CN112969909A - 用于成像方法的多色光学谐振器 - Google Patents

用于成像方法的多色光学谐振器 Download PDF

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阿尔伯特·施莱特
约翰·里曼斯伯格
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Abstract

本文中公开了一种通过波长相关光程长度增加对样本(102)进行多色光学成像的装置(100)，装置(100)包括：光学谐振器(106)，用于增加光程长度，其中光学谐振器(106)在第一波长具有第一精细度且在第二波长具有第二精细度；样本保持器(104)，用于将样本(102)安装在光学谐振器(106)中，其中样本保持器(104)配置为保持样本(102)，使得光学谐振器(106)的光轴(112)与样本(102)相交；第一成像系统(114)，用于用第一成像技术以第一波长对样本(102)进行成像；以及第二成像系统(126)，用于用第二成像技术以第二波长对样本(102)进行成像，其中第二波长不同于第一波长；其中第一精细度和第二精细度选择成使得光学谐振器(106)增强用第一成像系统(114)的成像的第一图像质量指标和用第二成像系统(126)的成像的第二图像质量指标。

Description

用于成像方法的多色光学谐振器
技术领域
本发明属于光学领域。具体地，本发明涉及一种通过波长相关光程长度增加对样本进行多色光学成像的装置和方法。
背景技术
光学成像用于广泛范围的应用，例如，用于如薄膜固态结构或生物细胞的细观对象的光学显微法以及用于化学或生物样本的光学光谱法。对应地，已经开发出适合于不同目的的各种各样的成像技术。这些包括例如用于具有空间变化的吸收性质的样本的吸收成像和用于具有空间变化的折射率的样本的相衬成像，以及荧光标记的对象的荧光光谱法和用于探查振动光谱的拉曼光谱法。
尽管近年来已经取得了惊人的进展，例如，就随着超高分辨率显微镜的出现的空间分辨率而言，但是许多成像技术被限于与入射光强烈地相互作用的光密样本。对于具有低损伤阈值的样本来说尤其如此，其中光强度(例如，照明或谐振激励)被限于低强度以便避免损坏样本。这种情况在研究生物样本时经常发生。由于这个原因，对具有低光学密度的样本(例如，薄样本，如附着的单细胞层以及流中的细胞或细胞团块)进行成像可能具有挑战性，特别是在样本的厚度无法增加的情况下，例如，在要研究各个细胞的性质(例如由于与细胞环境的相互作用引起的代谢状况或化学/生物化学变化)的情况下。
克服这个限制的一种方法是采用光学谐振器，其中耦合到谐振器中的光在离开谐振器之前被来回反射多次。由此，穿过置于谐振器中的样本的有效光程长度可以在光反复地穿过样本时增加，从而导致光与样本之间的增强的相互作用，例如光的更大吸收、散射和/或相移。这个概念例如用于扫描腔显微镜检查，其依赖于在光纤的尖端与样本保持器之间形成的光学微腔以增强检测信号，参见例如M.Mader等，自然通信，6:7249(2015年)。由于微腔内的光场局限于小体积，因此利用这种技术只能探查样本的单个点，并且必须在样本上方扫描纤维尖端以获得完整的图像，使得这种技术的使用典型地被限于静态样本。
为了对光学谐振器内部的延伸的样本直接地成像，已经采用具有如透镜或曲面镜的聚焦元件的谐振器，其中聚焦元件配置为将样本成像到其自身上，从而允许独立于成像光在谐振器中执行的往返行程的数量的清晰图像，参见例如Y.Arai等，公共科学图书馆期刊，10(5)：e0125733(2015年)；T.Juffmann等，自然通信，7：12858(2016年)；以及US 2017/0261739 A1。然而，这要求可能难以对准的复杂谐振器配置。此外，这些方法的一个特定缺点是图像质量强烈地依赖于所使用的成像技术的事实，从而可能妨碍同时使用不同的成像技术。
WO 2013/164642 A1描述了一种用于使用光学微腔进行化学感测的装置。该装置包括连接到通道以用于提供样本介质的腔。来自辐射源的光耦合到腔中并且透射穿过腔的光由检测器检测。腔的光程长度是可调谐的并且是在微米规模上，使得自由光谱范围足够大，以便只有单个纵向腔模式与辐射源所发射的光谐振。
从WO 2018/106321 A1和US 5528040 A中得知用于光腔衰荡光谱法的装置。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种通过光程长度增加对样本进行成像的装置和方法，该装置和方法利于用不同的成像技术进行同时成像。这个目的由分别根据权利要求1和21的装置和方法满足。从属权利要求中详述了本发明的实施方式。
通过波长相关光程长度增加对样本进行多色光学成像的装置包括：(a)光学谐振器，用于增加光程长度，其中，光学谐振器在第一波长具有第一精细度且在第二波长具有第二精细度；(b)样本保持器，用于将样本安装在光学谐振器中，其中，样本保持器配置为保持样本，使得光学谐振器的光轴与样本相交；(c)第一成像系统，用于用第一成像技术以第一波长对样本进行成像，其中，沿着光学谐振器的传出光轴执行成像；以及(d)第二成像系统，用于用第二成像技术以第二波长对样本进行成像，其中，沿着光学谐振器的传出光轴执行成像，并且其中，第二波长不同于第一波长。第一精细度和第二精细度选择成使得光学谐振器增强用第一成像系统的成像的第一图像质量指标和用第二成像系统的成像的第二图像质量指标。
光学谐振器可以由两个或更多个反射表面(例如，镜)形成。沿着光学谐振器的光轴传播的光被反射表面反射，使得光继续沿着光学谐振器的光轴传播。谐振器的光轴形成闭合路径，光沿着该闭合路径继续来回移动。由此，光可以被限制到光学谐振器，其中，它可以以循环方式传播。为了将光耦合到光学谐振器中，光学谐振器可以包括至少一个部分反射表面，光可以部分透射穿过该部分反射表面。在光学谐振器中传播的光的一部分转而在每个循环中可以透射穿过部分反射表面，并且因此可以沿着光学谐振器的传出光轴离开光学谐振器。因此，耦合到光学谐振器中的每个光子均在从谐振器发射之前可以执行一定数量的往返行程，使得与谐振器的物理长度和光程长度相比，可以增加谐振器的有效光程长度，即，光子在谐振器内行进的光程长度。在此，谐振器的物理长度是指由谐振器的光轴形成的闭合路径的长度，而光程长度另外地考虑到沿着谐振器的光轴的折射率。光程长度的增加可以由光学谐振器的精细度表征。如下文详述，精细度定义为光学谐振器的自由光谱范围与光学谐振器的透射光谱中的峰值的半高全宽(FWHM)之比。
通过以一定方式将样本安装在样本保持器中而使得谐振器的光轴与样本相交，被限制在谐振器中的光在每个循环穿过样本，由此增加在样本内的有效光程长度，从而引起光与样本之间的更强相互作用。第一成像系统配置为通过收集沿着传出光轴从谐振器发射的具有第一波长的光来用第一成像技术对样本进行成像。对应地，第二成像系统配置为通过收集沿着传出光轴从谐振器发射的具有第二波长的光来用第二成像技术对样本进行成像。如果光学谐振器具有多个传出光轴，例如，如果光学谐振器包括多个部分反射表面，则分别由第一成像系统和第二成像系统使用的传出光轴可以彼此不同。
在第一波长，光学谐振器具有第一精细度，该第一精细度表征具有第一波长的光子在光学谐振器中的往返行程的平均数量。第一精细度适合于第一成像系统以便增强第一图像质量指标，该第一图像质量指标量化用第一成像系统取得的样本的图像的质量。在此，增强第一图像质量因数是指以下情形：其中与例如通过使对应的反射表面完全透明来将光学谐振器从装置移除的情况相比，如果光学谐振器处于适当位置，则第一图像质量因数更高。精细度可以是图像质量的决定因素，并且特别是对于不同的成像系统可以具有不同的最佳值。在一个示例中，极大的精细度可以是有利的，例如，以通过增加穿过样本的往返行程数量来增大信号的强度。在另一示例中，小精细度可以引起更好的图像质量，例如，以避免由源于已经执行不同数量的往返行程的光的部分的信号重叠而引起的相位噪声或锐度降低。在又一示例中，精细度的中间值可以因为穿过样本的增加有效光程长度而提供最佳图像质量，同时避免在较大精细度值下例如因前述影响而引起的图像质量的退化。
对应地，光学谐振器在第二波长表现出第二精细度，该第二精细度进而表征具有第二波长的光子在光学谐振器中的往返行程的平均数量。第二精细度适合于第二成像系统以便增强第二图像质量指标，该第二图像质量指标量化用第二成像系统取得的样本的图像的质量。特别地，第二精细度可以不同于第一精细度，例如，在使用对于精细度有不同要求的不同成像技术的情况下。
通过为第一成像系统和第二成像系统适当地选择光学谐振器的精细度，可以同时增强两个系统的图像质量。这利于在相同的装置内实施不同的成像技术，同时因为样本内的有效光程长度的增加而利用光学谐振器可以提供的图像质量的改善的优点。由此，可以从成像中提取的信息量可以增大，特别是在将来自用两个不同的成像系统取得的测量的信息组合时。
第一图像质量指标和第二图像质量指标可以是例如信号强度、信噪比、对比率、边缘对比度或它们的组合。信号强度可以是测量到的信号的绝对强度，例如，测量到的强度、相移或偏振角度，或者测量到的信号的相对强度，例如，例如对于不同的偏振、在不同的波长和/或在样本中的不同位置处测量到的强度之比。对应地，信噪比可以定义为信号强度与信号上的噪声的测量之比，例如信号的时间平均、样本平均和/或测量平均波动幅度。对于光谱成像技术，信号强度可以例如定义为信号的幅度，比如吸收或荧光峰。光谱成像技术的信噪比可以例如定义为信号强度除以谐振下的信号上的平均噪声，其中噪声可以例如在多个测量值上和/或在时间上进行平均。类似地，对于显微图像，信噪比可以例如定义为对具有长相关长度的图像的贡献与对具有短相关长度的图像的贡献之比，例如，通过定义图像的空间傅里叶分量的下截止和上截止来进行，其中相对于与样本中的特征的特征长度尺度相关联的特征波向量来确定下截止和上截止。在一个示例中，下截止可以是特征波向量的20％至50％，而上截止可以是特征波向量的2至5倍。图像的对比率可以例如定义为图像中的最高强度与最低强度之比，其中强度可以在包括例如4至25个像素的区域上平均，例如以最小化噪声的影响。边缘对比度可以例如定义为图像的子区域中的局部对比率或两个相邻点处的强度之比。
增加穿过样本的有效光程长度可以有益于多种成像技术、特别是显微成像和光谱法，其中显微成像是指空间解析测量并且光谱法是指光谱解析测量，光谱解析测量可以是或可以不是空间解析的。第一成像系统和第二成像系统中的每个均可以配置为执行以下成像技术中的至少一个：吸收成像、相衬成像、荧光成像、偏振成像、光声成像、吸收光谱法、荧光光谱法或拉曼光谱法。在吸收成像中，测量样本对光的吸收的空间变化，这可以例如得自谐振吸收或非谐振散射。相衬成像依赖于测量光在穿过样本中获得的相位、特别是相位差的空间变化。对于荧光成像和光谱法，用处于与执行测量的波长不同的波长的光来激励样本，其中测量可以是例如荧光强度的空间解析图像或空间平均荧光强度的测量，其中每一个可以在固定波长或光谱解析地执行。偏振成像技术例如使用偏振光学器件(比如偏振器)来探查穿过样本的光的偏振的改变。在光声成像中，由光学脉冲激励样本，该光学脉冲引起样本的快速加热，从而导致温度和/或压力的跳跃。这可以激励样本中的声波并且可以改变样本的折射率，由此改变光学谐振器的光程。这个改变可以例如通过处于探针波长(即，第一波长或第二波长)的透射的改变来检测，该波长可以与激励脉冲的波长相同。吸收光谱法测量样本或样本的一部分对光的吸收的空间变化，这可以例如得自谐振吸收或非谐振散射。拉曼光谱法是涉及样本中的低能模式的非弹性散射过程的光谱解析测量，例如，旋转和振动自由度。
在优选实施方式中，第一成像技术不同于第二成像技术。在一个示例中，第一成像技术可以是荧光光谱法，并且第二成像技术可以是相衬成像。在其他实施方式中，第一成像技术和第二成像技术可以是相同的，但以不同波长执行。例如，第一成像技术和第二成像技术可以都是吸收成像，但第一波长处于紫外光谱，例如350nm，而第二波长处于近红外光谱，例如1064nm。
优选地，第一精细度和第二精细度选择成使得与在第一波长具有第二精细度且在第二波长具有第一精细度的光学谐振器相比，增强用第一成像系统的成像的第一图像质量指标和用第二成像系统的成像的第二图像质量指标的组合。第一图像质量指标和第二图像质量指标的组合可以是例如第一图像质量指标和第二图像质量指标的总和或加权和。例如，可以通过增大精细度来提高第一成像系统和第二成像系统两者的图像质量，但如果第二精细度超过某一阈值，则第二成像系统的图像质量可能降低。在这种情况下，可能有利的是为第一精细度选择比第二精细度大的值。在另一示例中，可以通过增大精细度来提高第一成像系统和第二成像系统两者的图像质量，但第二成像系统的图像质量可能更慢地提高。在这种情况下，也可能有利的是以第二精细度为代价来增大第一精细度。
第一精细度可以例如大于50、优选地大于100。大的精细度可以对于光谱成像技术(例如，吸收或荧光光谱法)特别有利，因为可以通过穿过样本的光的较大数量的往返行程来增强信号，而源于已经进行不同数量的往返行程的光的部分的信号重叠可能没有有害影响，例如在用点状检测器(比如光电二极管)测量时。
在一个示例中，第二精细度可以小于10、优选地小于5。这可以例如有利于空间解析成像、特别是相衬成像，因为对于精细度的较大值来说，由于源于已经进行不同数量的往返行程的光的部分的信号重叠，图像质量可能降低，从而可以例如降低边缘对比度并引入相位噪声。
在另一示例中，第一精细度和第二精细度可以大于50、优选地大于100，并且第一波长和第二波长可以分开大于50nm、优选地大于100nm。由此，对于以分开较大的两个波长的光谱测量来说，可以例如提高图像质量，因为对于这两个波长来说，同时强烈地增大穿过样本的有效光程长度。
光学谐振器的精细度由光学谐振器中的损耗过程决定，该损耗过程引起来自谐振器的光的损耗，例如吸收和散射过程。特别地，形成谐振器的反射表面的反射率可以具有很大相关性并且可以适当地选择以实现期望的精细度值。在一个示例中，光学谐振器包括第一反射表面和第二反射表面。第一反射表面和/或第二反射表面的反射光谱可以选择成使得光学谐振器在第一波长和第二波长分别表现出第一精细度和第二精细度。例如，第一镜在第一波长和第二波长可以表现出大于99.9％的反射率。如果第一精细度将较大，例如大于100，则可以例如将第二镜在第一波长的反射率选择为大于98％。如果第二精细度将较小，例如小于5，则可以例如将第二镜在第二波长的反射率选择为小于40％。
在一个示例中，光学谐振器在第一波长和/或第二波长的有效光程长度可以分别小于第一成像系统和/或第二成像系统的景深的五倍、优选地小于两倍。在此，成像系统的景深定义为聚焦到样本上的相应波长的高斯激光束的瑞利长度，其中选择交点处的激光束的腰，使得如从样本看到的成像系统的第一孔径、特别是成像系统的第一透镜处的激光束的腰等于第一孔径的半径，例如第一透镜的半径。光学谐振器的有效光程长度继而定义为在相应波长的光学谐振器的精细度与光学谐振器的长度的乘积。为了实现这种有效光学长度，光学谐振器的长度必须足够小。在一个示例中，光学谐振器的长度可以小于100μm、优选地小于10μm。
光学谐振器可以包括至少一个聚焦元件，其中至少一个聚焦元件配置为使沿着光学谐振器的光轴传播的光聚焦，使得垂直于光学谐振器的光轴的平面成像到其自身上。为此，至少一个聚焦元件连同反射表面和光学谐振器内的其他光学元件可以形成成像系统，使得垂直于光轴的这个平面中的强度分布在整数数量的往返形成之后是相同的，其达到由损耗过程引起的常数因子。至少一个聚焦元件可以例如是任何数量的反射或衍射聚焦元件，诸如任何数量的凸透镜和/或凹透镜。至少一个聚焦元件可以是例如一对凸透镜，其中光学谐振器的长度等于透镜的焦距的总和的两倍。在其他示例中，聚焦元件中的至少一个可以包括至少一个弯曲的反射表面，例如曲面镜。光学谐振器可以是例如同心、共焦、半球状或凹凸的双镜光学谐振器。光学谐振器可以特别配置为将穿过样本的平面成像到其自身上。
装置还可以包括用于产生处于第一波长和第二波长的光的至少一个光源。至少一个光源可以由一个或多个相干和/或不相干光源形成。装置可以例如包括具有宽带光谱的单个光源，例如白光LED或超连续激光器，该单个光源可以例如被滤波以获得处于第一波长和第二波长的光。在另一示例中，装置可以包括两个窄带光源，例如激光器或窄带LED，其中一个发射处于第一波长的光并且另一个发射处于第二波长的光。至少一个光源可以是脉冲激光器、特别是具有小于光学谐振器的往返行程时间的脉冲长度的脉冲激光器。
光学谐振器的传出光轴可以平行于用于用第一成像系统和/或第二成像系统的成像的输入光轴，其中输入光轴是例如来自至少一个光源的要耦合到光学谐振器的光的传播轴线。如果输入光轴平行于传出光轴，则耦合到光学谐振器中的光可以沿着谐振器的光轴传播，例如，以确保光在每个往返行程中沿着相同的路径传播。在其他示例中，光学谐振器的传出光轴可以相对于用于用第一成像系统和/或第二成像系统用于成像的光轴倾斜，例如，倾斜小于15°、优选地小于5°的角度。
在优选实施方式中，样本保持器包括配置为保持液体介质的流体腔室。流体腔室可以配置为保持液体介质，使得光学谐振器的光轴与流体腔室中的液体介质相交。在一个示例中，流体腔室可以是具有垂直于谐振器的光轴定向的平顶和底表面的圆筒。该圆筒可以例如具有在10μm与5mm之间的内径和在10μm与2mm之间的内部高度。流体腔室可以例如由玻璃或塑料组成。流体腔室在第一波长和第二波长下可以是透明的，并且因此可以包括抗反射涂层。替代地，光学谐振器可以由流体腔室的两个相对表面形成、特别是由流体腔室的两个相对内表面形成，例如，圆柱形流体腔室的内部顶表面和底表面。这可以有利于实现光学谐振器的短长度。为此，相应的表面可以涂有反射涂层，例如，金属涂层或电介质涂层。为了减小光学谐振器的长度，相对的表面(例如，圆柱形流体腔室的内部顶表面与底表面)之间的距离可以小于100μm、优选地小于10μm。
装置还可以包括泵系统，其中泵系统配置为产生通过流体腔室的液体介质流。为此，流体腔室可以例如包括与泵系统连接的输入端口和输出端口。流体腔室和泵系统可以配置为产生通过流体腔室的液体介质的层流。在优选实施方式中，流体腔室和泵系统配置为产生通过流体腔室的鞘流，例如以用于流体动力聚焦。鞘流可以由液体介质和鞘介质的平行层流产生，其中鞘介质的粘度适应于液体介质的粘度，使得两种介质不混合。两种介质可以以不同的速度流动，例如鞘介质可以比液体介质更快。在另一示例中，可以使用粘弹性液体介质，例如以用于粘弹性流动聚焦。
装置还可以包括用于调整第一波长和/或第二波长的波长调谐设备。波长调谐设备可以例如是可调谐激光源或可调谐光学滤波器，例如可旋转标准量具滤波器。波长调谐设备可以包括反馈单元，该反馈单元配置为例如经由Pound-Drever-Hall锁定方案来相对于光学谐振器的透射峰值使第一波长和/或第二波长稳定。
此外，装置可以包括用于调整光学谐振器的谐振频率的调整机构。在此，谐振频率是光学谐振器的透射光谱表现出局部极大值的频率。调整机构可以例如包括致动器(例如，压电致动器)或平移平台，以用于移动形成谐振器的反射表面中的一个或多个，以便改变谐振器的长度。替代地或另外地，调整机构可以包括折射元件，该折射元件用于例如通过改变折射元件的折射率或穿过折射元件的传播长度来改变谐振器的光程。
装置还可以包括用于用第三成像技术对样本进行成像的第三成像系统，其中沿着不同于光学谐振器的传出光轴的轴线、特别是沿着垂直于光学谐振器的光轴的轴线执行成像。第三成像系统可以配置为使得它收集来自谐振器的没有通过形成谐振器的反射表面中的一个离开的光。为此，第三成像系统可以例如配置为在相对于光学谐振器的光轴的一定角度下对样本进行成像。第三成像系统可以配置为以不同于第一波长和第二波长的第三波长进行成像，并且可以配置为执行以下成像技术中的至少一个：吸收成像、相衬成像、荧光成像、偏振成像、光声成像、吸收光谱法、荧光光谱法或拉曼光谱法。
装置还可以包括用于用第四成像技术以第四波长对样本进行成像的第四成像系统，其中沿着光学谐振器的传出光轴执行成像。第四成像系统可以配置为执行以下成像技术中的至少一个：吸收成像、相衬成像、荧光成像、偏振成像、光声成像、吸收光谱法、荧光光谱法或拉曼光谱法。光学谐振器在第四波长的精细度选择成使得用第四成像系统的成像的第四图像质量指标不会因光学谐振器的存在而增加。第四成像技术可以不同于第一成像技术和第二成像技术。
本发明还提供了一种通过波长相关光程长度增加使用根据前述实施方式中的任一个的装置对样本进行多色光学成像的方法。该方法包括：(1)将样本放置在光学谐振器中，其中样本放置成使得光学谐振器的光轴与样本相交；(2)用第一成像技术以第一波长对样本进行成像，其中沿着光学谐振器的传出光轴执行成像；以及(3)用第二成像技术以第二波长对样本进行成像，其中沿着光学谐振器的传出光轴执行成像，并且其中第二波长不同于第一波长。第一精细度和第二精细度选择成使得光学谐振器增强用第一成像技术的成像的第一图像质量指标和用第二成像技术的成像的第二图像质量指标。上述步骤的编号仅仅是为了清楚起见，并且不指示某一执行次序。只要在技术上可行，步骤就可以重新排列，并且方法及其任何实施方式可以按这些步骤的任意次序执行。
第一成像技术和第二成像技术中的每个均可以是以下成像技术中的至少一个：吸收成像、相衬成像、荧光成像、偏振成像、光声成像、吸收光谱法、荧光光谱法或拉曼光谱法。第一成像技术可以不同于第二成像技术。
在优选实施方式中，样本包括包含成像对象、特别是单独的生物细胞或物质的液体介质，并且将样本放置在光学谐振器中包括：在流体腔室中提供液体介质。液体介质可以例如包括等张流体或配置为支撑生物细胞的细胞培养介质。液体介质还可以包括血液样本、特别是稀释的血液样本。生物物质可以是例如生物分子，比如蛋白质或核酸。特别地，液体介质可以配置为不改变成像对象的光学和/或化学性质。
在流体腔室中提供液体介质可以包括：产生通过流体腔室的液体介质流。特别地，可以在用第一成像技术和/或第二成像技术执行成像的同时产生和/或维持液体介质流。替代地，可以产生流以在流体腔室中提供液体介质并且可以在执行成像时中断。通过流体腔室的液体介质流可以是例如层流。在一个示例中，可以在流体腔室中产生液体介质和鞘介质的鞘流，例如以用于流体动力聚焦。在另一示例中，液体介质可以使用粘弹性介质，例如以用于粘弹性流动聚焦。
将样本放置在光学谐振器中可以例如通过样本中的散射和/或吸收来改变谐振器的光学性质并且特别是谐振器的精细度、自由光谱范围和/或光程。优选地，将样本的成分而非要研究的成像对象(例如，液体介质中的成像对象)的散射和/或吸收最小化，以便不影响光学谐振器的固有精细度。为此，例如，液体介质可以例如是透明的并且具有均匀的折射率、特别是小于1.5的折射率。在一个示例中，具有处于适当位置的样本的光学谐振器的第一精细度可以大于20、优选地大于50。替代地或另外地，具有处于适当位置的样本的光学谐振器的第二精细度可以小于10、优选地小于5。
在优选实施方式中，第一波长和/或第二波长设置到光学谐振器的透射光谱的对应峰值。由此，在第一波长和/或第二波长中和/或在光学谐振器的透射光谱中，耦合到光学谐振器中的光的量可以增加并且对于波动来说更稳健。为此，方法还可以包括调整第一波长、第二波长和/或光学谐振器的长度，以调谐在第一波长的光学谐振器的透射和/或在第二波长的光学谐振器的透射。
在一个示例中，可以调整第一波长、第二波长和/或光学谐振器的长度，以相对于在第二波长的光学谐振器的透射来调谐在第一波长的光学谐振器的透射。这可以例如用来调整用于第一成像技术和/或第二成像技术的光的强度，例如，以实现类似的强度和/或信号强度。在一个示例中，第一波长可以设置到光学谐振器的透射光谱的峰值，而第二波长可以设置到光学谐振器的透射光谱的峰值附近的点，在该点处，透射是例如峰值透射的50％。
方法还可以包括用第三成像技术对样本进行成像，其中沿着不同于光学谐振器的传出光轴的轴线、特别是沿着垂直于光学谐振器的光轴的轴线执行成像。
附图列表
在下文中，参考附图给出本发明的详细描述及其示例性实施方式。附图示出了以下示意图示：
图1：根据本发明的示例性实施方式的用于样本的多色光学成像的装置；
图2：根据本发明的实施方式的装置中的光学谐振器的透射光谱的示例；
图3a：根据本发明的实施方式的具有较小有效光程长度的光学谐振器；
图3b：根据本发明的实施方式的具有聚焦元件的光学谐振器；以及
图4：根据本发明的示例性实施方式的用于样本的多色光学成像的方法的流程图。
具体实施方式
图1描绘了根据本发明的示例性实施方式的用于样本102的多色光学成像的装置100的截面图。装置100包括用于安装样本102的样本保持器104，其中样本102可以例如放置在如显微镜检查玻片的基板上或者可以设置在流体腔室中。装置100还包括谐振器106，在该示例中，该谐振器由具有平行相对的反射表面的两个镜108和110形成。镜108和110可以例如在反射表面上包括金属或电介质涂层。在其他示例中，反射表面可以是弯曲的，例如凸面或凹面，可以使用多于两个镜，例如在环状腔中，或者反射表面可以集成在样本保持器104中，例如流体腔室的相对表面。光学谐振器106具有在谐振器106中形成闭合路径的光轴112，光可以沿着该光轴传播。
装置100包括第一成像系统114，该第一成像系统配置为用第一成像技术以第一波长对样本102进行成像。为此，第一波长的光116可以例如沿着传入光轴118通过镜108耦合到谐振器106中，该传入光轴与光学谐振器106的传出光轴120对准。第一成像系统114配置为沿着光学谐振器106的传出光轴122执行成像，即，传出光轴122平行于第一成像系统114的光轴124。在其他示例中，第一成像系统114的光轴124可以从传出光轴122倾斜一定角度，例如小于5°，使得第一成像系统114沿着传出光轴122捕获从光学谐振器106发射的光中的至少一些。在其他实施方式中，相同的传出光轴可以用于成像和将光耦合到谐振器106中。
装置100还包括第二成像系统126，该第二成像系统配置为用第二成像技术以第二波长对样本102进行成像。为此，第二波长的光128可以例如通过镜108耦合到谐振器106中。第二成像系统126配置为沿着传出光轴(例如，光学谐振器106的传输光轴122)执行成像，即，传输光轴122平行于第二成像系统126的光轴或相对于该光轴倾斜较小角度，例如小于5°。
第一成像系统114和第二成像系统126可以配置为执行不同的成像技术。在图1所示的示例中，第一成像系统114配置为用空间解析检测器130(例如CCD或CMOS相机)执行显微镜检查，例如吸收或荧光成像。为此，第一成像系统114可以包括附加的光学元件，例如透镜132。第二成像系统126配置为用点状检测器(例如，配置为测量平均光强度的光电二极管134)执行光谱测量。第一成像系统126还可以包括附加的光学元件，例如透镜136，并且另外可以与第一成像系统共享光学元件，例如物镜138。为了将第一波长的光与第二波长的光分开，可以使用特定波长的光学元件，例如二向色镜140。在其他实施方式中，可以将棱镜或衍射光栅用于此。
图2示出了根据本发明的实施方式的装置的光学谐振器(例如，光学谐振器106)的随光的频率ν而变的透射光谱T(ν)(200)的示例。对于多数频率来说，经历不同数量的往返行程的分波之间的相消干涉强烈地抑制穿过谐振器106的透射，使得所有的传入光反射离开谐振器106。如果满足相长干涉的谐振条件，例如，如果谐振器106的长度(即，沿着光轴112的往返行程的长度)是λ/2的整数倍，其中表示光的波长，则分波相长地干涉并且光学谐振器106变得可透射，即，透射大部分的光。这引起透射光谱200中的周期性连续的透射峰，其中相邻峰之间的间隔由谐振器106的自由光谱范围202决定。自由光谱范围202对应地取决于谐振器的长度并且定义为谐振器中的光子的往返行程时间的倒数。透射峰中的每个均具有宽度204，该宽度继而经由傅里叶变换与光子在谐振器106中花费的平均时间有关。因此，定义为自由光谱范围202与峰宽度204(例如，半高全宽)之比的谐振器106的精细度表征光子在离开谐振器106之前进行的往返行程的平均数量。
对于第一波长和第二波长，谐振器106的精细度可以设置为不同值。例如，精细度在第二波长下可以比在第一波长下大，即，处于与自由光谱范围202相比的第一波长的透射峰的宽度204比处于与自由光谱范围206相比的第二波长的宽度208更宽。一般来说，除非谐振器含有强烈色散元件，否则自由光谱范围206类似于自由光谱范围202。
图3a描绘了根据本发明的实施方式的装置300中的具有较小有效光程长度的光学谐振器106。装置300可以类似于图1所示的装置100，装置300与该装置100的主要区别在于光学谐振器106的设计。对应地，装置300可以包括除了图3a所示的部件之外的其他元件，例如第一成像系统114和第二成像系统126。样本102放置在谐振器106中。当例如通过物镜138对样本102进行成像时，光在谐振器106中重复地循环通过样本102可以解释为创建样本的虚假图像302，因为在每个循环中，小部分的光均离开谐振器并且例如在相机130(图3中未示出)上创建样本的图像。由于光的衍射，虚假图像302可能不相同，使得虚假图像302在相机130上的重叠可以降低图像的锐度。这个降低可以取决于虚假图像的有效分离，该有效分离由谐振器的有效光程长度304和因此其精细度和长度以及相应成像系统的景深306确定。在此，成像系统的景深306定义为聚焦到样本106上的相应波长的高斯激光束308的瑞利长度，其中选择交点处的激光束308的腰，使得如从样本102看到的成像系统的第一孔径(在这种情况下，物镜138的第一透镜)处的激光束308的腰等于第一孔径的半径，例如第一透镜的半径。为了增强图像质量，可以选择有效光程长度304以与景深306相当，例如小于比景深306大2倍。这尤其可以通过减小光学谐振器106的尺寸来实现，使得即使在相应波长下光学谐振器106的精细度较大，有效光程长度304也保持较小。
图3b描绘了根据本发明的实施方式的装置310中的具有聚焦元件的光学谐振器106。装置310可以类似于图1所示的装置100，装置310与该装置100的主要区别在于光学谐振器106的设计。对应地，装置310可以包括除了图3b所示的部件之外的其他元件，例如第一成像系统114和第二成像系统126。在光学谐振器106的内部，放置有连个聚焦透镜312和314。谐振器106的长度选择成使得它等于透镜312和314的焦距的总和的两倍，例如，如果f表示两个透镜的焦距，则为4f。在图3b所示的示例中，透镜312和314放置成使得左镜108的表面上的点成像到右镜110的表面上的点上。因此，在完整的往返行程之后，表面上的强度图案成像到其自身上。这可以允许补偿沿着谐振器106的光轴112传播的光的发散。如果样本102靠近镜108的表面定位，例如在小于透镜312的焦距的10％、优选地小于5％的距离处，则因此，穿过样本102的平面在一个往返行程之后可以成像到其自身上，因为靠近镜110的表面创建样本102的虚拟图像316，该表面然后在光被镜110反射回来之后再次成像到样本102上。在其他实施方式中，镜108和110可以是聚焦元件并且可以具有弯曲表面以聚焦光。此外，不同数量的聚焦元件(例如，透镜)可以放置在谐振器106内部。
在图4中，示出了根据本发明的示例性实施方式的用于对样本进行多色光学成像的方法400的流程图，该方法可以例如用装置100实施并且在下文参考图1进行描述。然而，方法400也可以用根据本发明的实施方式的其他装置实施，例如装置300和310。
在步骤402中，例如通过形成穿过样本保持器104的流体腔室的包含成像对象的液体介质流来将样本102放置在样本保持器104中。在当样本已经在适当位置时优选地在步骤402之后执行的步骤404中，可以调谐穿过光学谐振器106的透射。在一个示例中，至少部分地测量透射光谱200，并且分别将与第一波长和第二波长相对应的频率ν1和ν2设置到透射光谱200中的期望点，例如通过调谐第一波长和/或第二波长以使频率ν1和ν2移位或者通过调整光学谐振器106的谐振频率(例如，通过改变其长度)来改变透射光谱200。频率ν1和ν2可以例如都设置到透射光谱200中的不同峰。在另一示例中，ν2可以设置到透射光谱200中的峰，而ν1可以设置到透射光谱200中的另一个峰的翼，例如在透射是对应峰处的透射的1/3的点处。在第三示例中，ν1可以设置到透射光谱200中的峰的高频翼，即，设置到峰的右侧，而ν2可以设置到透射光谱200中的另一峰的低频翼，即，设置到相应峰的左侧。这可以例如用来区分样本102的吸收改变和由样本102产生的谐振器106的光程长度改变，因为吸收改变引起两个频率的透射的同时增加或降低，而光程长度改变引起透射光谱200中的峰的移位，从而导致两个频率的透射的不对称改变。
随后，在步骤406和408中，用第一成像技术以第一波长和用第二成像技术以第二波长对样本进行成像，例如通过将第一波长的光116和第二波长的光128耦合到谐振器106中并且例如在检测器130和134上经由第一成像系统114和第二成像系统126来测量透射穿过谐振器106的光。如果在步骤406和408中的一个或两个中执行光谱测量，则这可以涉及在测量期间调谐第一波长和/或第二波长，例如，将相应的波长设置到透射光谱200中的不同峰。可以同时地或按顺序执行步骤406和408。在一些实施方式中，在步骤406和408期间可以进一步稳定以第一波长和/或第二波长穿过谐振器106的透射，例如保持样本处或检测器上的强度不变。
出于说明目的，本文中公开的本发明的实施方式仅构成特定示例。在不改变潜在的基本性质的情况下，本发明可以以各种方式且以许多修改来实施。因此，本发明仅由如下面陈述的权利要求书限定。
附图标记列表
100–用于多色光学成像的装置
102–样本
104–样本保持器
106–光学谐振器
108–镜
110–镜
112–光学谐振器的光轴
114–第一成像系统
116–处于第一波长的光
118–传入光轴
120–光学谐振器的传出光轴
122–光学谐振器的传出光轴
124–第一成像系统的光轴
126–第二成像系统
128–处于第二波长的光
130–空间解析检测器
132–透镜
134–光电二极管
136–透镜
138–物镜
140–二向色镜
200–光学谐振器的透射光谱
202–处于第一波长的自由光谱范围
204–处于第一波长的透射峰的宽度
206–处于第二波长的自由光谱范围
208–处于第二波长的透射峰的宽度
300–用于多色光学成像的装置
302–样本的虚假图像
304–有效光程长度
306–景深
308–高斯激光束
310–用于多色光学成像的装置
312–透镜
314–透镜
316–样本的虚拟图像
400–用于多色光学成像的方法
402–将样本放置在光学谐振器中的步骤
404–调谐穿过光学谐振器的透射的步骤
406–用第一成像技术以第一波长对样本进行成像的步骤
408–用第二成像技术以第二波长对样本进行成像的步骤

Claims (30)

1.一种通过波长相关光程长度增加对样本(102)进行多色光学成像的装置(100)，所述装置(100)包括：
光学谐振器(106)，用于增加光程长度，其中，所述光学谐振器(106)在第一波长具有第一精细度且在第二波长具有第二精细度；
样本保持器(104)，用于将所述样本(102)安装在所述光学谐振器(106)中，其中，所述样本保持器(104)配置为保持所述样本(102)，使得所述光学谐振器(106)的光轴(112)与所述样本(102)相交；
第一成像系统(114)，用于用第一成像技术以所述第一波长对所述样本(102)进行成像，其中，沿着所述光学谐振器(106)的传出光轴(122)执行所述成像；以及
第二成像系统(126)，用于用第二成像技术以所述第二波长对所述样本(102)进行成像，其中，沿着所述光学谐振器(106)的所述传出光轴(122)执行所述成像，以及其中，所述第二波长不同于所述第一波长；
其中，所述第一精细度和所述第二精细度选择成使得所述光学谐振器(106)增强用所述第一成像系统(114)的所述成像的第一图像质量指标和用所述第二成像系统(126)的所述成像的第二图像质量指标。
2.根据权利要求1所述的装置(100)，其中，所述第一图像质量指标和所述第二图像质量指标中的每个均是信号强度、信噪比、对比率、边缘对比度或它们的组合。
3.根据权利要求1或2所述的装置(100)，其中，所述第一成像系统(114)和所述第二成像系统(126)中的每个均配置为执行以下成像技术中的至少一个：吸收成像、相衬成像、荧光成像、偏振成像、光声成像、吸收光谱法、荧光光谱法或拉曼光谱法。
4.根据权利要求3所述的装置(100)，其中，所述第一成像技术不同于所述第二成像技术。
5.根据前述权利要求中任一项所述的装置，其中，所述第一精细度和所述第二精细度选择成使得与在所述第一波长具有所述第二精细度且在所述第二波长具有所述第一精细度的光学谐振器相比，增强用所述第一成像系统的所述成像的所述第一图像质量指标和用所述第二成像系统的所述成像的所述第二图像质量指标的组合。
6.根据前述权利要求中任一项所述的装置(100)，其中，所述第一精细度大于50、优选地大于100。
7.根据前述权利要求中任一项所述的装置(100)，其中，所述第二精细度小于10、优选地小于5。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的装置(100)，其中，所述第一精细度和所述第二精细度大于50、优选地大于100，以及其中，所述第一波长和所述第二波长分开大于50nm、优选地大于100nm。
9.根据前述权利要求中任一项所述的装置(100)，其中，所述光学谐振器(106)包括第一反射表面(108)和第二反射表面(110)，以及其中，所述第一反射表面(108)和/或所述第二反射表面(110)的反射光谱选择成使得所述光学谐振器(106)在所述第一波长和所述第二波长分别表现出所述第一精细度和所述第二精细度。
10.根据前述权利要求中任一项所述的装置(300)，其中，所述光学谐振器(106)在所述第一波长和/或所述第二波长的有效光程长度(304)分别小于所述第一成像系统和/或所述第二成像系统的景深(306)的五倍、优选地小于两倍。
11.根据前述权利要求中任一项所述的装置(310)，其中，所述光学谐振器(106)包括至少一个聚焦元件(312、314)，其中，所述至少一个聚焦元件(312、314)配置为使沿着所述光学谐振器(106)的所述光轴(112)传播的光聚焦，使得垂直于所述光学谐振器(106)的所述光轴(112)的平面成像到其自身上。
12.根据权利要求11所述的装置(310)，其中，所述光学谐振器(106)配置为将穿过所述样本(102)的平面成像到其自身上。
13.根据前述权利要求中任一项所述的装置(100)，还包括用于产生处于所述第一波长和所述第二波长的光的至少一个光源、特别是激光源。
14.根据前述权利要求中任一项所述的装置(100)，其中，所述光学谐振器(106)的传出光轴(122)平行于用于用所述第一成像系统(114)和/或所述第二成像系统(126)进行所述成像的光轴(124)，或者相对于用于用所述第一成像系统(114)和/或所述第二成像系统(126)进行所述成像的光轴(124)倾斜小于15°、优选地小于5°的角度。
15.根据前述权利要求中任一项所述的装置(100)，其中，所述样本保持器(102)包括配置为保持液体介质的流体腔室。
16.根据权利要求15的装置(100)，其中，所述光学谐振器(106)由所述流体腔室的两个相对表面形成。
17.根据权利要求15或16的装置(100)，还包括泵系统，其中，所述泵系统配置为产生通过所述流体腔室的液体介质流。
18.根据前述权利要求中任一项所述的装置(100)，其中，所述装置(100)包括波长调谐设备、特别是可调谐激光源或可调谐滤波器，其中，所述波长调谐设备配置为调整所述第一波长和/或所述第二波长。
19.根据前述权利要求中任一项所述的装置(100)，其中，所述装置(100)包括用于调整所述光学谐振器的谐振频率的调整机构。
20.根据前述权利要求中任一项所述的装置(100)，还包括用于用第三成像技术对所述样本进行成像的第三成像系统，其中，沿着不同于所述光学谐振器(106)的所述传出光轴(120、122)的轴线、特别是沿着垂直于所述光学谐振器(106)的所述光轴(112)的轴线执行所述成像。
21.一种通过波长相关光程长度增加使用根据前述权利要求中任一项所述的装置(100)对样本(102)进行多色光学成像的方法，所述方法包括以下步骤：
将所述样本(102)放置在光学谐振器(106)中，其中，所述样本放置成使得所述光学谐振器(106)的光轴(112)与所述样本(102)相交；
用第一成像技术以第一波长对所述样本(102)进行成像，其中，沿着所述光学谐振器(106)的传出光轴(122)执行所述成像；以及
用第二成像技术以第二波长对所述样本(102)进行成像，其中，沿着所述光学谐振器(106)的所述传出光轴(122)执行所述成像，以及其中，所述第二波长不同于所述第一波长，
其中，第一精细度和第二精细度选择成使得所述光学谐振器(106)增强用所述第一成像技术的所述成像的第一图像质量指标和用所述第二技术系统的所述成像的第二图像质量指标。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述第一成像技术和所述第二成像技术中的每个均是以下成像技术中的任一个：吸收成像、相衬成像、荧光成像、偏振成像、光声成像、吸收光谱法、荧光光谱法或拉曼光谱法。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述第一成像技术不同于所述第二成像技术。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中，所述样本(102)包括包含成像对象、特别是单独的生物细胞或物质的液体介质，以及其中，将所述样本(102)放置在所述光学谐振器(106)中包括：在流体腔室中提供所述液体介质。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，在流体腔室中提供所述液体介质包括：产生通过所述流体腔室的液体介质流。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中，在所述样本(102)处于适当位置的情况下，所述光学谐振器(106)的第一精细度大于20、优选地大于50。
27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中，在所述样本(102)处于适当位置的情况下，所述光学谐振器(106)的第二精细度小于10、优选地小于5。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中，所述第一波长和/或所述第二波长设置成所述光学谐振器(106)的透射光谱(200)的峰值。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，还包括调整所述第一波长、所述第二波长和/或所述光学谐振器(106)的长度，以相对于所述光学谐振器(106)在所述第二波长的透射来调谐所述光学谐振器(106)在所述第一波长的透射。
30.根据权利要求21至29中任一项所述的方法，还包括用第三成像技术对所述样本(102)进行成像，其中，沿着不同于所述光学谐振器(106)的传出光轴(120、122)的轴线、特别是沿着垂直于所述光学谐振器(106)的所述光轴(112)的轴线执行所述成像。
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