CN112980916A - 乳品中痕量金黄色葡萄球菌活菌的快速定量检测方法及试剂盒 - Google Patents
乳品中痕量金黄色葡萄球菌活菌的快速定量检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
一种乳品中痕量金黄色葡萄球菌活菌的快速灵敏定量检测方法及试剂盒。采用特异性免疫荧光抗体标记金黄色葡萄球菌，并辅以膜选择通透性荧光材料来标记区分死菌和活菌，再进行流式分析技术检测，通过计数不同荧光信号，根据本发明得到的金黄色葡萄球菌在乳品中培养增菌的数学公式，计算得到乳制品中金黄色葡萄球菌活菌的浓度。本发明的试剂盒具有准确定量、特异性强、灵敏度高、检测时间短、可区分死活菌的优点。
Description
技术领域：
本发明属于食品微生物检测领域，涉及乳品中痕量金黄色葡萄球菌的快速灵敏定量检测方法及试剂盒。
背景技术：
金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之一。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。GB 29921-2013《食品中致病菌限量》中金黄色葡萄球菌作出来明确规定，限量为100CFU/g(mL)。因此能够快速准确的定量检测出食品和水中金黄色葡萄球菌活菌，对食品安全和保障人民健康具有非常重要的意义。
传统培养法检测金黄色葡萄球菌耗时费力，需要54小时以上时间才能完成检测。
现有的的快速检测技术存在以下缺点：
1、不能区分死菌和活菌
众所周知，只有活菌才有致病性，因此如果不清楚活菌量，即使是定量检测，也很难估计该菌的感染程度。
但目前国内外主流技术，包括免疫学方法、分子生物学方法、液相芯片法和流式计数法等。不仅检测时间仍然较长，而且难以区分死活菌。
因为，免疫学方法是通过抗原抗体相互反应的原理，它只能检测总的细菌抗原蛋白；而分子生物学方法是通过基因扩增原理，只能检测总的细菌核酸；液相芯片法是通过抗体捕获细菌抗原再通过抗体标记抗原进行检测，只能检测得出细菌表面抗原浓度；先前建立的流式计数法只能通过抗体捕获细菌，再通过细菌核酸染料进行标记，只能检测得到总的细菌浓度。以上方法均不能区分死菌和活菌。
2、检测灵敏度达不到要求
国标中要求乳品中金黄色葡萄球菌限量为10～100CFU/mL(g)，现有液相芯片法和流式计数法的检测限都在103CFU/mL以上，无法满足检测的基本需要。
比如，中国专利CN201711457774.7，用微滴数字PCR快速检测纯培养的金黄色葡萄球菌，将金黄色葡萄球菌阳性成分DNA为模板，按照微滴数字PCR反应体系和反应条件，进行微滴数字PCR反应，检测出金黄色葡萄球菌阳性基因有明显扩增，且扩增终点荧光信号大于或等于阈值记为阳性拷贝，根据阳性拷贝数值判定结果，实现对金黄色葡萄球菌的检测。但是，该方法检测到的金黄色葡萄球菌是死菌和活菌的总浓度。此外，该专利的检测限是103CFU/mL，却无法检出低浓度的细菌。
因此，快速定量检测，灵敏度高(检测限达到10CFU/mL(g))，且能检出活菌数，是金黄色葡萄球菌的实际需要，也是技术难点。
发明内容：
本发明的第一目的是提供一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速定量检测方法，即，该方法必须能够区分死活菌，且检测限可以达到10CFU/mL(g)的灵敏程度。
本文所称的“乳品”，包括乳及乳制品。
本发明的第二目的是提供一种快速定量检测乳品中金黄色葡萄球菌的试剂盒。
本方法具有两个技术关键点：一是如何特异地识别痕量金黄色葡萄球菌，二是如何准确区分金黄色葡萄球菌死活菌。
针对上述问题，本发明人进行了如下工作：
采用增菌悬液将乳品中的金黄色葡萄球菌进行增菌(浓度约为10CFU/mL，100CFU/mL，1000CFU/mL，10000CFU/mL，100000CFU/mL)，并对其进行平板计数。然后对上述不同浓度的菌悬液进行37℃培养，并分别再3、4、5、6小时进行一次平板计数。从而确定增菌时间为5小时。
使用两种典型的金黄色葡萄球菌(ATCC 6538P和ATCC 25922)，分别人工添加到牛乳和乳粉中，得到浓度约为10、100、1000、10000、100000CFU/mL或CFU/g的人工污染样本，并对其进行平板计数。然后对上述不同浓度的样品进行37℃培养5小时，并平板计数。从而确定乳品中金黄色葡萄球菌在培养前和培养后的浓度关系，绘制响应曲线，得到回归方程公式如下。
log X＝1.0271log Y+2.7606
式中，
Y为待测样品中金黄色葡萄球菌的原始浓度，CFU/mL(g)；
X为金黄色葡萄球菌增菌后的浓度，CFU/mL；
使用蛋白酶K和Triton X-100，分离纯化上述人工污染样本中的细菌，并对其回收率和回收得到细菌活性进行了验证。
采用了偶联有绿色荧光染料的金黄色葡萄球菌抗体，对金黄色葡萄球菌进行特异性标记，采用了具有膜选择通透性的红色荧光染料，对死亡的金黄色葡萄球菌进行荧光标记。并对其死活菌染色的准确性进行了验证。并优化了金黄色葡萄球菌双荧光标记条件。
据此，本发明首次建立了一种采用流式分析技术快速灵敏定量检测乳品中痕量金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征是：在进行检测之前，先对待检样品进行前处理；所述前处理是进行增菌和纯化处理，使金黄色葡萄球菌数量增加并且从乳品中分离出来。
所述增菌，方法是将待测样品加入增菌悬液，37℃培养5h，然后过滤，收集滤液。
可以使用本领域技术人员常用的各种培养液作为增菌悬液。
优选的增菌悬液配方是：蛋白胨3～30g/L，牛肉粉0.5～10g/L，氯化钠60～80g/L，；pH 7.2～7.6。
所述纯化，方法是对培养后的样品液，使用蛋白酶K和Triton X-100，将金黄色葡萄球菌从样本中分离，从而得到纯化的样品菌悬液。
所述检测，是采用荧光双标记金黄色葡萄球菌，再进行流式分析技术检测；通过计数不同荧光信号，直接获得金黄色葡萄球菌活菌的浓度。
所述荧光双标记，是进行特异性免疫荧光抗体标记，并辅以膜选择通透性荧光染料标记区分死菌和活菌。
所述抗体是荧光发射光谱在501nm～540nm的绿色荧光染料通过化学基团交联的金黄色葡萄球菌多克隆抗体，可以特异性标记鉴定特异性标记金黄色葡萄球菌；所述膜选择通透性荧光染料是荧光发射光谱在601nm～640nm的红色荧光染料，可以标记死的金黄色葡萄球菌。
所述区分死菌和活菌，方法如下：
采用上述Gr-Ab对金黄色葡萄球菌进行特异性标记，，采用上述膜选择通透性红色荧光染料Rd将死亡的细菌进行标记，最后通过流式分析仪的荧光通道进行检测。
比如，可以在纯化的菌悬液中加入偶联有绿色荧光染料的金黄色葡萄球菌抗体(Gr-Ab)和红色的膜选择通透性染料(Rd)，混匀后孵育。
如果仅检测到绿色荧光，则判定为检测到的细菌是金黄色葡萄球菌活菌；
如果同时检测到红色和绿色两种荧光，则判定为检测到的细菌是金黄色葡萄球菌死菌；
如果未检测到绿色荧光，则判定为不存在金黄色葡萄球菌。
所以，通过上述方法，即可完成金黄色葡萄球菌死活菌的定性定量检测。
所述流式分析仪检测：检测参数设定如下：激发光分别为450～500nm，分析速度为1～15μL/min，检测时间为15～300s，通过双荧光通道，分析计算培养后的金黄色葡萄球菌活菌浓度X。
所述分析计算，按本领域常规方法，通常首先通过流式分析仪得出金黄色葡萄球菌个数和分析样品体积，从而计算得出流式分析仪检测出的金黄色葡萄球菌的最终浓度，然后再根据下列公式计算得到待测样品中金黄色葡萄球菌活菌的原始浓度。
log(10X)＝1.0271log Y+2.7606
式中，
Y为待测样品中金黄色葡萄球菌的原始浓度，CFU/mL(g)；
X为流式分析仪检测出的金黄色葡萄球菌增菌后的浓度，CFU/mL；
以下是本发明一次实际检测的具体操作。
1、待测样品的增菌富集：
将25mL或25g待测样品加入225mL增菌悬液，恒温震荡培养箱内37℃培养5h。
2、待测样品的过滤：
采用2.7μm～15μm孔径的滤膜对待测样品进行过滤，保留滤液。
3、样品中金黄色葡萄球菌的纯化菌；
将2.5mg的蛋白酶K和500μL的0.1％Triton X-100加入1ml的滤液并在37℃孵育30分钟来出去样本中的蛋白质，加入1.5mL的PBS并混匀；接下来，样品12000×g离心10min，并弃去上层脂肪和液体，保留底部的沉淀；最后，加入1mL的PBS重悬沉淀，转移至新的离心管中，得到纯化的样品菌悬液。
4、纯化的菌悬液加入Gr-Ab和终浓度为1μg/mL的Rd，混匀后避光孵育15min。
5、流式分析仪检测：流式分析仪检测参数设定如下：激发光为450～500nm，分析速度为1～15μL/min，检测时间为15～300s，通过FL1和FL3双荧光通道，分析计算金黄色葡萄球菌活菌浓度。
6、结果分析将步骤5检测所得的活菌浓度X值，代入方程公式log(10X)＝1.0271log Y
+2.7606中，所得的Y为待测样品中金黄色葡萄球菌的原始浓度(CFU/mL(g))。
本发明人验证了本检测方法的效果：
采用本方法和平板计数法同时对大量人工污染金黄色葡萄球菌的乳粉和牛乳样品进行检测，并对二者结果进行比较。结果发现：本方法与平板计数方法所得结果有良好的线性关系，说明本方法具有良好的准确性，且方法的检测下限为10CFU/g或10CFU/mL。
根据上述本发明建立的检测方法，本发明还提供了一种乳品中痕量金黄色葡萄球菌活菌快速灵敏准确定量检测试剂盒，所述试剂盒包括以下成分：
金黄色葡萄球菌ATCC 6538P标准菌株，冻干粉状，存于棕色西林瓶；
表皮葡萄球菌CICC 102942标准菌株，冻干粉状，存于棕色西林瓶；
2.7μm～15μm孔径的滤膜；
蛋白酶K，-20℃存于避光EP管；
Triton X-100，存于试剂瓶；
金黄色葡萄球菌免疫荧光抗体，存于避光EP管；
膜选择通透性荧光染料，存于避光EP管；
增菌液(蛋白胨3～30g/L，牛肉粉0.5～10g/L，氯化钠60～80g/L，；pH 7.2～7.6)，存于避光塑料瓶。
用本发明的试剂盒进行乳品金黄色葡萄球菌检测的操作方法，其特征为：
1、待测样品的增菌富集：
将25mL或25g待测样品加入225mL增菌悬液，恒温震荡培养箱内37℃培养5h。
2、待测样品的过滤：
采用2.7μm～15μm孔径的滤膜对待测样品进行过滤，保留滤液。
3、样品中金黄色葡萄球菌的纯化菌；
将2.5mg的蛋白酶K和500μL的0.1％Triton X-100加入1ml的滤液并在37℃孵育30分钟来出去样本中的蛋白质，加入1.5mL的PBS并混匀；接下来，样品12000×g离心10min，并弃去上层脂肪和液体，保留底部的沉淀；最后，加入1mL的PBS重悬沉淀，转移至新的离心管中，得到纯化的样品菌悬液。
4、纯化的菌悬液加入终浓度为1μg/mL的Gr-Ab和终浓度为1μg/mL为Rd，混匀后避光孵育5～15min。
5、流式分析仪检测：流式分析仪检测参数设定如下：激发光为450～500nm，分析速度为1～15μL/min，检测时间为15～300s，通过FL1和FL3荧光通道，分析计算金黄色葡萄球菌浓度。
6、结果分析将步骤5检测所得的活菌浓度X值，代入方程公式log(10X)＝1.0271log Y
+2.7606中，所得的Y为待测样品中金黄色葡萄球菌的原始浓度(CFU/mL(g))。
经实验证实本方法不仅可定量检测待乳品中金黄色葡萄球菌数量是否符合国家标准，还可以定量检测出金黄色葡萄球菌死活菌的精确浓度(见实施例3)。
本发明具有以下创新和优点：
1、检测灵敏度高
通过增加增菌和纯化等前处理方法，金黄色葡萄球菌的检测限低至10CFU/g或10CFU/mL。
2、同时检测金黄色葡萄球菌是否存在以及其死活菌的精确浓度
通过采用Gr-Ab和Rd对待检的金黄色葡萄球菌进行双荧光标记，可以同时检测乳品中金黄色葡萄球菌是否存在以及其死活菌的精确浓度。
直接针对金黄色葡萄球菌进行染色，通过带有绿色荧光的免疫荧光抗体只特异性标记金黄色葡萄球菌，再通过红色的膜选择通透性染料标记死菌(因为只有死菌才会发生细胞壁破裂，导致红色荧光染料进入细胞后染色)。若一个细菌同时被绿色和红色标记，则为死的金黄色葡萄球菌；若一个细菌仅被绿色标记，则为活的金黄色葡萄球菌。
3、操作简单便捷，耗时短，大多数样品均可在6h内完成检测。
4、试剂盒中附带有金黄色葡萄球菌标准菌株、表皮葡萄球菌标准菌株，可以最大程度上保证检测结果的精确性和准确性。
附图说明
图1是实施例1中金黄色葡萄球菌双重荧光标记后，流式分析仪检测结果；
图2是实施例2中阳性对照组菌株和阴性对照组菌株分别和Gr-Ab孵育后，流式分析仪检测结果；
图3是实施例3中流式分析仪检测不同死活菌浓度比例的金黄色葡萄球菌菌悬液的流式分析仪检测结果的数据分析结果；
图4是实施例4中乳品中金黄色葡萄球菌经过不同时间增菌后，数量提高的倍数；
图5是实施例5中乳品中金黄色葡萄球菌增菌前和5小时增菌后的数量关系；
图6是实施例6中本方法与平板法检测牛乳中金黄色葡萄球菌的结果；
图7是实施例7中本方法与平板法检测乳粉中金黄色葡萄球菌的结果；
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的实验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中的条件，或者按照制造厂商的建议条件。实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可很容易从公开商业渠道获得。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量标书，表明在不改动基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
实施例1金黄色葡萄球菌的荧光标记
一、材料与方法
1.将培养好的金黄色葡萄球菌菌悬液8000×g离心5min，弃上清，使用无菌的PBS重悬，得到活菌菌悬液。吸取1mL活菌菌悬液，加入异丙醇(最终浓度70％)处理30min，离心弃上清，使用无菌的PBS重悬，得到死菌菌悬液。
2.取6份适宜浓度的金黄色葡萄球菌菌液，按照表1中的方法进行处理。PI染色的最终浓度为1μg/mL，反应时间为15min。荧光抗体的最终浓度为1μg/mL，孵育时间为15min。Gr-Ab和Rd与金黄色葡萄球菌的反应同时在避光环境下进行。然后将处理完毕的六份菌液用流式分析仪进行检测。
表1金黄色葡萄球菌的荧光标记
二、实验结果
将不同条件下的金黄色葡萄球菌用流式分析仪进行检测，所得结果如图1所示。结果表明，流式检测的金黄色葡萄球菌死活菌的比例与实际值接近，结果显示Gr-Ab和Rd共同实现金黄色葡萄球菌活菌的标记行之有效。
三、实验结论
本发明的流式分析方法可以检测经过双荧光标记的金黄色葡萄球菌死活菌。
实施例2金黄色葡萄球菌抗体特异性的验证
一、材料与方法
1.金黄色葡萄球菌标准菌株，编号ATCC 6538P；金黄色葡萄球菌标准菌株，编号ATCC27217；金黄色葡萄球菌金黄亚种标准菌株，编号ATCC 29213；金黄色葡萄球菌标准菌株，编号ATCC 25923；金黄色葡萄球菌标准菌株，编号ATCC 6538；金黄色葡萄球菌标准菌株，编号CICC 10786；金黄色葡萄球菌标准菌株，编号CICC 10787；金黄色葡萄球菌标准菌株，编号CICC 10788；金黄色葡萄球菌标准菌株，编号CICC 10789；金黄色葡萄球菌标准菌株，编号CICC 10790；鼠伤寒沙门氏菌标准菌株，编号ATCC 13311；甲型副伤寒沙门氏菌标准菌株，编号CICC 21501；阿贡纳沙门氏菌标准菌株，编号PTA-5238；阿贡纳沙门氏菌标准菌株，编号CICC 21586；波那雷恩沙门氏菌标准菌株，编号CICC 21491；病牛沙门氏菌标准菌株，编号CICC 21499；肯塔基沙门氏菌标准菌株，编号CICC 21488；布伦登卢普沙门氏菌标准菌株，编号ATCC 700136；鸭沙门氏菌标准菌株，编号CICC 21498；火鸡沙门氏菌标准菌株，编号CICC 21526；火鸡沙门氏菌标准菌株，编号CICC 21511；纽因吞沙门氏菌标准菌株，编号ATCC 29628；山夫登堡沙门氏菌标准菌株，编号ATCC 8400；阿巴特图沙门氏菌标准菌株，编号ATCC 35640；古巴沙门氏菌标准菌株，编号ATCC 12007；阿德莱沙门氏菌标准菌株，编号ATCC 10718；肠沙门氏菌肠亚种标准菌株，编号CICC 21513；肠沙门氏菌肠亚种标准菌株，编号ATCC 13076；猪霍乱沙门氏菌标准菌株，编号ATCC 10708；海德尔堡沙门氏菌标准菌株，编号ATCC 8326；鼠伤寒沙门氏菌标准菌株，编号CICC 21483；鼠伤寒沙门氏菌标准菌株，编号ATCC 19585；肠沙门氏菌肠亚种猪霍乱血清型标准菌株，编号CICC 21493；肠沙门氏菌肠亚种婴儿血清型标准菌株，编号CICC 21482；大肠杆菌标准菌株，编号ATCC 25922；大肠杆菌标准菌株，编号ATCC 44102；大肠杆菌标准菌株，编号ATCC 10798；大肠杆菌O157:H7标准菌株，编号CICC 21530；大肠杆菌标准菌株，编号ATCC 13706；阴沟肠杆菌标准菌株，编号ATCC 13047；产气肠杆菌标准菌株，编号ATCC 13048；枯草芽胞杆菌标准菌株，编号ATCC 6633；弗氏柠檬酸杆菌标准菌株，编号ATCC 43864；霍乱弧菌标准菌株，编号CICC23794；副溶血弧菌标准菌株，编号ATCC 17802；马红球菌标准菌株，编号ATCC 6939；单增李斯特氏菌标准菌株，编号CICC 21540；单增李斯特氏菌标准菌株，编号ATCC 19111；表皮葡萄球菌标准菌株，编号ATCC 12228以上菌株均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心和美国菌种保藏中心。
2.对上述所有菌株进行复壮与扩增，并稀释至适宜浓度(大约106CFU/mL)。
3.将浓度为1μg/mL的Gr-Ab分别同时加入上述菌悬液，避光孵育15min。然后用流式分析仪进行检测。
二、实验结果
将偶联有绿色荧光染料的金黄色葡萄球菌菌抗体(Gr-Ab)与不同菌株的菌悬液进行反应，然后又流式分析仪进行检测其特异性，结果如表1和图2所示，仅金黄色葡萄球菌检测到了绿色荧光，表明金黄色葡萄球菌菌多克隆抗体具有良好的特异性。
三、实验结论
本发明的检测方法对于金黄色葡萄球菌检测具有非常强的特异性。
表1金黄色葡萄球菌菌抗体的特异性实验结果
实施例3金黄色葡萄球菌死活菌检测准确性的验证
一、材料与方法
1.将培养好的金黄色葡萄球菌ATCC 6538P菌悬液12000×g离心5min，弃上清，使用无菌的PBS重悬，得到活菌菌悬液。吸取1mL活菌菌悬液，加入异丙醇(最终浓度70％)处理30min，离心弃上清，使用无菌的PBS重悬，得到死菌菌悬液。
2.将金黄色葡萄球菌死活菌菌悬液以不同的体积比混合(0/10，1/9，5/5，9/1，10/0),然后用流式分析仪检测样品。
二、实验结果
将不同浓度比的金黄色葡萄球菌死活菌混合均匀，并用流式分析仪进行检测，所得结果如图3所示。结果表明，流式检测的金黄色葡萄球菌死活菌的比例与实际值接近。
三、实验结论
本发明的方法可以准确定量检测液体中的单增李斯特菌死活菌。
实施例4金黄色葡萄球菌增菌培养时间
一、材料与方法
1.将培养好的金黄色葡萄球菌ATCC 6538P菌悬液8000×g离心5min，弃上清，使用无菌的PBS重悬，并分别人工添加到牛乳和乳粉中，得到浓度约为10、100、1000、10000、100000CFU/mL或CFU/g的样品，并对其进行平板计数。
2.分别将25mL或25g上述样品加入225mL增菌悬液，恒温震荡培养箱内37℃培养，并分别再3、4、5、6小时进行一次平板计数。
二、实验结果
样本的原始浓度，和3、4、5、6小时培养后的浓度如图4所示。结果表明，金黄色葡萄球菌浓度随着培养时间增长，当培养5小时候，其浓度高于流式分析仪的最低检测限。因此本方法的增菌时间确认为5小时。
三、实验结论
本发明的最佳增菌为5小时。
实施例5乳品中金黄色葡萄球菌增菌前后的关系
一、材料与方法
1.将培养好的金黄色葡萄球菌ATCC 6538P菌悬液8000×g离心5min，弃上清，使用无菌的PBS重悬，并分别人工添加到牛乳和乳粉中，得到浓度约为10、100、1000、10000、100000CFU/mL或CFU/g的样品，并对其进行平板计数。
2.将培养好的金黄色葡萄球菌ATCC 25922菌悬液8000×g离心5min，弃上清，使用无菌的PBS重悬，并分别人工添加到牛乳和乳粉中，得到浓度约为10、100、1000、10000、100000CFU/mL或CFU/g的样品，并对其进行平板计数。
3.分别将步骤1和步骤2中的样品，分别取25mL或25g加入225mL增菌悬液，恒温震荡培养箱内37℃培养5，然后进行平板计数。
二、实验结果
样本的原始浓度，和5小时培养后的浓度如图5所示。结果表明，乳品中金黄色葡萄球菌增菌前和增菌后的关系可以通过以下公式进行计算：
log(10X)＝1.0271log Y+2.7606
式中，
Y为待测样品中金黄色葡萄球菌的原始浓度，CFU/mL(g)；
X为流式分析仪检测出的金黄色葡萄球菌浓度，CFU/mL；
三、实验结论
本发明建立的数学公式可以准确反映金黄色葡萄球菌增菌前后的浓度关系。
实施例6本发明在检测牛乳中金黄色葡萄球菌含量的应用
一、材料与方法
1.将培养好的金黄色葡萄球菌ATCC 6538P和ATCC 25922菌悬液8000×g离心5min，弃上清，使用无菌的PBS重悬，并分别随机人工添加到牛乳中，得到一系列不同浓度的样品，并对其进行平板计数。
2.将25mL人工污染的牛乳样品加入225mL增菌悬液，恒温震荡培养箱内37℃培养5h。
3.采用3μm孔径的滤膜对待测样品进行过滤，保留滤液。将2.5mg的蛋白酶K和500μL的0.1％Triton X-100加入1ml的滤液并在37℃孵育30分钟来出去样本中的蛋白质，加入1.5mL的PBS并混匀；接下来，样品12000×g离心10min，并弃去上层脂肪和液体，保留底部的沉淀；最后，加入1mL的PBS重悬沉淀，转移至新的离心管中，得到纯化的样品菌悬液。
4、纯化的菌悬液加入终浓度为1μg/mL的Gr-Ab和终浓度为1μg/mL的Rd，混匀后避光孵育5～15min。
5、流式分析仪检测：流式分析仪检测参数设定如下：激发光为450～500nm，分析速度为1～15μL/min，检测时间为15～300s。通过FL1和FL3双荧光通道，分析计算金黄色葡萄球菌活菌浓度。
6、结果分析将步骤5检测所得的活菌浓度X值，代入方程公式log(10X)＝1.0271log Y
+2.7606中，所得的Y为待测样品中金黄色葡萄球菌的原始浓度CFU/mL(g)。
二、实验结果
人工污染的牛乳样本的原始浓度，以及5小时培养后的浓度如图6所示。
三、实验结论
本发明的方法可以准确准确定量快速检测牛乳中金黄色葡萄球菌浓度。
实施例7本发明在检测乳粉中金黄色葡萄球菌含量的应用
一、材料与方法
1.将培养好的金黄色葡萄球菌ATCC 6538P和ATCC 25922菌悬液8000×g离心5min，弃上清，使用无菌的PBS重悬，并分别随机人工添加到乳粉中，得到一系列不同浓度的样品，并对其进行平板计数。
2.将25g人工污染的乳粉样品加入225mL增菌悬液，恒温震荡培养箱内37℃培养5h。
3.采用3μm孔径的滤膜对待测样品进行过滤，保留滤液。将2.5mg的蛋白酶K和500μL的0.1％Triton X-100加入1ml的滤液并在37℃孵育30分钟来出去样本中的蛋白质，加入1.5mL的PBS并混匀；接下来，样品12000×g离心10min，并弃去上层脂肪和液体，保留底部的沉淀；最后，加入1mL的PBS重悬沉淀，转移至新的离心管中，得到纯化的样品菌悬液。
4、纯化的菌悬液加入终浓度为1μg/mL的Gr-Ab和终浓度为1μg/mL的Rd，混匀后避光孵育5～15min。
5、流式分析仪检测：流式分析仪检测参数设定如下：激发光为450～500nm，分析速度为1～15μL/min，检测时间为15～300s，通过FL1和FL3双荧光通道，分析计算金黄色葡萄球菌活菌浓度。
6、结果分析将步骤5检测所得的活菌浓度X值，代入方程公式log(10X)＝1.0271log Y
+2.7606中，所得的Y为待测乳粉中金黄色葡萄球菌的原始浓度(CFU/g)。
二、实验结果
人工污染的乳粉样本的原始浓度，以及5小时培养后的浓度如图7所示。
三、实验结论
本发明的方法可以准确准确定量快速检测乳粉乳中金黄色葡萄球菌浓度。
实施例8乳品中痕量金黄色葡萄球菌活菌快速灵敏准确定量检测试剂盒
包括以下成分：
金黄色葡萄球菌ATCC 6538P标准菌株，冻干粉状，存于棕色西林瓶；
表皮葡萄球菌CICC 102942标准菌株，冻干粉状，存于棕色西林瓶；
2.7μm～15μm孔径的滤膜；
蛋白酶K，-20℃存于避光EP管；
Triton X-100，存于试剂瓶；
金黄色葡萄球菌免疫荧光抗体，存于避光EP管；
膜选择通透性荧光染料，存于避光EP管；
增菌液(蛋白胨3～30g/L，牛肉粉0.5～10g/L，氯化钠60～80g/L，；pH 7.2～7.6)，存于避光塑料瓶。
Claims (8)
1.一种快速定量检测出乳品中金黄色葡萄球菌活菌试剂盒，含有以下标准菌株：
金黄色葡萄球菌ATCC 6538P标准菌株；
表皮葡萄球菌CICC 102942标准菌株；
检测方法是：用流式分析仪检测经荧光标记的细菌；计数不同荧光信号，获得活菌的检测浓度，再按以下公式计算被测样品中活菌的原始浓度：
log(10X)＝1.0271log Y+2.7606
式中，
Y为待测样品中金黄色葡萄球菌的原始浓度，CFU/mL(g)；
X为流式分析仪检测出的金黄色葡萄球菌增菌后的浓度，CFU/mL。
2.权利要求1所述的试剂盒，还含有以下成分：
2.7μm～15μm孔径的滤膜；
蛋白酶K，-20℃存于避光EP管；
Triton X-100，存于试剂瓶；
金黄色葡萄球菌免疫荧光抗体，存于避光EP管；
膜选择通透性荧光染料，存于避光EP管；
增菌液，成分为：蛋白胨3～30g/L，牛肉粉0.5～10g/L，氯化钠60～80g/L，；pH7.2～7.6，存于避光塑料瓶。
3.权利要求1所述的试剂盒，所述检测方法是，在进行检测之前，先对待检样品进行前处理；所述前处理是进行增菌、富集和纯化处理。
4.权利要求3所述的试剂盒，所述增菌，是将待测样品加入增菌悬液进行培养，然后过滤，收集滤液；所述富集，是将上述滤液离心，弃去上层液体，保留底部的沉淀；所述纯化，是将上述沉淀加入PBS重悬沉淀，得到纯化的样品菌悬液。
5.权利要求1所述的试剂盒，所述荧光标记，是对副溶血弧菌分别进行特异性免疫荧光抗体标记和膜选择通透性荧光染料标记，区分死菌和活菌。
6.权利要求5所述的试剂盒，所述免疫荧光抗体是荧光发射光谱在501nm～540nm的绿色荧光染料通过化学基团交联的副溶血弧菌多克隆抗体或单克隆抗体；所述膜选择通透性荧光染料是荧光发射光谱在601nm～640nm的红色荧光染料。
7.权利要求1所述的试剂盒，所述流式分析仪的技术指标是：荧光灵敏度<10MESF，颗粒尺寸<40nm，荧光分辨率RSD<2％，样品分析速率>10000events/min。
8.权利要求1所述的试剂盒，所述流式分析仪检测参数如下：分析速度为1～15μL/min，检测时间为15～300s。
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