CN112961847B

CN112961847B - 贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶在口腔科室卫生消毒中的应用

Info

Publication number: CN112961847B
Application number: CN202110384391.1A
Authority: CN
Inventors: 孙晓晖; 刘嘉; 周树锋
Original assignee: Fujian Huisheng Biotechnology Co ltd; Huaqiao University
Current assignee: Fujian Huisheng Biotechnology Co ltd; Huaqiao University
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2041-04-09
Also published as: CN112961847A

Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌YtnP‑同源内酯酶及其基因与应用。本发明首先公开了贝莱斯芽孢杆菌YtnP‑同源内酯酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明进一步公开了贝莱斯芽孢杆菌YtnP‑同源内酯酶在牙科椅式设备处理中的应用。本发明贝莱斯芽孢杆菌YtnP‑同源内酯酶能显著抑制铜绿假单胞菌的早期增殖、生物膜形成和毒力因子释放，是降低机会致病菌感染的有效途径，可作为一种新型的牙科卫生治疗消毒剂。

Description

贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶在口腔科室卫生消毒中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说涉及贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶在口腔科室卫生消毒中的应用。

背景技术

现代牙科椅式设备(DCU)使用的水通过牙科单元水管(DUWL)的管道系统供应，可冷却集成的仪器并在牙科治疗过程中用于牙齿冲洗。研究表明DCU水样中的细菌(主要以铜绿假单胞菌为主)数量远远高于饮用水中允许的细菌数量，且细菌通过生物膜的形成适应DUWL的定殖和对消毒药剂的耐受力造成感染而损害健康。目前，标准的用水冲洗程序不能完全去除生物膜，使用抗生素又会引起病原菌耐药，使用戊二醛等化学试剂对病人和牙科人员也有危害。

群体感应(Quorum Sensing，以下简称QS)是一种通过感知自身诱导物浓度来调节种群行为的现象，包括孢子形成、生物膜和毒力表达。典型的QS细菌铜绿假单胞菌是引起口腔感染和继发性疾病的主要人类条件致病菌，和大多数革兰氏阴性病原菌的自动诱导剂被归类为N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactone,AHL)。它是一种等级QS系统，包括LasI-LasR系统感测自身诱导物高丝氨酸内酯，通过影响相关基因的转录和翻译来调节下游RhlI-RhlR和PqsABCDE-PqsR通路。因此，干扰AHLs水平会导致群体猝灭，并影响生物膜形成和毒力表达等基因表达，使细菌不易在DCU中定植污染。到目前为止，关于群体感应猝灭酶(以下简称QQ酶)的研究主要集中在降解AHL信号分子的酶上，包括AHL内酯酶、AHL酰基转移酶和AHL氧化还原酶三类。QQ酶来自于不同的细菌种类，大多来自芽孢杆菌。但由于QQ酶对温度和pH的敏感性在复杂的环境可能使酶失活，QQ酶的应用受到限制。

因此，提供一种能有效降解AHL，显著抑制铜绿假单胞菌的早期增殖、生物膜形成和毒力因子释放的酶类，并能应用在口腔科室卫生消毒中是本领域亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶。

本发明的第二目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶基因。

本发明的第三目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶基因的重组表达载体、细胞系、工程菌或宿主菌。

本发明的第四目的是提供一种贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶基因的重组菌株。

本发明的第五目的是提供一种制备贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶的方法。

本发明的第六目的是提供上述贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶在口腔医疗卫生中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶，被命名为YtnP_DH82，来源于贝莱斯芽孢杆菌DH82菌株，所述贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶是由序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

SEQ ID NO.1：

METLNIGNISLTWLDGGVTHMDGGAMFGVVPKPLWSRKYPVNDKNQIELRTDPILIRKKGLNILVDAGIGRGKFSDKQKRNYGVTQESNLKQSLRDLGLSCEDIHIAAMTHLHFDHACGLTEYSGEELVSVFPNARIITSATEWREMRNPNIRSKNTYWRENWEAVQDQVETFENEYQLTEGITMHHTGGHSDGHSVIVLEDGGEAAVHFADLMPTNAHKNPLWVLAYDDYPMTSIPEKQKWQTFAAEKDAWLIFYHDAIYRAVKWGEDGEVAASVKREKK

该酶由281个氨基酸组成，约30kDa，等势点位于pH5.74，最适温度为18℃，最适pH值为7。该酶没有没有跨膜信号肽，属于细胞质酶，一种亲水性蛋白。含有两个锌离子结合结构域(LactonaseB，Metallo-beta-Lactonase超家族)，具有内酰胺酶活性。

本发明还提供了编码上述内酯酶的基因。本发明通过PCR的方法克隆了编码上述内酯酶的基因，全长为841bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGGAGACATTGAATATTGGGAATATTTCATTAACATGGCTGGACGGCGGTGTAACGCATATGGACGGCGGAGCGATGTTCGGCGTTGTTCCGAAACCTTTATGGTCGAGAAAATACCCCGTAAATGACAAAAACCAGATTGAATTAAGAACAGACCCGATTCTGATCAGAAAAAAAGGCCTGAATATATTGGTTGACGCGGGTATCGGCCGAGGGAAATTCTCTGATAAACAAAAAAGGAATTACGGCGTAACACAGGAATCCAATCTGAAACAATCTCTTCGTGACCTCGGGCTTTCTTGTGAGGACATTCATATTGCCGCGATGACCCATCTTCATTTTGACCATGCATGCGGCCTGACGGAGTACAGCGGAGAGGAGCTTGTCTCTGTTTTCCCGAATGCCCGCATTATCACTTCTGCAACAGAGTGGCGCGAAATGAGAAATCCTAATATCAGATCGAAAAATACATATTGGAGAGAAAATTGGGAGGCGGTACAAGATCAGGTCGAAACCTTTGAGAACGAGTATCAGCTGACAGAAGGCATTACGATGCACCACACCGGCGGCCACAGCGACGGCCACAGCGTCATCGTCTTAGAAGACGGTGGGGAGGCGGCTGTGCATTTTGCCGACCTGATGCCGACGAATGCGCATAAAAATCCGTTATGGGTGCTGGCCTATGATGATTATCCGATGACCTCTATTCCAGAAAAGCAGAAATGGCAGACGTTCGCGGCAGAAAAAGACGCCTGGCTGATTTTCTATCACGACGCGATTTACAGAGCGGTAAAATGGGGAGAAGACGGCGAAGTGGCTGCATCTGTCAAACGGGAGAAAAAATAA

本发明还提供了包含上述内酯酶基因的重组载体，优选为pET28a载体。将本发明的内酯酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将蛋白酶基因插入到质粒pET28a载体上的NdeI和XhoI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组质粒pET28a-YtnP_DH82。

本发明还提供了包含上述内酯酶基因的重组菌体，优选为大肠杆菌BL21-YtnP_DH82。

本发明还提供了一种制备上述内酯酶的方法，包括以下步骤：

S1.以上述重组表达载体转化工程菌，得重组菌株；

S2.培养重组菌株，诱导重组蛋白酶的表达；以及

S3.回收并纯化所表达的贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶。

本发明还提供了上述内酯酶在口腔医疗卫生中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下突出优点：

本发明从贝莱斯芽孢杆菌DH82菌株中克隆得到YtnP-同源内酯酶基因，其编码的YtnP-同源内酯酶具有如下优点：

1.YtnP_DH82能有效降解AHL，显著抑制铜绿假单胞菌的早期增殖、生物膜形成和毒力因子释放，能够防治DCU中水源微生物污染。使用这种具有生物活性、无污染、非抗性、无毒的酶作为替代抗生素和化学物质，是考虑口腔卫生和人体健康的水源处理更为合理的策略。

2.本研究所获得的YtnP-同源内酯酶，来源于深海海水样品筛选获得的菌株，与其他陆源芽孢杆菌相比，低温高压等特殊的海洋生境条件容易诱导菌株产生结构新颖、功能独特的活性物质。经测序比对分析，本研究所获得的内酯酶，与目前所报道的B.subtilisstr.168(Swiss-Prot:O34760.2)来源的YtnP淬灭酶相比，只有79％的同源性，在结构上具有独特性。

3.本研究的YtnP-同源内酯酶与其他现有同源酶相比具有较高的酶活性和酶稳定性，具有更广泛的应用前景和价值。

附图说明

下面结合附图表和具体实施例对本发明作进一步的说明。

图1为贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶的酶活条件图

A图：温度；B图：PH；C图：金属离子

图2为贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶生物信息学分析与蛋白质纯化图。其中，A图：YtnP_DH82的预测3D结构。

B图：YtnP_DH82酶制剂的SDS-PAGE分析。

第一道：蛋白质标记；

第二道：非负载pET28a载体的提取；

第三道：粗的YtnP_DH82酶提取；

第四道：纯化的YtnP_DH82酶提取。

凝胶中的靶蛋白条带用红色框标记。

图3为贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶对AHLS降解的活性图。

其中：通过报告操纵子(LuxR-P_luxI-lacO-RFP)的相对荧光强度测定YtnP_DH82的降解活性。实验组加入分别用YtnP_DH82处理的AHLs(黄色的C6-HSL和青色的3-O-C12-HSL)，与AiiA_3DHB作为阳性对照相比，未处理的AHLs的对照检查(CK。统计学分析结果以标记为*的显着性差异(p值显著差异<0.01标记为***，0.01<p值显著差异为0.05标记为**)。

图4为贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶对铜绿假单胞菌的细菌阻断作用图。

将1.5mg/mL的YtnP_DH82接种于细菌培养液中进行处理，分别在600nm、580nm、520nm和620nm处用微板测定细菌密度、生长曲线、生物膜积累、绿脓素和鼠李糖脂的释放量。

A图为铜绿假单胞菌生长曲线(红色为酶处理菌培养，黑色为阴性对照)；

B图为释放的花青素

C图为释放的鼠李糖脂(酶处理轻青色细菌培养，未处理青色细菌培养，海军中添加AHLs细菌培养)。

误差条用于来确定标准偏差。统计分析结果以显著性差异(用*表示)(p<0.01的显著性差异标记为***，0.01<p<0.05的显著差异标记为**)。

图5为贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶对铜绿假单胞菌生物膜及其调控基因影响图。

A图为铜绿假单胞菌形成的生物膜(浅黄色为酶处理生物膜，黄色为未处理生物膜，橙色为添加AHLs生物膜)；

B图为铜绿假单胞菌生物膜形成基因algD表达量。

图6为贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶对铜绿假单胞菌的防污性能效果图。

1.5mg/mL YtnP_DH82与细菌培养液混合，连续泵送0.22μm PTEE滤膜3天(生物量积累用扫描电镜观察)。

A图：YtnP处理或未处理的PTEE滤膜的渗透性；

B图：放大1.5万倍下的YtnP_DH82处理的PTEE膜；

C图：放大1.5万倍下的未处理PTEE膜。

通过每分钟流经处理过的PVDF滤膜的无菌水流量(g/min)来确定渗透性。在600nm处用紫外吸光度法测定生物膜生物量。误差棒表示标准差。

图7为贝莱斯芽孢杆菌YtnPDH82对生物膜流动池培养模型的清洁性能效果图。

A图：荧光成像系统下流动池培养模型循环体系中的生物膜和游离态细菌

B图：荧光成像系统下水冲洗后残留的细菌生物膜

C图：荧光成像系统下YtnP处理后无残留的细菌生物膜

D图：光学显微镜下水冲洗后在进出口处残留的细菌生物膜

E图：光学显微镜下YtnP处理后进出口处无残留的细菌生物膜

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体

贝莱斯芽孢杆菌DH82菌株(GenBank:MK203035)是从西太平洋雅浦海沟6000米深处的海水样品中分离到的，由中国自然资源部第三海洋研究所(厦门)提供。

铜绿假单胞菌PAO1由厦门大学(厦门)提供。

大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)活性细胞购自Transgen(中国北京)。

2、酶类和其他试剂

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和卡那霉素的活性细胞购自Transgen(中国北京)

限制性内切酶和连接酶购自大连高川生物技术有限公司。

质粒提取小型试剂盒(Cat.GMK5999)和凝胶提取试剂盒(Cat.D2500-02)购自Promega。

N-(β-酮己基)-DL高丝氨酸内酯(C6-(L)-HSL，Cat.K3255)和(3-氧代癸酰基)-L-高丝氨酸内酯(3-氧代-C12-(L)-HSL，Cat.09139)购自美国Sigma Aldrich公司。

苏云金芽孢杆菌(GenBank:AY943832)的N-酰基高丝氨酸内酯水解酶(PDB:3DHB)由厦门大学(厦门)提供。

LuxR-P_luxI-lacO-RFP的AHL报告操纵子由厦门大学(厦门)提供。

所有菌株均在Luria Bertani(LB)培养基中培养。

下面结合实施方式对本发明进一步说明，应理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，并不限制本发明的保护范围。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶基因的克隆

(1)贝莱斯芽孢杆菌基因组DNA的提取

贝莱斯芽孢杆菌培养物在37℃下孵育，180rpm摇动12小时，8000rpm离心10min，得到细菌颗粒。用CTAB法从颗粒中提取DH82菌株基因组DNA 100ng。

(2)贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶基因的克隆

用PCR方法从基因组DNA中扩增出YtnP_DH82的序列

PCR引物由Sangon生物技术(上海)有限公司合成合成。

引物序列为：

正向引物YtnP-F：5′-GGAATTCATGGAGACATTGAATATTGGGAATTTTC-3′；

反向引物YtnP-R：5′-GGAATTCATGGAGACATTGAATATTGGGAATATTTC-3′。

按照Takara PrimeSTAR试剂盒操作说明，以贝莱斯特芽孢杆菌DH82基因组DNA(100ng)为模板。

PCR扩增程序：98℃预变性10s；98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸5s，进行32个循环；最后72℃延伸10s。PCR产物利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化片段长度约841bp的阳性产物。

3)序列测定

PCR产物纯化后，送厦门铂瑞生物科技有限公司进行序列测定，其序列如下(如SEQID NO:2所示)：

实施例2贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶工程菌的构建

分别用限制性内切酶NdeI和XhoI消化PCR产物，然后用Takara连接试剂盒(T4连接酶)在pET28a载体上的多个克隆位点之间连接。表达克隆分别由T7启动子驱动，质粒上的His标记编码序列将组氨酸编码到靶蛋白的N端。阳性克隆在大肠杆菌DH5α中扩增，转移到大肠杆菌BL21中进行蛋白表达。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶的制备

3小时后将0.4mM IPTG接种到细菌培养物中诱导YtnP_DH82的表达，培养20小时后收获细菌集团颗粒，用溶解缓冲液[300mM NaCl，50mM NaH₂PO4(pH 7.4)]重悬，然后用咪唑洗脱缓冲液[300mMNaCl，200mM咪唑，50mM NaH₂PO4(pH 7.4)]洗涤。采用高亲和力NI-NTA层析纯化目的蛋白。纯化后的蛋白经SDS-PAGE进一步分析。

实施例4贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶部分性质分析

(1)YtnP_DH82的生物信息学分析与表达

利用NCBI-BLAST软件对得到的序列进行分析，并利用MEGA7.0软件采用泊松校正法计算最大似然树。采用瑞士模型模拟酶的三维结构(https://swissmodel.expasy.org/).利用TMHMM2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？Tmhmm-2.0).分析了包括智能域(http://smart.embl-heidelberg.de/)在内的生物信息学信息。

在PH值为7.5的测酶活力体系中,在温度分别为18℃、25℃、37℃、45℃、55℃、65℃中保温45min，加入适量的酶液，以AHL为底物。以反应的温度对酶活力作图(图1中的A图),求得该酶催化反应的最适温度为18℃。

在28℃的测活体系中，改变磷酸盐缓冲液的PH值分别为2、4、6、7、8，测定PH对蛋白酶催化的酶活力的影响,以酶活力降解能力作图(图1中的B图)。由图可知该酶催化反应的最适PH值为7。

在28℃，PH为7.5的测活体系中，加入不同金属离子Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、K⁺、Na⁺、NH⁴⁺，对蛋白酶催化的酶活力的影响,以酶活力降解能力作图(图1中的C图)。YtnP_DH82与对照相比，加入Mg²⁺、Ca²⁺、Na⁺、NH⁴⁺可提高酶活，Zn²⁺、K⁺抑制酶活性。

YtnP_DH82由281个氨基酸组成，其电位点为5.74；疏水性为-0.209，是一种亲水性蛋白；不稳定指数为44.2，是一种不稳定的蛋白且无跨膜信号肽，属于胞内酶。与其他已知的AHL-Lactonase一样，YtnP_DH82含有两个锌结合结构域(LactonaseB，Metallo-beta-Lactonase超家族)，具有内酰胺酶活性。对酶结构的三维建模进行了模拟，如图2中的A图所示。在0.1mM IPT G诱导下，在18℃孵育20h，用Ni²⁺亲和层析从细菌萃取中提取工程YtnP_DH82的靶蛋白，如图2中的B图所示。浓度为15mg/mL。YtnP_DH82氨基酸序列如下(如SEQ ID NO:1所示)：

实施例5贝莱斯芽孢杆菌YtnP_DH82的效果评价

(1)AHLs降解能力的体外评价

报告基因operon，LuxR-P_luxI-lacO-RFP，用于体外评估游离状态下AHLs的水平。如图3所示，以绿脓杆菌的两个典型QS信号C6-HSL或C12-HSL作为底物，以苏云金芽孢杆菌的AiiA为阳性对照，评估工程化YtnP_DH82的降解能力。YtnP_DH82对3-O-C6-HSL、3-O-C12-HSL、3-O-C10-HSL的降解能力相对于对照组表现为极其显著差异(p<0.01),对C6-HSL、3-O-C4-HSL的降解能力相对于对照组表现为显著差异(0.01<p<0.05)。与同组内的信号分子相对荧光强度相比，加入分别降低3-O-C6-HSL的1.9倍、3-O-C12-HSL的0.7倍、3-O-C10-HSL的0.3倍、3-O-C10-HSL的1.3倍，降低C6-HSL、3-O-C4-HSL的1.8倍。苏云金杆菌AiiA3DHB与AiiADH82针对3-O-C6-HSL、C6-HSL、3-O-C4-HSL、3-O-C12-HSL、3-O-C10-HSL的降解能力相对于对照组表现为极其显著差异(p<0.01)，相比相对荧光强度相比最高降低13倍。

(2)对铜绿假单胞菌细菌致病性的影响

如图4中的A图所示，铜绿假单胞菌PAO1的生长曲线在添加或不添加YtnP_DH82时没有明显差异，但在延迟期的前2小时，观察到的细菌生长曲线斜率低于没有贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶的情况下，说明贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶在低细胞密度下抑制了细菌生物量的增加，当细胞密度达到对数期后，贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶对细菌没有影响。

如图4中的B图所示,添加YtnP_DH82后，对绿脓杆菌素没有显著性影响，对鼠李糖脂的毒力因子表达均显著下调，如图5中的C图和图5中的D图所示。结果表明，YtnP_DH82的QQ介导AHLs水平，抑制鼠李糖脂的释放，降低铜绿假单胞菌的致病性和潜在危险性。

(3)对铜绿假单胞菌细菌生物膜的影响

如图5中的A图所示，YtnP_DH82的存在显著抑制了铜绿假单胞菌PAO1生物膜的形成(P＝0.0013)，而外源C6-HSL和C12-HSL对细菌生物膜生物量的增加没有显著差异，这表明YtnP_DH82通过降解细菌培养中的AHLs来阻断铜绿假单胞菌PAO1生物膜的形成，验证了外源AHLs一旦在阈值水平上产生内源性AHLs，不会影响生物量的增加。

如图5中的B图所示，相较于对照组加入YtnP_DH82酶液后algD基因2、4和12h时显著降低，表现为显著的差异(p<0.05)。在生长期12h时降幅最大，表达量降低了93％，因此加入YtnP_DH82在生长期均抑制了algD的表达量。对于铜绿假单胞菌等级群体感应来说，淬灭酶有效的降解信号分子会显著的影响下游基因的表达，这可能是生物膜表达量下降的主要原因之一。

(4)YtnP_DH82在过滤器上应用效果试验

用YtnP_DH82处理铜绿假单胞菌PAO1，测定细菌生物膜的形成和膜的通透性。如图6所示，YtnP_DH82处理显著抑制了铜绿假单胞菌PAO1在PTEE膜上的污染，实验组用游离YtnP_DH82溶液处理后仍保持较高的膜透性，而不含YtnP_DH82的膜在3天后已被铜绿假单胞菌PAO1形成的生物膜阻隔，图5中的A图的结晶紫染色和膜通量测定结果以及图5中的B图污垢层的SEM图像也证明了YtnP_DH82的防污能力。结果表明，YtnP_DH82处理可作防污的有效策略。

(5)YtnP_DH82在模拟DUWL上应用效果试验

表达GFP的铜绿假单胞菌PA01接种于循环流式细胞生物膜上，室温下培养5天。利用CRI-Maestro宏观荧光成像仪进行荧光成像，可以无损地评估流动细胞单元塑料和玻璃表面生物膜生长的荧光。在光谱分解后，细菌的绿色荧光与流动细胞的自发荧光相比清晰可见。图7中的A图显示了一个未经处理的流动池，在流动池的背景(红色为背景色)上同时包含浮游细菌和生物膜细菌(绿色)。图7中的B图显示了用3个系统体积的水以60mL/min的速度冲洗后的相同流动池。水冲洗清楚地去除了流动池室中的浮游细菌，但仍然可以看到明亮的荧光(箭头所示)，表明存在残余生物膜，尤其是在流动室的入口和出口周围，那里的流动可能不太湍急。这种情况很可能会模拟DUWL中狭窄的管腔和死腔，在那里保留的生物膜可能很难被冲走。图7中的C图显示了在用3个系统体积的水以60mL/min的速度冲洗后，在同一流动池中用额外的YtnP溶液形成生物膜。使用YtnP_DH82后，不能检测到指示生物膜存在的绿色荧光。

因此，我们在光学显微镜下对生物膜进行了镜检。图7中的D图和图7中的E图显示了含有生物膜的流动池入口的布莱特菲尔德图像，其中生物膜的去除受到生物膜形成环境的物理特征的影响。光学显微镜可以观察到仅采用水冲洗处理的流动池入口处有大量生物膜(图7中的D图)，而采用YtnP_DH82和水冲洗处理的流动池入口处的生物膜在图7中的E图中不再明显。这一观察值得注意，因为设备连接处的流动可能会受到阻碍，更容易形成生物膜。在我们的实验中，用水快速冲洗减少了流动细胞通道中心的生物膜，但没有完全去除。用水冲洗似乎不能有效去除渠道末端的生物膜，但YtnP_DH82处理能够去除这些区域的生物膜。

综上所述，本研究从西太平洋雅浦海沟6000米深处分离的一株潜在的益生菌贝莱斯芽孢杆菌DH82株中克隆了YtnP-同源内酯酶，并对其进行了异源表达，以研究其在改善铜绿假单胞菌生物膜感染引起的口腔卫生问题上的应用。假单胞菌从牙科设备中分离，分别在实验室测试了YtnP的防污活性。结果表明，YtnP-同源内酯酶能降解铜绿假单胞菌N-酰基高丝氨酸内酯，显著抑制铜绿假单胞菌抑制早期增殖、生物膜形成和毒力因子(pyocyanin和鼠李糖脂)的产生，对铜绿假单胞菌具有良好的防污作用，是降低机会致病菌感染的有效途径。本研究结果提示，YtnP-同源内酯酶可作为一种新型的牙科卫生治疗消毒剂。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110> 华侨大学

<120> 一种贝莱斯芽孢杆菌ytnp-同源内酯酶及其基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 281

<212> PRT

<213> 贝莱斯特芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 1

Met Glu Thr Leu Asn Ile Gly Asn Ile Ser Leu Thr Trp Leu Asp Gly

1 5 10 15

Gly Val Thr His Met Asp Gly Gly Ala Met Phe Gly Val Val Pro Lys

20 25 30

Pro Leu Trp Ser Arg Lys Tyr Pro Val Asn Asp Lys Asn Gln Ile Glu

35 40 45

Leu Arg Thr Asp Pro Ile Leu Ile Arg Lys Lys Gly Leu Asn Ile Leu

50 55 60

Val Asp Ala Gly Ile Gly Arg Gly Lys Phe Ser Asp Lys Gln Lys Arg

65 70 75 80

Asn Tyr Gly Val Thr Gln Glu Ser Asn Leu Lys Gln Ser Leu Arg Asp

85 90 95

Leu Gly Leu Ser Cys Glu Asp Ile His Ile Ala Ala Met Thr His Leu

100 105 110

His Phe Asp His Ala Cys Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Gly Glu Glu Leu

115 120 125

Val Ser Val Phe Pro Asn Ala Arg Ile Ile Thr Ser Ala Thr Glu Trp

130 135 140

Arg Glu Met Arg Asn Pro Asn Ile Arg Ser Lys Asn Thr Tyr Trp Arg

145 150 155 160

Glu Asn Trp Glu Ala Val Gln Asp Gln Val Glu Thr Phe Glu Asn Glu

165 170 175

Tyr Gln Leu Thr Glu Gly Ile Thr Met His His Thr Gly Gly His Ser

180 185 190

Asp Gly His Ser Val Ile Val Leu Glu Asp Gly Gly Glu Ala Ala Val

195 200 205

His Phe Ala Asp Leu Met Pro Thr Asn Ala His Lys Asn Pro Leu Trp

210 215 220

Val Leu Ala Tyr Asp Asp Tyr Pro Met Thr Ser Ile Pro Glu Lys Gln

225 230 235 240

Lys Trp Gln Thr Phe Ala Ala Glu Lys Asp Ala Trp Leu Ile Phe Tyr

245 250 255

His Asp Ala Ile Tyr Arg Ala Val Lys Trp Gly Glu Asp Gly Glu Val

260 265 270

Ala Ala Ser Val Lys Arg Glu Lys Lys

275 280

<210> 2

<211> 846

<212> DNA

<213> 贝莱斯特芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 2

atggagacat tgaatattgg gaatatttca ttaacatggc tggacggcgg tgtaacgcat 60

atggacggcg gagcgatgtt cggcgttgtt ccgaaacctt tatggtcgag aaaatacccc 120

gtaaatgaca aaaaccagat tgaattaaga acagacccga ttctgatcag aaaaaaaggc 180

ctgaatatat tggttgacgc gggtatcggc cgagggaaat tctctgataa acaaaaaagg 240

aattacggcg taacacagga atccaatctg aaacaatctc ttcgtgacct cgggctttct 300

tgtgaggaca ttcatattgc cgcgatgacc catcttcatt ttgaccatgc atgcggcctg 360

acggagtaca gcggagagga gcttgtctct gttttcccga atgcccgcat tatcacttct 420

gcaacagagt ggcgcgaaat gagaaatcct aatatcagat cgaaaaatac atattggaga 480

gaaaattggg aggcggtaca agatcaggtc gaaacctttg agaacgagta tcagctgaca 540

gaaggcatta cgatgcacca caccggcggc cacagcgacg gccacagcgt catcgtctta 600

gaagacggtg gggaggcggc tgtgcatttt gccgacctga tgccgacgaa tgcgcataaa 660

aatccgttat gggtgctggc ctatgatgat tatccgatga cctctattcc agaaaagcag 720

aaatggcaga cgttcgcggc agaaaaagac gcctggctga ttttctatca cgacgcgatt 780

tacagagcgg taaaatgggg agaagacggc gaagtggctg catctgtcaa acgggagaaa 840

aaataa 846

Claims

1.SEQ ID NO.1所示的贝莱斯芽孢杆菌YtnP-同源内酯酶在制备牙科卫生消毒剂方面的应用。