双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌和蜡样芽孢杆菌四种活性菌。
根据本发明的实施例，所述杂菌包括选自铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的至少之一。发明人发现，在添加活菌制剂的情况下，根据本发明实施例的培养基培养所述铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的至少之一，其回收率达到了0.5～2.0。根据本发明实施例的培养基能够抑制活菌制剂中的活性菌，但不影响铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的生长。利用根据本发明实施例的培养基检测活菌制剂中铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的至少之一的含量，灵敏度和准确度更高，结果更加真实可信。
根据本发明的实施例，所述脱氧胆酸钠在所述培养基中的浓度为0.03-0.25g/L，优选0.07-0.15g/L，更优选0.1～0.15g/L。发明人发现，脱氧胆酸钠的用量对杂菌生长影响显著，脱氧胆酸钠的用量在0.03-0.25g/L范围内，能够使得铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的至少之一的回收率达到0.5～2.0内，且对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的生长没有显著抑制；当脱氧胆酸钠的用量在0.07-0.15g/L时，对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的回收率均达到0.5以上，能够满足同时对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌准确检测的需求。
根据本发明的实施例，所述培养基的pH为7.1～7.5。例如为7.3。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种培养基，所述培养基用于活菌制剂中的杂菌检测，所述杂菌包括选自枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的至少之一。根据本发明的实施例，基于1L水，所述培养基包括：13～17g胰酪胨、3～7g氯化钠、3～7g大豆木瓜蛋白酶水解物以及0.03-0.25g的脱氧胆酸钠，所述培养基的pH为7.1～7.5。根据本发明实施例的培养基对活菌制剂中的杂菌具有很好的选择作用，尤其可用于包含蜡样芽孢杆菌活菌制剂的杂菌检测，克服了现有技术中活菌制剂的杂菌检测的假阴性问题，提高了活菌制剂的用药安全性。
根据本发明的实施例，上述培养基还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述脱氧胆酸钠为0.07-0.15g，优选0.1～0.15g。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种对活菌制剂中的杂菌进行检测的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将活菌制剂供试液接种在前面所述培养基中；(2)将接种有活菌制剂供试液的培养基在适于待检菌落生长的条件下进行培养，以便获得待检菌落；(3)将待检菌落进行计数处理，以便获得待检菌落的数量。根据本发明实施例的方法可实现活菌制剂中的杂菌的灵敏性检测，克服了现有技术检测方法假阴性结果的缺陷，提高了活菌制剂的用药安全性。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述活菌制剂中至少包括芽孢杆菌活性菌。根据本发明实施例的方法用于检测包括芽孢杆菌活性菌的活菌制剂中的杂菌时，可有效抑制芽孢杆菌活性菌的生长，但却不会完全抑制待检杂菌的生长，因此，根据本发明实施例的方法可适用于包括芽孢杆菌活性菌制剂中杂菌的计数。
根据本发明的实施例，所述芽孢杆菌活性菌包括选自蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的至少之一。
根据本发明的实施例，所述活菌制剂中包括双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌和蜡样芽孢杆菌四种活性菌。
根据本发明的实施例，所述杂菌包括选自铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的至少之一。根据本申请实施例的方法对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的至少之一检测回收率在0.5以上，对以铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的至少之一为代表菌的含量的检测更加准确。
根据本发明的实施例，所述活菌制剂供试液是通过将活菌制剂溶解在0.9％的无菌氯化钠溶液中获得的。
根据本发明的实施例，所述供试液中活菌制剂的质量与0.9％的无菌氯化钠溶液的体积比为1g：9mL。
根据本发明的实施例，接种的所述供试液的体积为90～110μL。
根据本发明的实施例，所述培养是在30～37℃的条件下进行至少2天，优选3-5天。进而可有效保证活菌制剂中杂菌菌落的形成，进一步提高计数的准确性。
附图说明
图1是根据本发明实施例的比较接种于不同培养基中的菌液浊度的实验结果；
图2是根据本发明实施例的液体培养基的浊度与接种了菌液的培养基浊度进行比较的实验结果；
图3是根据本发明实施例的目的菌与阳性菌共生培养后菌液浊度的实验结果图；
图4是根据本发明实施例的改良TSA培养基对供试菌适用性检测结果；以及
图5是根据本发明实施例的在有目的菌共培养前提下，改良TSA培养基对供试菌适用性检测结果；以及
图6是根据本发明实施例的改良6号TSA培养基对另一双歧杆菌四联活菌制剂的检测结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
依据《化妆品卫生规范》2007版中介绍：在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基中可加入0.5％氯化三苯四氮唑(TTC)溶液1mL用于菌落总数的测定的实验方法。其原理是添加适量的2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)于培养基中，细菌经培养后，在脱氢酶的作用下，TTC接受氢而变成红色，使细菌着色为紫红色菌落团，便于菌落计数。
因TTC对不同的细菌种类及不同的细菌数量抑制力均不相同，已有文献报道，如用上述浓度的TTC营养琼脂对金黄色葡萄球菌生长有抑制作用。为确定TTC是否可用于适用于我司所生产的双歧杆菌四联活菌片杂菌检查项下的微生物计数检查，现设计不同浓度TTC对目的菌(制剂中的活性菌，尤其是蜡样芽孢杆菌)和阳性试验菌(制剂中的杂菌，如枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌)的抑制性试验如下。
1试验材料
TSA琼脂培养基(基于1L的水，溶解有15g胰酪胨、15g琼脂、5g大豆木瓜蛋白酶水解物、5g氯化钠)、NA琼脂培养基(基于1L的水，溶解有蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉浸出粉3g和琼脂15g)、TSB培养基(基于1L的水，溶解有胰酪胨17.0g，氯化钠5.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖/无水葡萄糖2.5g/2.3g)、NB培养基(基于1L的水，溶解有10g蛋白胨、5g氯化钠和3g牛肉浸出粉)、0.9％无菌氯化钠溶液、四氮唑(TTC)、双歧杆菌四联活菌片、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和白色念珠菌。
2试验样品
2.2.1菌液制备
取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和白色念珠菌的新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度适宜的菌悬液。
2.2.2供试液制备
取双歧杆菌四联活菌片，用0.9％无菌氯化钠溶液溶解，制成1:10供试液。
2.2.3稀释
2.2.3.1试验组：取上述供试液10mL，分别加入上述菌悬液0.1mL，混匀。
2.2.3.2供试品对照组：取上述供试液10mL，以稀释液代替菌液同试验组操作。
2.2.3.3菌液对照组：取10mL稀释液替代供试液，按试验组操作分别加入上述菌悬液0.1mL，混匀。
2.3操作
取添加TTC的改良培养基和对照培养基，分别接种试验组、供试品对照组和菌液对照组各0.1mL，涂布培养，每一试验样品对应的培养基均制备3个平皿。
3试验结果
3.4.1培养基配方
表1：试验培养基组成
Figure BDA0002322775490000061
3.4.2不同TTC浓度下菌种生长情况
表2：菌落数汇总表
Figure BDA0002322775490000062
Figure BDA0002322775490000071
表3：培养基与方法回收率结果
Figure BDA0002322775490000072
Figure BDA0002322775490000081
以改良培养基上菌液对照组的菌落平均数与对应TSA培养基或NA培养基上的菌落平均数的比值为依据，判断改良培养基的适用性，要求菌落平均数比值在0.5-2.0范围内，即回收率达到50-200％。以(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)与菌液对照组菌落数的比值为依据，判定改良培养基是否适用于双歧杆菌四联活菌片的检查，要求比值应在0.5-2.0范围内，即回收率达到50-200％。
当TTC浓度对目的菌的抑制不明显时，目的菌在平皿中弥漫生长，不仅会抑制试验菌生长，还会影响已生长试验菌的识别。提高培养基中TTC浓度，使其对目的菌的抑制作用逐渐增加，大量目的菌生长被抑制，但仍有少量目的菌能够生长，此时，目的菌因自身的代谢作用使TTC还原变色，导致其菌落缩小呈红色，与试验菌菌落形态类似，干扰对试验菌的识别，亦无法计算平皿中的试验菌数量，以枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的试验组现象为代表。继续升高培养基中TTC浓度，使目的菌完全被抑制生长，此时平皿中仍能生长的菌落即为目的菌，可用于活菌制剂的杂菌检查。
根据表2和表3的数据分析可知，TTC浓度为0.02-0.03mg/mL时，试验菌的菌液对照组回收率基本符合0.5-2.0要求。当TTC浓度为0.03mg/mL时，仅在营养较为贫瘠的NA培养基中，白色念珠菌的菌液对照组回收率低于0.5要求，仅为47.8％。但当TTC浓度为0.02mg/mL时，试验菌菌液对照组的回收率全都符合0.5-2.0要求，TSA培养基中分别达到85.3、113.8、96.2、99.4和99.1，NA培养基中分别达到112.7、90.7、103.5、109.8和86.7，但此浓度下的培养基并不能完全抑制目的菌，导致试验组中各试验菌识别不易，TSA培养基中仅大肠埃希菌试验组可勉强识别，而NA培养基中存在白色念珠菌试验组无法识别。
添加TTC使其浓度为0.04mg/mL时，白色念珠菌在培养基中生长被抑制。故，未能摸索到合适的TTC浓度，使其既能够有效抑制目的菌，不影响试验菌的识别，又能够使试验菌回收率达到合格要求。
实施例2
为了探索一种能够有效抑制产品中双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌和蜡样芽孢杆菌的生长，尤其是能有效抑制生命力强的蜡样芽孢杆菌生长，而对可能杂菌的检查影响较小的抑菌剂，发明人检索了大量的文献报道。
已知BA琼脂培养基是蜡样芽胞杆菌选择性培养基，EC琼脂培养基是肠球菌选择性培养基，现对比两种培养基配方，发现EC琼脂培养基成分含有磷酸氢二钠和磷酸二氢钾，而这两种磷酸盐是BA琼脂培养基所缺少的。
结合用于蜡样芽孢杆菌的酪蛋白分解试验用的酪蛋白琼脂配方，发现含有一定量的磷酸氢二钠可以作为培养基中的缓冲剂，可促进蜡样芽胞杆菌生长，所以磷酸二氢钾可能具有抑制蜡样芽胞杆菌生长的作用。
另根据检索到的文献可知：10ml/L的甘油不会抑制蜡样芽孢杆菌生长，但会抑制其抑菌活性的发挥。蛋白酶K和胰蛋白酶可以降解蜡样芽孢杆菌分泌的细菌素。而大蒜提取物对蜡样芽胞杆菌生长存在一定抑制作用；乳酸片球菌素对革兰氏阳性菌具有不同程度的生长抑制作用，对大肠杆菌等革兰氏阴性菌没有抑制作用；一定浓度的三聚磷酸盐和焦磷酸盐对枯草芽孢杆菌存在抑制作用；多聚磷酸盐对金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌存在一定的抑菌作用等。根据检索到的信息，选择上述可能的抑菌剂对目的菌进行如下抑菌效果试验，以筛选合适的抑菌剂。
试验材料
TSB培养基、0.9％无菌氯化钠溶液、甘油、三聚磷酸钠、焦磷酸钠、蛋白酶K、胰蛋白酶、脱氧胆酸钠、双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、蜡样芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和大肠埃希菌。
试验内容与方法
1试验培养基
表4：试验培养基汇总
Figure BDA0002322775490000091
Figure BDA0002322775490000101
Figure BDA0002322775490000111
2试验样品
2.1菌液制备
取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和大肠埃希菌的新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度适宜的菌悬液。
2.2供试液制备
取双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌和蜡样芽孢杆菌的新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度适宜的混合菌悬液。
2.3稀释
2.3.1试验组：取9.9mL稀释液，加入供试液0.1mL，再分别加入上述菌悬液0.1mL，混匀。
2.3.2供试品对照组：取稀释液10mL，加入供试液0.1mL，混匀。
2.3.3菌液对照组：取稀释液10mL，按试验组操作分别加入上述菌悬液0.1mL，混匀。
3操作
分别接种试验组0.1mL于TSB1、TSB2、TSB3中，接种供试品对照组和枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的试验组各0.1mL于TSB12、TSB13、TSB14中，接种上述试验组、供试品对照组和菌液对照组各0.1mL于上述其他培养基中，混匀培养。
4试验结果
4.1阻断抑菌物质生成效果确认
已知甘油、蛋白酶K和胰蛋白酶虽不能抑制蜡样芽孢杆菌的生长，但可以抑制由蜡样芽孢杆菌产生的抑菌物质活性。现检测液体培养基的浊度，比较接种于TSB中的菌液浊度，结果如表5和图1所示。
表5：培养基浊度
Figure BDA0002322775490000112
Figure BDA0002322775490000121
根据浊度检测结果可知，在液体培养条件下，因TSB培养基中营养成分较丰富，目的菌生长旺盛，无法直接观察到试验菌的生长情况，亦无法判断甘油、蛋白酶K或是胰蛋白酶对目的菌产生的抑菌物质的作用。
4.2抑菌剂抑菌效果确认
已知三聚磷酸钠和焦磷酸钠的浓度分别为0.2g/100mL和0.3g/100mL时具有抑菌效果，现测试3种抑菌剂分别对目的菌和试验菌的抑菌效果。通过检测液体培养基的浊度，与接种了菌液的TSB浊度进行比较，初步判断抑菌效果如表6和图2所示。
表6：抑菌剂对不同菌种的抑制效果
Figure BDA0002322775490000122
Figure BDA0002322775490000131
根据浊度检测结果可知，三聚磷酸钠对铜绿假单胞菌具有生长抑制作用，且当其浓度升高至0.5g/100mL时，对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的生长也出现了一定的抑制性。而焦磷酸钠不仅对铜绿假单胞菌具有生长抑制作用，还对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有生长抑制作用。当其浓度升高至0.5g/100mL时，同样对白色念珠菌的生长也出现了一定的抑制性，且该浓度对目的菌也表现出了一定的生长抑制性。
而发明人却意外地发现，随着脱氧胆酸钠含量的升高，抑制目的菌生长的影响会越来越大，但对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的抑制效果不显著。
在上述液体条件下，添加目的菌与试验菌共生培养，观察其菌液变化，如表7和图3所示。
表7：抑菌剂对不同菌种的抑制效果
Figure BDA0002322775490000132
从表7和图3的数据可知，当脱氧胆酸钠浓度升高时，可对目的菌生长产生显著抑制作用，同时，除白色念珠菌外，其他试验菌仍可显著生长。当脱氧胆酸钠浓度为0.0975g/L时，不仅对目的菌存在生长抑制，且白色念珠菌仍可缓慢生长，故在广谱培养基中添加0.0975g/L左右的脱氧胆酸钠，可以在抑制目的菌生长的同时，进行试验菌检查用。
4.3结论
综上所述，虽甘油、蛋白酶K、胰蛋白酶、三聚磷酸钠和焦磷酸钠对目的菌生长均无显著抑制作用，且如三聚磷酸钠和焦磷酸钠一类的物质会抑制试验菌的生长效果。而脱氧胆酸钠不仅对目的菌表现出显著的抑制效果，且并不会完全抑制试验菌的生长。
实施例3
现有市场上含有蜡样芽孢杆菌活性菌的活菌制剂，按照“中国药典(2015版)四部通则<1101>配方TSA”选用规定培养基进行产品杂菌检查项下的微生物计数时，无法排除目的菌的干扰，因此，需寻找一种能够抑制目的菌(活菌制剂中作为活性成分的菌)的物质，添加到检查用培养基中进行抑菌效果的确认。
基于实施例1所描述的对现有抑菌剂的筛选和认识，发明人在现有TSA培养基的基础上，添加可能性的抑菌剂并调整抑菌剂的浓度，来获得最适于在TSA培养基中添加且能实现活菌制剂中检测需求的抑菌剂和抑菌剂浓度。
1.试验材料
TSA琼脂培养基(基于1L的水，溶解有15g胰酪胨、15g琼脂、5g大豆木瓜蛋白酶水解物、5g氯化钠)、0.9％无菌氯化钠溶液、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、脱氧胆酸钠、双歧杆菌四联活菌片、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和白色念珠菌。
2.试验内容与方法
2.1试验培养基
表8：试验培养基汇总
Figure BDA0002322775490000141
Figure BDA0002322775490000151
2.2试验样品
2.2.1菌液制备
取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和白色念珠菌的新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度适宜的菌悬液。
2.2.2供试液制备
以双歧杆菌四联活菌片为例，取双歧杆菌四联活菌片，用0.9％无菌氯化钠溶液溶解，制成1:10供试液。
2.2.3稀释
2.2.3.1试验组：取上述供试液10mL，分别加入上述菌悬液0.1mL，混匀。
2.2.3.2供试品对照组：取上述供试液10mL，以稀释液代替菌液同试验组操作。
2.2.3.3菌液对照组：取10mL稀释液替代供试液，按试验组操作分别加入上述菌悬液0.1mL，混匀。
2.3操作
取上述培养基，分别接种试验组、供试品对照组和菌液对照组各0.1mL，涂布培养，每一试验样品对应的培养基均制备3个平皿。
3.试验结果
3.1培养基适用性确认
以改良培养基上的菌落平均数与TSA培养基上的菌落平均数的比值为依据，判断改良培养基的适用性，要求菌落平均数比值在0.5-2.0范围内，即回收率达到50-200％。
表9：培养基适用性结果
Figure BDA0002322775490000152
Figure BDA0002322775490000161
根据表9和图4试验结果可知，上述改良培养基均能提供铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和白色念珠菌的生长，但在一定的抑菌剂浓度下对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长存在一定的抑制性。改良培养基1-4号均能提供金黄色葡萄球菌的生长，其中，TSA改良4号培养基的培养效果尤为显著。能够提供枯草芽孢杆菌生长的培养基有TSA改良3号培养基、TSA改良5号培养基、TSA改良6号培养基、TSA改良7号培养基和TSA改良8号培养基，其余培养基均不适合培养枯草芽孢杆菌。
其中，TSA改良3号培养基对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和白色念珠菌的回收率分别达到93.6％、122.6％、62.2％、106.1％和87.8％；TSA改良5号培养基对各供试菌的回收率分别达到102.7％、91.9％、91.9％、108.5％和123.2％；TSA改良7号培养基对各供试菌的回收率分别达到97.3％、75.8％、89.2％、101.2％和106.1％。
3.2培养基对目的菌抑制性确认
以(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)与菌液对照组菌落数的比值为依据，判定改良培养基是否适用于活菌制剂的检查，要求比值应在0.5-2.0范围内，即回收率达到50-200％。
表10：培养基对目的菌的抑制效果
Figure BDA0002322775490000162
Figure BDA0002322775490000171
结合表10和图5的分析结果，比较在添加双歧杆菌四联活菌片的情况下，TSA改良3号培养基、TSA改良5号培养基、TSA改良6号培养基、TSA改良7号培养基和TSA改良8号培养基对目的菌和试验菌(铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌)的生长影响情况，结果发现仅TSA改良6号培养基能够抑制双歧杆菌四联活菌片，同时不影响铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和白色念珠菌的生长。但TSA改良6号培养基对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的生长存在部分的抑制作用；而TSA改良7号培养基则对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长存在部分的抑制作用。TSA改良8号培养基可在抑制双歧杆菌四联活菌片的同时，保证所述试验菌的回收率。
而其他改良培养不是对双歧杆菌四联活菌片中的目的菌无抑制作用，导致无法识别或无法促进试验菌生长；就是本身对试验菌存在抑制作用。其中，上述3.1中所述的TSA改良3号培养基和TSA改良5号培养基均因无法抑制目的菌生长而不适用于本试验。
实施例4
发明人以实施例3所筛选出的8号改良培养基检测思连康的双歧杆菌四联活菌片，同样该培养基可以抑制目的菌的生产，实现对试验菌的检测。实验结果如图6所示。其中，A为TSA培养基接种思连康双歧杆菌四联活菌制剂菌的培养照片，B为TSA培养基接种思连康双歧杆菌四联活菌制剂菌和试验菌的培养照片，C为8号改良培养基接种思连康双歧杆菌四联活菌制剂菌的培养照片，D为8号改良培养基接种思连康双歧杆菌四联活菌制剂菌和铜绿假单胞菌的培养照片，E为8号改良培养基接种思连康双歧杆菌四联活菌制剂菌和金黄色葡萄球菌的培养照片，F为8号改良培养基接种思连康双歧杆菌四联活菌制剂菌和枯草芽孢杆菌的培养照片，G为8号改良培养基接种思连康双歧杆菌四联活菌制剂菌和大肠埃希菌的培养照片，H为8号改良培养基接种思连康双歧杆菌四联活菌制剂菌和白色念珠菌的培养照片。由图6结果可以看出，8号改良培养基可抑制思连康的双歧杆菌四联活菌制剂目的菌的生长，而对阳性菌无明显抑制作用，可实现思连康的双歧杆菌四联活菌制剂中试验菌(如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌和白色念珠菌)的检测。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种培养基，所述培养基用于活菌制剂中的杂菌检测，其特征在于，包括：无乳糖培养基质以及脱氧胆酸钠或其立体异构体、互变异构体，所述无乳糖培养基质包括胰酪胨、大豆木瓜蛋白酶水解物和氯化钠。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述活菌制剂中至少包括芽孢杆菌活性菌。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述芽孢杆菌活性菌包括选自蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的至少之一。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述微生态活菌制剂中至少包括蜡样芽孢杆菌。
5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述杂菌包括选自铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的至少之一。
6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述脱氧胆酸钠在所述培养基中的浓度为0.03-0.25g/L，优选0.07-0.15g/L，更优选0.1～0.15g/L。
7.一种培养基，所述培养基用于活菌制剂中的杂菌检测，所述杂菌包括选自枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的至少之一，其特征在于，基于1L水，所述培养基包括：13～17g胰酪胨、3～7g氯化钠、3～7g大豆木瓜蛋白酶水解物以及0.03-0.25g的脱氧胆酸钠，所述培养基的pH为7.1～7.5；
优选地，所述脱氧胆酸钠为0.07-0.15g，更优选地，所述脱氧胆酸钠为0.1～0.15g。
8.一种对活菌制剂中的杂菌进行检测的方法，其特征在于，包括：
(1)将活菌制剂供试液接种在权利要求1～7任一项所述培养基中；
(2)将接种有活菌制剂供试液的培养基在适于待检菌落生长的条件下进行培养，以便获得待检菌落；
(3)将待检菌落进行计数处理，以便获得待检菌落的数量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述活菌制剂供试液是通过将活菌制剂溶解在0.9％的无菌氯化钠溶液中获得的；
任选地，所述供试液中活菌制剂的质量与0.9％的无菌氯化钠溶液的体积比为1g：9mL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，接种的所述供试液的体积为90～110μL；
任选地，所述培养是在30～37℃的条件下进行至少2天，优选3-5天。
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