CN112972430A - 一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统及其制备方法 - Google Patents

一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多糖技术领域，尤其涉及一种牛血清白蛋白‑氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统及其制备方法。该方法制备的纳米载药系统为夹心结构，壳聚糖通过共价键覆盖在石墨烯表面，壳聚糖的外层覆盖有牛血清白蛋白。本发明的制备方法添加了牛血清白蛋白，既改善了材料的药代动力学和药效学性质、优化药物在活细胞中的递送、更好的实现肿瘤靶向性，同时又对氧化石墨烯改性壳聚糖复合材料具有显著的保护作用，进一步提高药物在体内的稳定性；本发明向纳米载体中同时添加了两种抗肿瘤药物，紫杉醇和喜树碱，能够起到协同作用，充分发挥两种药物的药理活性。

Description

一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统及 其制备方法
技术领域
本发明涉及多糖技术领域，尤其涉及一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统及其制备方法。
背景技术
现有抗肿瘤药物存在毒副作用大、吸收效率差等诸多问题。紫杉醇是一种天然的抗肿瘤药物，其水溶性差，吸收效率低，在人体内表现出较大的毒副作用。其原因主要是紫杉醇对肿瘤细胞缺乏靶向性，在人体内会代谢进人各个器官，对心脑血管、肝脏、肾脏系统造成伤害。为此，开发新型的高效载药系统，实现紫杉醇的高效运载和肿瘤靶向性至关重要。
牛血清白蛋白纳米粒作为抗肿瘤药物载体具有显著优势，包括：可有效改善药代动力学和药效学、优化药物在活细胞中的递送、更好的实现肿瘤靶向性等。如中国专利CN106727427A公开的一种牛血清白蛋白包覆紫杉醇脂质纳米粒制剂的制备方法，分为(1)脂质核心(PTX-LNP)的制备；(2)牛血清白蛋白(BSA)包覆载紫杉醇脂质纳米粒(BSA-PTX-LNP)的制备两步。该制备方法中加入十八胺为了增加脂质核心的电荷带正电荷，目的是与带负电荷的牛血清白蛋白通过静电作用相结合。所制备的牛血清白蛋白包覆紫杉醇脂质纳米粒制剂为药物靶向肿瘤载体系统提供了一种新的具有肿瘤细胞靶向的纳米给药系统，提高了抗肿瘤药物对肿瘤部位的靶向及肿瘤杀伤能力。
但是，由于人体血液循环和消化系统极为复杂，对纳米载药系统有极高的要求，牛血清白蛋白作为纳米载药系统的功能仍较为单一，需要与其它载体材料复合改性，以克服人体内复杂的代谢环境，同时实现高的载药效率。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中的问题，提供一种能够高效负载抗肿瘤药物紫杉醇，且对人体内复杂的环境有更好的耐受性，在肿瘤治疗上实现高效、低毒的牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统及其制备方法。
本发明的技术方案是：
一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
⑴氧化石墨烯改性壳聚糖的制备：称取氧化石墨烯和壳聚糖，加入到溶剂一中，升温至25~45℃，超声5~15分钟，搅拌条件下加入缩合剂，在25~45℃下搅拌24~72小时，减压蒸馏至反应液体积为原来的1/4~1/2，加入溶剂二，搅拌20~40分钟，过滤，滤饼用乙醇洗涤后真空干燥，得到氧化石墨烯改性壳聚糖；
⑵牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体的制备：称取牛血清白蛋白和步骤⑴所得的氧化石墨烯改性壳聚糖，加入到溶剂三中，加入乙酸，升温至50~70℃，搅拌10~30分钟，降温至20~30℃，向反应液中加入戊二醛水溶液，搅拌2~4小时，超声分散20~40分钟，过滤，所得固体用洗涤剂洗涤，干燥得牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体；
⑶牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备：称取紫杉醇和喜树碱，加入到二甲亚砜中，搅拌溶解，控制温度在20~30℃，加入步骤⑵所得的牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体，搅拌条件下滴加水，滴加速度为1~3滴/秒，滴加完毕搅拌0.5~1.5小时，超声10~30分钟，得到溶液，将所得溶液用分子量为3500的透析袋透析24~48小时，在-50~-70℃冷冻干燥，得一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统；
所述溶剂一为二甲亚砜或N,N-二甲基甲酰胺；
所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N,N-二异丙基碳二亚胺；
所述溶剂二为乙醇或甲醇；
所述溶剂三为水；
所述戊二醛水溶液的质量浓度为20~40%；
所述洗涤剂为乙醇水混合液，其中乙醇和水的体积比为1~2：1；
其中氧化石墨烯、壳聚糖、溶剂一、缩合剂、溶剂二、乙醇、牛血清白蛋白、溶剂三、乙酸、戊二醛水溶液、洗涤剂、紫杉醇、喜树碱、二甲亚砜、水的质量比为0.2~0.3：1~2：200~300：0.1~0.2：200~300：10~20：0.3~0.8：270~380：0.1~0.4：0.01~0.05：5~10：0.1~0.15：0.1~0.15：50~100：300~400。
优选的，所述壳聚糖平均分子量是5万，脱乙酰度大于85%。
优选的，所述溶剂一为二甲亚砜。
优选的，所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
优选的，所述溶剂二为乙醇。
优选的，所述戊二醛水溶液的质量浓度为25%。
优选的，所述洗涤剂为乙醇和水的混合液，乙醇和水的体积比为1.5：1。
一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统，按照一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备方法制备得到，牛血清白蛋白与氧化石墨烯改性壳聚糖通过戊二醛交联，形成球状结构。
本发明的有益效果为：本发明制备的牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统为夹心结构，壳聚糖通过共价键覆盖在石墨烯表面，壳聚糖的外层覆盖有牛血清白蛋白。
本发明的牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备方法得到的纳米载药系统中添加了氧化石墨烯，氧化石墨烯具有大的平面共轭体系，抗肿瘤药物紫杉醇中的芳香苯环结构易于通过π-π堆积的方式与氧化石墨烯结合，提高纳米材料的载药能力；壳聚糖通过共价键与氧化石墨烯连接，结合更加紧密，对人体内复杂环境的耐受性更好，使药物缓慢释放，能够显著降低紫杉醇的使用剂量，降低毒性；
本发明的制备方法添加了牛血清白蛋白，既改善了材料的药代动力学和药效学性质、优化药物在活细胞中的递送、更好的实现肿瘤靶向性，同时又对氧化石墨烯改性壳聚糖复合材料具有显著的保护作用，进一步提高药物在体内的稳定性；本发明所制备的纳米载药系统粒径均在100nm左右，易于实现纳米药物对肿瘤细胞的被动靶向作用；本发明所制备的纳米载药系统中，壳聚糖上含有大量的氨基，对pH具有敏感性，因此在肿瘤细胞的酸性环境中可实现药物的高效释放；
本发明向纳米载体中同时添加了两种抗肿瘤药物，紫杉醇和喜树碱，能够起到协同作用，充分发挥两种药物的药理活性。
附图说明
图1为紫杉醇药物释放研究实验实验结果；
图2为喜树碱药物释放研究实验实验结果；
图3为透射电镜测定的实施例1制备的纳米载药系统的微观结构形态；
图4为透射电镜测定的实施例2制备的纳米载药系统的微观结构形态；
图5为透射电镜测定的实施例3制备的纳米载药系统的微观结构形态；
图6为原子力显微镜测定的实施例3制备的纳米载药系统的微观结构形态。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、技术特征、发明目的与技术效果易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
实施例1：
⑴氧化石墨烯改性壳聚糖的制备：称取2g氧化石墨烯和10g壳聚糖，加入到2000g二甲亚砜中，升温至25℃，超声5分钟，搅拌条件下加入1g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在25℃下搅拌24小时，减压蒸馏至反应液体积为原来的1/2，加入2000g乙醇，搅拌20分钟，过滤，滤饼用100g乙醇洗涤后真空干燥，得到氧化石墨烯改性壳聚糖；
⑵牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体的制备：称取3g牛血清白蛋白和步骤⑴所得的氧化石墨烯改性壳聚糖，加入到2700g水中，加入1g乙酸，升温至50℃，搅拌10分钟，降温至20℃，向反应液中加入0.1g戊二醛水溶液（质量浓度为20%），搅拌2小时，超声分散20分钟，过滤，所得固体用50g乙醇水混合液（乙醇和水的体积比为1：1）洗涤，干燥得牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体；
⑶牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备：称取1g紫杉醇和1g喜树碱，加入到500g二甲亚砜中，搅拌溶解，控制温度在20~30℃，加入步骤⑵所得的牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体，搅拌条件下滴加3000g水，滴加速度为1滴/秒，滴加完毕搅拌0.5小时，超声10分钟，得到溶液，将所得溶液用分子量为3500的透析袋透析24小时，在-50℃冷冻干燥，得一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统。
实施例2：
⑴氧化石墨烯改性壳聚糖的制备：称取3g氧化石墨烯和20g壳聚糖，加入到3000gN,N-二甲基甲酰胺中，升温至45℃，超声15分钟，搅拌条件下加入2gN,N-二异丙基碳二亚胺，在45℃下搅拌72小时，减压蒸馏至反应液体积为原来的1/4，加入3000g甲醇，搅拌40分钟，过滤，滤饼用200g乙醇洗涤后真空干燥，得到氧化石墨烯改性壳聚糖；
⑵牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体的制备：称取8g牛血清白蛋白和步骤⑴所得的氧化石墨烯改性壳聚糖，加入到3800g水中，加入4g乙酸，升温至70℃，搅拌30分钟，降温至30℃，向反应液中加入0.5g戊二醛水溶液（质量浓度为40%），搅拌4小时，超声分散40分钟，过滤，所得固体用100g乙醇水混合液（乙醇和水的体积比为2：1）洗涤，干燥得牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体；
⑶牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备：称取1.5g紫杉醇和1.5g喜树碱，加入到1000g二甲亚砜中，搅拌溶解，控制温度在30℃，加入步骤⑵所得的牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体，搅拌条件下滴加4000g水，滴加速度为3滴/秒，滴加完毕搅拌1.5小时，超声30分钟，得到溶液，将所得溶液用分子量为3500的透析袋透析48小时，在-70℃冷冻干燥，得一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统。
实施例3：
⑴氧化石墨烯改性壳聚糖的制备：称取2.5g氧化石墨烯和15g壳聚糖，加入到2500g二甲亚砜中，升温至35℃，超声10分钟，搅拌条件下加入1.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在35℃下搅拌48小时，减压蒸馏至反应液体积为原来的1/23，加入2500g乙醇，搅拌30分钟，过滤，滤饼用150g乙醇洗涤后真空干燥，得到氧化石墨烯改性壳聚糖；
⑵牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体的制备：称取5g牛血清白蛋白和步骤⑴所得的氧化石墨烯改性壳聚糖，加入到3200g水中，加入2.5g乙酸，升温至60℃，搅拌20分钟，降温至25℃，向反应液中加入0.3g戊二醛水溶液（质量浓度为25%），搅拌3小时，超声分散30分钟，过滤，所得固体用80g乙醇和水的混合液（乙醇和水的体积比为1.5：1）洗涤，干燥得牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体；
⑶牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备：称取1.2g紫杉醇和1.2g喜树碱，加入到700g二甲亚砜中，搅拌溶解，控制温度在25℃，加入步骤⑵所得的牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体，搅拌条件下滴加3500g水，滴加速度为2滴/秒，滴加完毕搅拌1小时，超声20分钟，得到溶液，将所得溶液用分子量为3500的透析袋透析36小时，在-60℃冷冻干燥，得一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统。
实施例4：
纳米载药系统对紫杉醇和喜树碱的包封率
标准曲线的绘制：分别称取一定量的紫杉醇和喜树碱，用甲醇溶解，并定容至一定浓度，得紫杉醇和喜树碱的储备液。取紫杉醇和喜树碱的储备液稀释至不同的浓度，在高效液相色谱仪上测定不同浓度下样品的峰面积，根据浓度和峰面积做标准曲线。
纳米载药系统中紫杉醇或喜树碱包封率的测定：取实施例制备的纳米载药系统，加入二甲亚砜，超声波破碎，使包裹在纳米载体中的紫杉醇和喜树碱完全释放，离心，取上清液，进样，测定样品的峰面积，并计算紫杉醇或喜树碱的含量，药品包封率的计算公式如下：
包封率=纳米载药系统中药品的测定量/制备纳米载药系统时加入的药品量×100%
测试结果见表1。本发明所制备的纳米载体对紫杉醇和喜树碱均具有较好的包封率，其中对紫杉醇的包封率均在90%左右，对喜树碱的包封率在90%以上。证明本发明的纳米载体可以有效包裹难溶性抗肿瘤药物紫杉醇和喜树碱，从而克服其水溶性差的缺点。
表1.纳米载药系统中紫杉醇和喜树碱的包封率
测试样品 实施例1 实施例2 实施例3
纳米载药系统中紫杉醇的包封率 88.6% 89.5% 91.2%
纳米载药系统中喜树碱的包封率 90.8% 90.3% 91.5%
药物释放研究
取本发明实施例1~3制备的纳米载药系统，用一定量的不同pH值（pH=4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0）的缓冲溶液溶解，置于透析袋中透析24小时，透析液冻干，所得固体用二甲亚砜溶解，超声破碎，采用高效液相色谱法测定其中紫杉醇和喜树碱的含量，研究纳米载药系统的药物释放行为。如图1所示，为紫杉醇药物释放研究实验实验结果，本发明3个实施例制备的纳米载药系统均具有pH敏感性，在肿瘤细胞酸性环境下（pH=4.0~5.0）紫杉醇能够快速释放，而在pH大于5.0时，紫杉醇的释放速率逐渐变慢，pH大于6.0时，几乎不会释放。喜树碱的药物释放行为与紫杉醇类似，如图2所示，为喜树碱药物释放研究实验实验结果，在酸性环境下（pH=4.0~5.0）喜树碱能够快速释放，这说明本发明制备的纳米载药系统对肿瘤细胞酸性环境敏感，能够在肿瘤组织中快速释放，而在正常生理pH条件下（pH=6.0~8.0）释放速率非常慢。
纳米载药系统的微观结构研究
进一步采用透射电镜技术研究了实施例1~3所制备的纳米载药系统的微观结构形态，如图3~5所示，为透射电镜测定的实施例1-3制备的纳米载药系统的微观结构形态，本发明制备的纳米载药系统均为球状颗粒，其直径大约在100nm左右，粒径分布均匀，如图6所示，为原子力显微镜测定的实施例3制备的纳米载药系统的微观结构形态，实施例3制备的纳米载药系统的原子力显微镜结果表明纳米载药系统为均匀的球状结构，这证明了本发明的工艺时稳定可靠的。
体外抗肿瘤活性评价
选取HeLa、MCF7、A549、PC12肿瘤细胞，采用CCK8法测定纳米载药系统对肿瘤细胞的抑制活性。药物的作用浓度为0，1，2，4，6，8μmol/L（以紫杉醇的浓度计），药物处理肿瘤细胞的时间时24小时。由于纳米载体中同时包含两种抗肿瘤药物，因此在测定其抗肿瘤活性时，对照药紫杉醇和喜树碱的用量加倍（0，2，4，8，12，16μmol/L）。如表2所示，以本发明实施例3所制备的纳米载药系统处理肿瘤细胞后，肿瘤细胞的存活率明显下降。由于本发明的纳米载药系统中包含两种抗肿瘤药物，两种药物协同作用后其抗肿瘤活性明显增强，对肿瘤细胞的抑制活性高于两倍用量的紫杉醇或喜树碱。
表2.纳米载药系统处理肿瘤细胞24小时候的存活率
Figure 260998DEST_PATH_IMAGE002
综上所述仅为本发明较佳的实施例，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化及修饰，皆应属于本发明的技术范畴。

Claims (8)

1.一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
⑴氧化石墨烯改性壳聚糖的制备：称取氧化石墨烯和壳聚糖，加入到溶剂一中，升温至25~45℃，超声5~15分钟，搅拌条件下加入缩合剂，在25~45℃下搅拌24~72小时，减压蒸馏至反应液体积为原来的1/4~1/2，加入溶剂二，搅拌20~40分钟，过滤，滤饼用乙醇洗涤后真空干燥，得到氧化石墨烯改性壳聚糖；
⑵牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体的制备：称取牛血清白蛋白和步骤⑴所得的氧化石墨烯改性壳聚糖，加入到溶剂三中，加入乙酸，升温至50~70℃，搅拌10~30分钟，降温至20~30℃，向反应液中加入戊二醛水溶液，搅拌2~4小时，超声分散20~40分钟，过滤，所得固体用洗涤剂洗涤，干燥得牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体；
⑶牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备：称取紫杉醇和喜树碱，加入到二甲亚砜中，搅拌溶解，控制温度在20~30℃，加入步骤⑵所得的牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载体，搅拌条件下滴加水，滴加速度为1~3滴/秒，滴加完毕搅拌0.5~1.5小时，超声10~30分钟，得到溶液，将所得溶液用分子量为3500的透析袋透析24~48小时，在-50~-70℃冷冻干燥，得一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统；
所述溶剂一为二甲亚砜或N,N-二甲基甲酰胺；
所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或N,N-二异丙基碳二亚胺；
所述溶剂二为乙醇或甲醇；
所述溶剂三为水；
所述戊二醛水溶液的质量浓度为20~40%；
所述洗涤剂为乙醇水混合液，其中乙醇和水的体积比为1~2：1；
其中氧化石墨烯、壳聚糖、溶剂一、缩合剂、溶剂二、乙醇、牛血清白蛋白、溶剂三、乙酸、戊二醛水溶液、洗涤剂、紫杉醇、喜树碱、二甲亚砜、水的质量比为0.2~0.3：1~2：200~300：0.1~0.2：200~300：10~20：0.3~0.8：270~380：0.1~0.4：0.01~0.05：5~10：0.1~0.15：0.1~0.15：50~100：300~400。
2.根据权利要求1所述的一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖平均分子量是5万，脱乙酰度大于85%。
3.根据权利要求1所述的一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备方法，其特征在于：所述溶剂一为二甲亚砜。
4.根据权利要求1所述的一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备方法，其特征在于：所述缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
5.根据权利要求1所述的一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备方法，其特征在于：所述溶剂二为乙醇。
6.根据权利要求1所述的一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备方法，其特征在于：所述戊二醛水溶液的质量浓度为25%。
7.根据权利要求1所述的一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统的制备方法，其特征在于：乙醇和水的体积比为1.5：1。
8.一种牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统，其特征在于：按照权利要求1-7任一一项所述的制备方法得到，所述牛血清白蛋白-氧化石墨烯改性壳聚糖纳米载药系统中，牛血清白蛋白与氧化石墨烯改性壳聚糖通过戊二醛交联，形成球状结构。
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