CN112957468B - 结合α-生育酚琥珀酸酯的二硫化钼纳米片及制备方法和应用 - Google Patents

结合α-生育酚琥珀酸酯的二硫化钼纳米片及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了结合α‑生育酚琥珀酸酯的二硫化钼纳米片及制备方法和应用，属于生物医学领域。本发明通过水热法合成可生物降解的二维二硫化钼纳米片，再用EDC化学方法将靶向配体叶酸和抗癌药物α‑生育酚琥珀酸酯分别与聚乙二醇硫辛酸偶联，最后将硫辛酸‑聚乙二醇‑叶酸和硫辛酸‑聚乙二醇‑生育酚琥珀酸酯的功能性PEG链通过二硫键修饰到MoS2纳米片上制备得到了结合聚乙二醇化的α‑生育酚琥珀酸酯和聚乙二醇化的叶酸的二维二硫化钼纳米片。本发明制备二维二硫化钼纳米片具有良好的生物降解性、高PCE、良好的光热稳定性、良好的生物相容性、特异性靶向性、选择性抗癌活性和增强肿瘤聚集性，可用于靶向多模态成像和肿瘤治疗。

Description

结合α-生育酚琥珀酸酯的二硫化钼纳米片及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别是涉及结合α-生育酚琥珀酸酯的二硫化钼纳米片及制备方法和应用。
背景技术
近年来，纳米药物被广泛开发使用，在纳米载体中装载共价连接的化疗药物取代传统的游离药物(如阿霉素、吉西他滨或紫杉醇)是一种常见的开发思路。纳米载体能够防止血液循环中的药物泄漏或提高靶向癌症的药物浓度，从而提高抗癌活性，减少全身副作用。但是在目前的研究中，尽管构建的纳米载体越来越复杂，这些纳米药物产品的临床转化成功率却仍然很低。因此，在临床治疗中，化疗通常与其他治疗手段(如基因/光热疗法、光/化学动力疗法)结合使用。其中光热疗法作为一种无创的肿瘤治疗方法，具有定位精确、疗效高、副作用小、时空可控性强等优点，可作为癌症晚期失去手术机会的体弱患者的替代治疗方案。
与其他策略相比，光热疗法和目前已获批准的化疗方案相结合，由于其独特的优势，是目前最有可能第一个实现临床转化的方法。现有研究报道了用光热疗法预处理肿瘤能够增加纳米药物的积累、渗透和分布，纳米载体也能够改善光热疗法的结果。然而，对于大多数光热增敏剂来说，由于其具有肿瘤聚集性不足和光热转换效率(PCE)较低等缺点，在进行临床实验时，实验者不得不增加注射剂量和/或使用过高的近红外(NIR)照射功率(1.0-3.0W/cm2)，以保证升温和肿瘤消融效果。根据美国国家标准协会(ANSI)制定的安全标准，此类近红外激光照射剂量明显高于皮肤的最大安全允许暴露量(MPE)(例如，808nm时为0.33W/cm2)。因此，有必要在临床试验前设计出新的纳米治疗平台，并对其有效性和安全性进行综合评估。
在临床转化方面，关键的问题是为靶向疾病选择合适的治疗药物和组合方案，而不是制备更加复杂的纳米材料。目前，2D纳米材料作为一种理想的光热剂，以其较高的光热转化效率、超大的比表面积、易于表面改性等优点在生物医学领域引起了广泛的关注。特别是具有优良生物相容性和生物降解性的2D二硫化钼(MoS2)，有望被开发为前所未有的纳米载体，以结合其他功能性药物用于癌症治疗。维生素E衍生物α-生育酚琥珀酸酯(α-TOS)作为低副作用的化疗药物越来越受到重视，其通过诱导细胞凋亡对多种人类癌症具有良好的抗癌活性，同时对正常细胞无毒性。但是α-TOS的水溶性较差，极大地限制了其应用。
目前，对于大多数肿瘤的治疗，影像学定位后手术切除联合术后化疗是最佳选择。卵巢癌是最致命的妇科肿瘤之一，由于其缺乏特异性症状和准确的影像学诊断方法，70％的患者确诊时即为晚期。然而，晚期癌症患者由于巨大的手术风险常常不能再进行侵入性手术。因此，迫切需要开发出具有多模态成像、高效治疗、副作用轻微等优点的新型治疗策略和纳米载体，为失去手术机会的晚期卵巢癌患者提供新的治疗方式。
发明内容
本发明的目的是提供一种由聚乙二醇化的α-生育酚琥珀酸酯和聚乙二醇化的叶酸修饰的二维二硫化钼纳米片，以解决上述现有技术存在的问题，提供一种具有良好的生物降解性、高PCE、良好的光热稳定性、良好的生物相容性、特异性靶向性、选择性抗癌活性和增强肿瘤聚集性，可用于靶向多模态成像和增强肿瘤治疗，副作用可忽略不计的纳米平台，为晚期卵巢癌患者的临床治疗提供新的工具。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种二维二硫化钼纳米片，所述二维二硫化钼纳米片由聚乙二醇化的α-生育酚琥珀酸酯和聚乙二醇化的叶酸通过二硫键修饰。
本发明还提供一种所述的二维二硫化钼纳米片的制备方法，所述制备方法步骤包括：首先合成二维二硫化钼纳米片，将靶向配体叶酸和抗癌药物α-生育酚琥珀酸酯分别与聚乙二醇硫辛酸偶联，最后将硫辛酸-聚乙二醇-叶酸和硫辛酸-聚乙二醇-生育酚琥珀酸酯的功能性PEG链通过二硫键修饰到MoS2纳米片上，得到结合聚乙二醇化的α-生育酚琥珀酸酯和聚乙二醇化的叶酸的二维硫化钼纳米片。
优选的，所述制备方法中合成二维二硫化钼纳米片的方法为水热法。
优选的，所述制备方法中将靶向配体叶酸和抗癌药物α-生育酚琥珀酸酯分别与聚乙二醇硫辛酸偶联的方法为EDC法。
本发明还提供所述的二维二硫化钼纳米片在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。
本发明还提供所述的二维二硫化钼纳米片在制备选择性化疗治疗卵巢癌的药物中的应用。
本发明还提供所述的二维二硫化钼纳米片作为光热剂的应用。
本发明还提供所述的二维二硫化钼纳米片在制备用于靶向多模态成像的医疗用品中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明制备的由聚乙二醇化的α-生育酚琥珀酸酯、聚乙二醇化的叶酸修饰的二维二硫化钼纳米片(MPTF)具有良好的生物降解性、高PCE、良好的光热稳定性、良好的生物相容性、特异性靶向性、选择性抗癌活性和增强肿瘤聚集性，可用于靶向多模态成像和增强肿瘤治疗，其副作用可忽略不计。MPTF可用于卵巢癌术前多模态成像定位，随后触发高效光热疗法，在安全的近红外辐射下彻底消融整个实体瘤，最后通过选择性化疗杀死局部浸润转移的癌细胞，防止复发。基于体外和体内实验结果，所开发纳米粒子可作为卵巢癌临床前纳米药物库的候选方案。对于虚弱的晚期卵巢癌患者，光热联合选择性化疗是替代临床手术和化疗的理想策略，可避免手术的高风险和全身化疗的严重副作用。本发明所设计的纳米平台将为新一代纳米医学在临床上的应用提供蓝图。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为LA-PEG-FA和LA-PEG-TOS在重水中的1H核磁共振谱；
图2中(a)为TEM图像；(b)为SEM图像；(c)为MoS2纳米片和MPTF的TGA曲线，上方曲线为MoS2纳米片，下侧曲线为MPTF；(d)为MoS2纳米片、LA-PEG-TOS、LA-PEG-FA和MPTF的UV-vis-NIR光谱，由上至下依次为MoS2纳米片、LA-PEF-TOS、LA-PEG-FA、MPTF；(e)为MPTF降解后0、1、3天的TEM图像；(f)为不同浓度MPTF在808nm激光(1w/cm2)照射300S下的光热转换能力图，图中由上至下分别代表浓度为2.0mg/ml、1.5mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml的MPTF以及水；(g)为ΔT随MPTF浓度的变化图；(h)为在不同激光功率的近红外辐射下，MPTF水溶液(1.0mg/mL)的温度升高图，由上至下分别代表激光功率为1.0w/cm2、0.8w/cm2、0.5w/cm2和0.3w/cm2；(i)为近红外辐射(808nm，0.3W/cm2)和冷却(激光关闭)阶段MPTF(1.0mg/mL)的温度与时间曲线图，激光辐照300s后关闭；(j)为冷却时间与-lnθ曲线；(k)为MPTF(1.0mg/mL)水溶液在近红外辐射(808nm，0.3W/cm2)下五个循环(每个循环中激光打开300s后关闭直至降至室温)下的温度曲线；
图3为MoS2纳米片和MPTF在水中的流体力学尺寸；
图4为MoS2纳米片和MPTF在水中的表面电位；
图5为不同激光功率下808nm激光辐照300s后，MPTF(1.0mg/mL)水溶液的温度变化图(ΔT)；
图6中(a)为CCK8在不同浓度MPF作用24小时、48小时和72小时后SKoV3细胞活力的测定图，图中每组由左至右分别代表MPF作用24小时、48小时和72小时；(b)为FITC-鬼笔环肽和DAPI染色的SKoV3细胞暴露于不同浓度MPF 48小时(×400)的CLSM图像；(c)为不同浓度MoS2-PEG和MPF作用4h后SKoV3细胞的Mo吸收量，图中每组左侧为MoS2-PEG，右侧为MPF；(d)为用浓度为0.5mg/mLMoS2-PEG-FI孵育4小时(×400)的SKoV3细胞的CLSM图像；(e)为用浓度为0.5mg/mL的MPF-FI孵育4小时(×400)的SKoV3细胞的CLSM图像；
图7中(a)为SKoV3细胞用不同TOS浓度的PBS、α-TOS、MPTF处理24小时和48小时后的存活率测定，图中0组为对照组，其左侧为PBS处理24小时，右侧为PBS处理48小时，其余组中柱由左到右依次代表α-TOS处理24小时、α-TOS处理48小时、MPTF处理24小时、MPTF处理48小时；(b)为Lec1细胞用不同TOS浓度的PBS、α-TOS、MPTF处理24小时和48小时后的存活率测定，图中0组为对照组，其左侧为PBS处理24小时，右侧为PBS处理48小时，其余组中由左到右依次代表α-TOS处理24小时、α-TOS处理48小时、MPTF处理24小时、MPTF处理48小时；(c)为用或不用NIR辐照(808nm，0.3W/cm2)10分钟后SKoV3细胞的CCK8活性，每组中左侧代表培养24小时，右侧代表培养48小时；(d)为用PBS、α-TOS、MPTF处理24小时和48小时后的SKoV3细胞的激光共聚焦图像(Hoechst33342染色)(×200)；(e)为不同处理后SKoV3细胞的流式细胞仪检测结果；(f)为不同处理后SKoV3细胞(细胞骨架FITC-鬼笔环肽染色，细胞核DAPI染色)的CLSM图像(×400)；
图8为α-TOS和MPTF对SKoV3细胞的24小时或48小时的IC50图。
图9为裸鼠尾静脉注射(I)MPT和(II)MPTF后不同时间点SKoV3肿瘤的CT(a)和PA(b)图像及相应的CT(c)和PA(d)值，图中上侧曲线代表(II)MPTF，下侧曲线代表(I)MPT；(e)为裸鼠皮下注射(I)MPT和(II)MPTF后SKoV3肿瘤在近红外辐射下的温度分布，图中上侧曲线代表(II)MPTF，下侧曲线代表(I)MPT；(f)为裸鼠皮下注射(I)MPT和(II)MPTF后SKoV3肿瘤在近红外辐射下的热成像图；(g)为静脉注射(I)MPT和(II)MPTF后1h肿瘤组织的TEM图像；
图10中(a)为安全近红外照射下MPTF联合化疗的示意图和时间线；(b)为第6天和第46天不同治疗后裸鼠的数码照片；(c)为不同治疗组裸鼠肿瘤随时间的变化曲线，图中由上至下分别为生理盐水(NIR+)，MPF(NIR-)，生理盐水(NIR-)，MPT(NIR-)，MPTF(NIR-)，MPT(NIR+)，MPF(NIR+)，MPTF(NIR+)；(d)为不同治疗组的体内血液生化指标,每组由左至右分别为BU、AST、ALT、CK、CK-MB、LDH；(e)为不同治疗组肿瘤切片的TUNEL染色(×100)；(f)为不同治疗组裸鼠存活率的变化，出现死亡由早到晚分别为生理盐水(NIR-)，生理盐水(NIR+)，MPF(NIR-)，MPT(NIR-)，MPTF(NIR-)，MPT(NIR+)，MPF(NIR+)，MPTF(NIR+)；(g)为注射MPTF后不同时间钼元素在不同器官和肿瘤中的生物分布，每组由中由左至右分别代表注射后0.5小时、1小时、2小时、6小时、12小时、24小时、48小时；
图11为不同治疗组肿瘤细胞凋亡率的定量分析结果图；
图12为各组裸鼠第46天心、肝、脾、肺、肾H&E染色图(×200)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例所使用材料中，四硫代钼酸铵((NH4)2MoS4)、氢氧化肼((N2H4)·H2O，98％)和硫辛酸(LA，98％)购自强生中国化工有限公司(中国北京)。叔丁氧基羰基保护的含胺基聚乙二醇(BocNH-PEG-NH2)购自上海燕益生物技术有限公司(中国上海)。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基亚砜(DMSO)、盐酸(HCl)、叶酸(FA)、异硫氰酸荧光素(FITC)、多聚甲醛、
Figure GDA0003028273190000061
X-100和牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)。α-生育酚琥珀酸酯(α-TOS)从湖北恒硕化工有限公司(中国武汉)购买。SKoV3细胞(人卵巢癌细胞系)购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。胎牛血清(FBS)购自杭州金杜尔生物技术有限公司(杭州)。青霉素、链霉素和胰蛋白酶从HyClone Lab.，Inc.(犹他州洛根)购买。4'，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)和Hoechst33342从中国上海贝斯特生物有限公司获得。FITC-鬼笔环肽由Invitrogen(加利福尼亚州卡尔斯巴德)提供。截留分子量(MWCO)为1000和8000-14000的再生纤维素透析膜从费希尔科学公司(宾夕法尼亚州匹兹堡)获得。所有实验中使用的水均采用Milli-Q+185净水系统(Millipore，Bedford，MA)进行净化，其电阻率高于18.2MΩ·cm。任何从其他途径获得的相同试剂均具有与上文所述试剂相同的效果，本发明中所使用的其他未列出的材料与试剂均可从商业途径获得。
本发明实施例采用单因素方差分析(ANOVA)统计方法对实验数据进行评价。选择0.05作为显著性水平，数据分别用(*)表示p<0.05，(**)表示p<0.01，(***)表示p<0.001。
实施例1
1、实验方法
1.1MPTF的合成
采用水热法合成可生物降解的MoS2纳米片。将溶于10ml水中的(NH4)2MoS4粉末(50mg)搅拌30min，然后超声搅拌10min，使粉末完全溶解。随后，在搅拌下添加0.227mL(N2H4)·H2O，然后进一步超声处理30分钟。将反应混合物转移至含50mL聚四氟乙烯的不锈钢高压灭菌器中。之后，将高压灭菌器置于200℃的烘箱中10h。最后，冷却至室温后得到黑色溶液，然后离心(10000rpm，10min)，用水冲洗5次，收集MoS2纳米片。
用EDC化学方法将靶向配体FA和抗癌药物α-TOS分别与聚乙二醇硫辛酸(LA)偶联，根据核磁共振积分，计算出每个PEG链中的FA和α-TOS数目。用EDC化学方法分别合成LA-PEG-FA和LA-PEG-TOS的步骤如下：溶解于3mL DMSO中的FA(44.1mg)或α-TOS(53.1mg)在剧烈搅拌下被EDC(96.0mg，溶于2mL DMSO中)活化30min，然后再添加NHS(57.5mg，溶于2mLDMSO中)反应3h。之后，将溶解于3mL DMSO中的BocNH-PEG-NH2(200mg)添加到上述溶液中反应3天，然后再添加200μL HCl(3-4M)反应1-2h以去除-Boc基团。然后使用透析膜(MWCO＝1000)将反应混合物与水(共9次，每次2L水)透析3天后冻干，获得NH2-PEG-FA或NH2-PEG-TOS。此外，根据上述方案，分别用EDC(96.0mg，溶于2mL DMSO)和NHS(57.5mg，溶于2mLDMSO)活化LA(20.6mg，溶于3mL DMSO中)。之后将溶解于3mL二甲基亚砜中的NH2-PEG-FA(244mg)或NH2-PEG-TOS(253mg)加入上述溶液中反应3天。用透析膜(MWCO＝1000)透析反应混合物并冷冻干燥以得到最终产物LA-PEG-FA或LA-PEG-TOS。
分散在5ml水中的MoS2纳米片(50mg)与LA-PEG-FA(250mg，3ml水中)和LA-PEG-TOS(250mg，3ml水中)反应12h，将LA-PEG-FA和LA-PEG-TOS的功能性PEG链通过二硫键修饰到MoS2纳米片上，用透析膜(MWCO＝8000-14000)透析，冻干得到聚乙二醇、α-TOS和叶酸(FA)共轭的2D-MoS2纳米片(MoS2-PEG-TOS-FA，MPTF)。在与实验条件相同的条件下制备了MoS2-PEG-TOS,MoS2-PEG-FI和MoS2-PEG-FA-FI三种样品。
1.2MPTF的表征
核磁共振：在Bruker AV400核磁共振波谱仪上，以重水为溶剂，采集了核磁共振氢谱。
TEM成像：透射电子显微镜(TEM)成像在JEOL 2010F分析电子显微镜(JEOL，东京，日本)上进行，其工作电压为200千伏。样品的制备方法是将稀释后的颗粒悬浮液沉积在覆碳铜板栅上，并在成像前风干。
SEM成像：扫描电子显微镜成像在日立(日本东京)场发射扫描电子显微镜(FESEM)上进行，其工作电压为在5kV。将稀释后的颗粒悬浮液沉积在铝箔上，在成像前风干，然后在样品上喷镀一层厚度为10nm的金薄膜。
UV-vis光谱：使用Lambda 25UV-vis分光光度计(马萨诸塞州波士顿市Perkinemer)记录UV-vis光谱。
热重分析(TGA)：使用TG 209F1热重分析仪(耐驰仪器有限公司，Selb/Bavaria，德国)在流动氮气气氛下以20℃/min的升温速率进行。
动态光散射(DLS)测量：使用Malvern Zetasizer Nano ZS模型ZEN3600(英国伍斯特郡)配备标准633nm激光器在室温下进行。
水溶液中Mo的浓度：采用Leeman-Prodigy电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES，Hudson，NH)分析水溶液中Mo的浓度。
1.3MPTF的光热性能检测
1.3.1光热转换能力检测
利用激光装置(上海西龙光电技术有限公司)记录了MPTF在808nm激光近红外辐射下的温度变化，评价MPTF的光热转换能力。具体步骤如下：
将不同浓度(0-2.0mg/mL)的MPT水溶液0.3mL置于0.5mL Eppendorf管中，用808nm激光(1.0W/cm2)照射300s，使用热电偶探针(中国深圳市深圳市恒贝斯特机械工业有限公司)每隔15s跟踪溶液的温度。
此外，用同样的方法记录了MPTF(0.3ml，1.0mg/mL)在不同功率密度(0.3～1.0w/cm2)808nm激光作用下的温度变化。
1.3.2光热转换效率检测
对MPTF的光热转换效率(PCE)进行定量测量，将1.0mg/mL MPTF水溶液0.3mL置于0.5mL Eppendorf管中，用808nm激光(0.3W/cm2)照射，照射300s后关闭激光器，根据下公式计算PCE：
Figure GDA0003028273190000081
式Ⅰ中，h为传热系数，S为样品比色皿的表面积，Tmax为稳态温度，Tsur为周围环境温度，Qs为溶液光吸收率相关的热量，I为入射激光功率，Aλ为808nm波长下的吸光度。
1.3.3光热转换稳定性
测量MPTF(0.3ml，1.0mg/mL)水溶液经过5次808nm激光(0.3w/cm2)的辐照/冷却过程，以评价其光热转换稳定性。
1.4MoS2-PEG-FI和MPF-FI的合成
为了观察靶向细胞内化，合成了FITC偶联的PEG。具体步骤如下：
(1)将100mg LA-PEG-FA溶解于2ml二甲基亚砜中，
(2)将19mg FITC溶解于2ml二甲基亚砜中，与步骤(1)所得溶液混合，在黑暗中剧烈搅拌24小时。
(3)使用透析膜(MWCO＝1000)透析溶液并冷冻干燥获得LA-PEG-FA-FI。
(4)将50mg MoS2纳米片分散在5ml水中，250mg LA-PEG-FA-FI溶解于3ml水中，二者反应12h。
(5)用透析膜(MWCO＝8000-14000)透析，冷冻干燥得到MoS2-PEG-FA-FI(简称MPF-FI)。
此外，在相同的实验条件下制备了未经FA修饰的LA-PEG-FI和MoS2-PEG-FI作为对照样品。
1.5体外生物相容性和靶向特异性
1.5.1CCK8检测体外生物相容性
利用CCK8法检测不同浓度MoS2-PEG-FA(MPF)的生物相容性。具体步骤如下：
(1)实验前一天将SKoV3细胞以1.0×104个细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养基为新鲜培养基(DMEM为10％FBS和1％青霉素链霉素)。
(2)用含有0.1ml磷酸缓冲液(PBS)或MPF(10μL)的新鲜培养基代替每个孔中的培养基，最终浓度范围为(0.1-1.0mg/mL)。
(3)分别在37℃、5％CO2条件下培养24、48、72小时，用PBS洗涤3次。
(4)用100μL新鲜培养基将CCK8(10μL)加入每个孔中，再连续培养3h。
(5)用Multiscan MK3 ELISA(Thermo Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)记录每孔450nm处的吸光度。
1.5.2细胞形态检测体外生物相容性
利用卡尔蔡司LSM 700共焦激光扫描显微镜(CLSM，Jena，Germany)观察SKoV3细胞与MPF共培养后细胞骨架和细胞核的形态。具体步骤如下：
(1)将盖玻片置于12孔板中，用DMEM浸泡24小时。
(2)将SKoV3细胞以2.0×105个细胞/孔的密度接种到每个孔中，孵育过夜。
(3)孵育过夜的细胞用含有50μL PBS或不同浓度的MPF(0.1-1.0mg/Ml)的0.5mL新鲜培养基孵育48h。
(4)取出培养基，用PBS冲洗每个孔3次，然后用新鲜多聚甲醛(4.0％)在室温下固定30分钟。
(5)在含有0.1％tritonx-100的PBS中室温破膜10min，在含有1％BSA的PBS中阻断30min，在CLSM成像前用FITC-phalloidin染色30min，DAPI染色5min。每一步处理后，用PBS冲洗细胞3次。
(6)冲洗后的细胞用显微镜观察。
1.5.3细胞靶向性内吞作用
为了研究FA介导的细胞内化特异性靶向性，分别用不同浓度的MoS2-PEG和MPF对SKoV3细胞进行孵育。具体步骤如下：
(1)细胞以4×106个/孔的密度接种在25cm2的培养瓶中隔夜培养，培养基为新鲜培养基。
(2)用含有300μL PBS、不同浓度(0.1-1.0mg/mL)MoS2-PEG或MPF的3mL新鲜培养基代替原有培养基，再培养6h。
(3)用PBS洗涤细胞3次，胰蛋白酶提离，离心，然后在PBS中重新悬浮。
(4)用1ml王水溶液对细胞进行裂解，以消化细胞。
(5)每个样品用2mL水稀释，使用ICP-OES对钼浓度进行定量。
此外，使用CLSM成像技术对特定靶向摄取进行可视化。简而言之，上述方法培养的贴壁SKoV3细胞用含50μL MoS2-PEG-FI或50μL MPF-FI的新鲜培养基0.5mL培养6小时，然后，根据上述方案，对细胞进行DAPI染色和CLSM成像以观察细胞摄取。
1.6体外选择性抗癌活性与光热消融
1.6.1CCK8检测体外抗癌活性
采用CCK8法测定不同浓度和不同处理时间的α-TOS和MPTF的抗癌活性。具体步骤如下：
(1)将96孔培养板中贴壁的SKoV3细胞与0.1mL含10μL PBS或10μLα-TOS或10μLMPTF的新鲜培养基分别孵育24h和48h，最终TOS浓度范围为(10-100μM)。
(2)根据与1.5.1部分相同的方法进行CCK8试验以测量细胞活力。
为了验证α-TOS和MPTF对Lec1细胞(中国仓鼠卵巢细胞)的选择性抗癌活性，用CCK8法进一步评价了α-TOS和MPTF对Lec1细胞(中国仓鼠卵巢细胞)的毒性。用GraphPadPrism软件(GraphPad software Inc.，San Diego)计算不同组的半数最大抑制浓度(IC50)。
1.6.2细胞核染色检测体外细胞凋亡
采用CLSM成像进行细胞凋亡检测。具体包括以下步骤：
(1)将培养在12孔板中贴壁的SKoV3细胞于含有30μM TOS或50μL MPTF的0.5mL新鲜培养基孵育24小时或48小时。
(2)去除培养基，用PBS冲洗每个孔3次。
(3)戊二醛(2.5％)在4℃下固定15min。
(4)用PBS冲洗细胞3次，并在室温下用hoechst33342(1μg/mL)复染5min，然后进行CLSM成像。
1.6.3体外联合治疗效果评估
为了评估联合治疗效果，将上述96孔板中贴壁的SKoV3细胞与含有PBS、MPF或MPTF(体积均为10μL，浓度均为0.2mg/mL)的0.1mL DMEM孵育24小时或48小时，每组均设置激光辐照组与无激光辐照组两个对照，辐照组用808nm激光(0.3W/cm2)照射10分钟。根据上述方案，进行CCK8分析以确定细胞活性。
1.6.4流式细胞术检测体外治疗效果
用流式细胞仪分析不同处理后的细胞活力。简而言之，将培养在24孔板中贴壁的SKoV3细胞与0.5mL含有PBS、MPF或MPTF(体积均为50μL，浓度均为0.2mg/mL)的DMEM孵育48h，每组均设置激光辐照组与无激光辐照组两个对照，辐照组用808nm激光(0.3W/cm2)照射10分钟。随后，收集细胞并在缓冲液中重新悬浮，室温下分别用Annexin V-FITC和PI孵育5min，最后用Accuri C6流式细胞仪(美国新泽西州Becton Dickinson)检测。
1.6.5激光共聚焦观察体外细胞形态
用CLSM成像观察细胞骨架和细胞核的形态变化，以进一步评估体外治疗效果。将SKoV3细胞置于12孔板中培养贴壁，用0.5mL含PBS、MPF或MPTF(体积均为50μL，浓度均为0.2mg/mL)的新鲜培养基培养48h，每组均设置激光辐照组与无激光辐照组两个对照，辐照组用808nm激光(0.3W/cm2)照射10分钟，FITC-鬼笔环肽和DAPI染色后CLSM观察细胞形态及细胞骨架的变化。
1.7靶向肿瘤聚集及体内多模态CT/PA/热成像研究
动物实验按照动物护理机构委员会批准的方案和国家卫生部的政策进行。5周龄雌性裸鼠(22～25g)购自上海Slac实验动物中心(中国上海)。
裸鼠背部皮下注射5×106SKoV3细胞，注射3周后肿瘤结节体积为0.9～1.2cm3。然后，从裸鼠体内取出肿瘤结节，均匀地切成小块，移植到另一只新裸鼠体内。当裸鼠肿瘤体积达到0.5-0.8cm3时，将MPT和MPTF分散在0.2ml生理盐水(浓度为4mg/mL)中，经尾静脉注射。
使用临床LightSpeed VCT CT成像系统(GE Medical Systems，Milwaukee，WI)采集80kV、500mA、切片厚度为0.625mm的CT图像，使用VEVO LAZR-X光声成像系统(FujifilmVisualSonics，WA，USA)采集静脉注射后不同时间点(0-6小时)的光声(PA)图像，分别定量计算相应的CT/PA值。
热成像方面，用808nm激光(0.3w/cm2)照射肿瘤区300s，采集裸鼠红外热成像图，用红外摄像机记录肿瘤区相应的温度变化。
此外，静脉注射MPT和MPTF后，在肿瘤达峰时取裸鼠肿瘤组织，获得TEM图像，观察肿瘤内部纳米粒子的渗透情况。
1.8联合治疗与体内毒性评估
建立卵巢癌荷瘤裸鼠模型，肿瘤体积约0.12cm3，将裸鼠随机分为8组(每组n＝6)：生理盐水(NIR-)、生理盐水(NIR+)、MPF(NIR-)、MPF(NIR+)、MPT(NIR-)、MPT(NIR+)、MPTF(NIR-)和MPTF(NIR+)。
第0天和第2天，裸鼠尾静脉注射生理盐水、MPF、MPT或MPTF(体积均为0.2ml，浓度均为4mg/mL)，然后NIR+的4组在注射后1h用808nm激光(0.3w/cm2)辐照肿瘤，NIR-的4组不进行照射。在设定的时间点(第0,2,4,6,8,10,12,14,16，19,22,25，28,31，36,41,46天)，记录各组裸鼠的相对肿瘤体积、体重和存活率，并用数码相机拍摄裸鼠照片。用以下公式计算相对肿瘤体积(YT)和生存率(SR)。
YT＝V/Vini,V＝W2×L/2 式Ⅱ
ηSR＝Nsur/Ntot×100％ 式Ⅲ
其中V和Vini是治疗后的肿瘤体积和治疗前的初始肿瘤体积，W和L是肿瘤的宽度和长度，Nsur和Ntot分别是每组存活裸鼠数和总裸鼠数。
另外，各组裸鼠肿瘤组织经不同处理后于第2天取出，10％福尔马林固定，切片，TUNEL染色。最后用荧光显微镜(卡尔蔡司，Axio-Vert.A1,德国卡尔斯鲁厄)观察标本。对肿瘤细胞凋亡率进行定量分析,计算每个样本中TUNEL阳性细胞的百分比。91天后，取不同组裸鼠血浆，检测血尿素(BU，mmol/L)、天冬氨酸转氨酶(AST，U/L)、丙氨酸转氨酶(ALT，U/L)、肌酸激酶(CK，U/L)、肌酸激酶(CK-MB，U/L)、乳酸脱氢酶(LDH，U/L)等生化指标，检测主要脏器功能。
1.9组织学分析和生物分布
组织学分析：各组大鼠在治疗后的第46天取主要器官，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片苏木精伊红染色。
生物分布：MPTF经尾静脉注射(0.2ml，4mg/mL)。随后，将裸鼠麻醉并分别在注射后不同时间处死。取裸鼠主要脏器和肿瘤组织，称重，切碎，王水消化3天。用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)对样品中的钼含量进行定量分析。
2、实验结果
2.1 MPTF的合成与表征
靶向配体FA和抗癌药物α-TOS分别与聚乙二醇硫辛酸(LA)偶联后，根据核磁共振积分，计算出每个PEG链中的FA和α-TOS数目分别为0.83和0.95个(图1)。
通过透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)成像对MoS2纳米片和MPTF的显微照片和尺寸进行了微观观察(图2a、b)。与厚度约为25nm的MoS2纳米片相比，MPTF的形貌没有明显变化，而是紧密结合在一起，形成尺寸约为155nm的紧密堆积球形颗粒。经过功能化PEG链修饰后，MPTF的水动力尺寸明显减小到209.8nm(图3)，表明MPTF相对于MoS2纳米片具有更好的稳定性、水溶性和单分散性，与TEM和SEM成像结果一致。此外，通过热重分析(TGA)对MPTF中的功能性PEG链进行定量分析(图2c)。MoS2纳米片的失重率约为20.7％，而MPTF的失重率为32.8％，表明修饰到MoS2纳米片上的PEG功能链的比例为12.1％。此外，由于功能性PEG链修饰，MPTF的表面电位高于MoS2纳米片(图4)。上述结果表明，功能性PEG链修饰使MPTF更适合于生物医学应用。通过电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)检测MPTF内的最终Mo含量为538μg/mg。通过UV-vis光谱表征(图2d)，MoS2纳米片和MPTF在700-900nm的近红外区都有明显的吸收。此外，纳米平台的生物降解性是生物医药应用中避免体内长期毒性的一个极其重要的特征。TEM成像观察到MPTF在ph7.4的生理条件下的降解(图2e)，残留的小聚合物碎片可从肾脏代谢。
2.2光热性能
强的近红外吸收行为使MPTF在近红外辐射下具有光热性能。接下来，我们研究了不同浓度MPTF在808nm激光(1w/cm2)照射下的光热转换能力(图2f，g)。显然，在激光照射5分钟后，水的温度仅略有变化(低于4℃)。与此相比，MPTF溶液的温度随浓度的增加而显著升高，在浓度为2.0mg/mL时，其最高温度变化(ΔT)达到41.1℃。
根据ANSI的规定，808nm激光对正常皮肤的MPE为0.33w/cm2。因此，进一步研究了MPTF在808nm激光照射下(1.0～0.3w/cm2)的光热性能。虽然在低辐射功率下MPTF的升温效应较弱(图2h和图5)，但在0.3W/cm2的安全激光照射下，ΔT仍可以增加到16.9℃，这足以有效地消融癌细胞。
接下来，根据我们先前报告的方法(Li,X等，Formation of gold nanostar-coated hollow mesoporous silica for tumor multimodality imaging andphotothermal therapy.ACS Appl.Mater.Interfaces，2017和Hu,Y等，Shen,M.W.；Shi,X.Y.,Multifunctional Fe3O4@Au core/shell nanostars:A unique platform formultimode imaging and photothermal therapy of tumors.Sci.Rep，2016)测试MPTF的PCE。得到了MPTF溶液在激光照射下加热300s，随后激光关闭冷却至室温时的温度变化曲线(图2i)。之后，通过拟合冷却时间与–lnθ(图2j)来计算Δs，PCE结果为61.3％，明显高于其他光热增敏剂。例如，基于CuS(26.7％，Zhang,C.C等，Gd-/CuS-loaded functionalnanogels for MR/PA imaging-guided tumor-targeted photothermal therapy.ACSAppl.Mater.Interfaces，2020)、基于Bi(30.0％，Lei,P.P等，Ultrafast synthesis ofultrasmall poly(vinylpyrrolidone)-protected bismuth nanodots as amultifunctional theranostic agent for in vivo dual-modal CT/photothermal-imaging-guided photothermal therapy.Adv.Funct.Mater，2017)、基于PDA(40.0％，Liu,Y.L等，Dopamine-melanin colloidal nanospheres:An efficient near-infraredphotothermal therapeutic agent for in vivo cancer therapy.Adv.Mater，2013)、基于PPY(44.7％，Chen,M等，Polypyrrole nanoparticles for high-performance in vivonear-infrared photothermal cancer therapy.Chem.Commun.，2012)和基于碳纳米点(53.2％，Li,D等，Supra-(carbon nanodots)with a strong visible to near-infraredabsorption band and efficient photothermal conversion.Light:Sci.Appl，2016)的纳米平台。
此外，通过对808nm激光辐照的循环开启/关闭来评估MPTF的光热稳定性(图2k)。结果表明，MPTF在多次近红外辐照后仍具有良好的光热稳定性。良好的光热稳定性是MPTF获得较高PCE的重要前提。上述结果表明，MPTF可作为一种优良的光热剂用于肿瘤的光热治疗。
2.3生物相容性和靶向特异性
对于体内生物医学应用，需要评估MoS2-PEG-FA(简称MPF)的生物相容性。通过CCK8试验，在研究浓度范围(0.1-1.0mg/mL)下，MPF处理后的细胞活力与PBS处理后的细胞活力相比仅略有变化，并且在共培养24小时、48小时和72小时后，细胞活力仍保持在86.6％以上(图6a)。
经MPF处理48h后使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察细胞骨架和细胞核的完整性。显然，细胞骨架(绿色)和细胞核(蓝色)没有显示出明显的变化，结果与PBS处理后的细胞相似(图6b)。这些结果表明，MPF具有良好的生物相容性。
通过ICP-OES分析钼元素含量，定量检查MPF的特定细胞摄取量(图6c)。在不同浓度下，细胞对MPF中Mo的吸收量是MoS2-PEG的1.8-2.2倍。此外，为了观察纳米粒子的细胞内吞情况，使用FITC标记MoS2-PEG和MPF。CLSM成像(图6d，e)结果表明，与用MoS2-PEG-FI处理后的细胞相比，MPF-FI处理后的细胞具有更高的荧光强度。由此可见，FA介导的特异性靶向作用增强了SKoV3细胞的内吞作用。
2.4卵巢癌细胞的选择性抗癌活性与光热消融
首先，用CCK8法评价MPTF对SKoV3细胞的选择性化疗效果(图7a)。纯α-TOS和MPTF对SKoV3细胞具有浓度和时间依赖性的抗癌活性。值得注意的是，在相同浓度和共培养时间下，MPTF组细胞活力明显低于游离α-TOS组。此外，计算了α-TOS和MPTF在24小时和48小时对SKoV3细胞的半数最大抑制浓度(IC50)(图8)，并且IC50的顺序如下：α-TOS 24小时(42.3μM)>α-TOS 48小时(32.7μM)>MPTF 24h(17.5μM)>MPTF 48h(9.8μM)。这些结果表明，聚乙二醇化α-TOS及FA与MoS2纳米片的偶联，使其水溶性及靶向性明显提高，这可以大大提高其抗癌活性。
通过hoechst33342细胞核染色进一步揭示了MPTF抗癌活性的机制(图7d)。α-TOS和MPTF处理的细胞出现典型的深染细胞核凋亡形态学改变(点状蓝色荧光)，提示α-TOS能够通过阻滞细胞周期诱导细胞凋亡。同时，MPTF组显色较明显。另外，常用的抗癌药物不加选择地杀死癌症和正常细胞，而研究浓度的MPTF对正常卵巢细胞(Lec1)细胞没有明显毒性(图7b)，这是由于正常细胞具有高酯酶活性和室间隔完整性，并且缺乏膜联蛋白V结合。总的来说，MPTF的选择性化疗是避免全身给药副作用的一个非常重要的特性。
接下来，通过CCK8分析(图7c)，进一步探讨了MPTF对SKoV3细胞在安全近红外辐射(808nm，0.3w/cm2)下的联合光热消融和化疗效应。MPTF(NIR+)组(代表联合治疗)对癌细胞的抑制效果分别高于MPF(NIR+)组(代表单次光热消融)和MPTF(NIR-)组(代表单次化疗)。具体而言，共培养48h后，MPTF(NIR+)组细胞活力下降至5.7％，明显低于MPF(NIR+)(68.9％，p<0.001)和MPTF(NIR-)组(28.3％，p<0.001)。同样，不同治疗方法细胞的流式细胞术也显示，联合治疗可通过凋亡或坏死途径显著杀伤癌细胞，单一光热消融或化疗无法实现这一效果(图7e)。结果表明，与单纯光热消融或化疗相比，安全近红外辐射联合治疗的疗效显著提高。
此外，通过CLSM图像观察细胞骨架和细胞核(图7f)，说明了联合治疗的机制。显然，对照组的细胞骨架和细胞核完整。比较而言，MPF(NIR+)组的光热疗法可以通过破坏肌动蛋白应激纤维来消融癌细胞，而MPTF(NIR-)组的化疗即使在细胞骨架相对完整的情况下，也可通过使染色质凝聚从而抑制癌细胞的生长。MPTF在安全近红外照射下显示出联合治疗效果，抗癌效果增强。
2.5肿瘤靶向聚集与CT/PA/热成像的多模态成像
为了在体内应用，建立了SKoV3裸鼠皮下移植卵巢癌模型。纳米治疗平台的多模态成像能力对于准确诊断、肿瘤定位、治疗后和治疗结果监测至关重要。静脉注射MoS2-PEG-TOS(简称MPT)和MPTF后，在不同时间间隔获得CT/PA图像(图9a、b)和相应的信号强度(图9c、d)。肿瘤的CT/PA信号值随注射后时间的延长而增加，在1h达到峰值，提示MPT和MPTF的肿瘤积聚具有时间依赖性。更重要的是，在峰值1h时，MPTF组肿瘤的CT和PA信号值分别是MPT组的1.52倍和1.63倍。这些结果表明，MPTF通过特异性靶向作用增强了肿瘤的聚集，并且在注射后1h肿瘤区域达到最高浓度。此外，在达峰时，获得肿瘤组织取材并拍摄TEM图像(图9g)，MPTF显然比MPT在肿瘤处聚集更多。这一结果进一步说明FA修饰使MPTF在体内肿瘤部位特异性蓄积。
另外，在MPT和MPTF组，在注射后1h对肿瘤进行808nm激光照射(0.3w/cm2)，以获得红外热图像(图9e，f)。结果显示，MPTF组肿瘤温度迅速升高至51.2℃左右，远高于MPT组(45.3℃)。这是因为在体内，通过FA介导的靶向特异性，MPTF可以更有效地聚集在肿瘤区域。本领域公知的，癌细胞在45-50℃左右的温度下可以被不可逆地破坏。因此，在0.3w/cm2的安全近红外照射下，MPTF组肿瘤区域的高温足以杀死癌细胞。因此，MPTF可作为靶向多模态CT/PA/热成像的对比增强剂，有利于提高肿瘤的诊断敏感性和定位准确性。同样，靶向多模态成像能够帮助进行肿瘤的联合治疗。
2.6安全近红外辐射下肿瘤的有效治疗及复发机制
由于某些光热剂的肿瘤聚集性不足和/或PCE较低，在以往的一些工作中，常采用过大功率的近红外辐射(大于808nm激光的MPE，0.33w/cm2)来获得有效的肿瘤消融效果(表1)。在光热疗法的基础研究中，允许使用过大功率的近红外辐射，而在临床转化和实践中必须考虑近红外辐射的安全性。基于以上体外联合治疗和体内靶向多模态成像的研究结果，我们认为在安全照射(808nm，0.3w/cm2)下，MPTF可以实现良好的抗肿瘤效果，且副作用小。SKoV3荷瘤裸鼠的治疗时间表如图6a所示，MPTF(NIR+)组裸鼠的肿瘤在治疗后第6天被彻底消除，在46天甚至91天内没有观察到肿瘤复发(图10b，c)。相比之下，MPT(NIR+)组治疗后第19天肿瘤复发，提示增强肿瘤蓄积可提高肿瘤治疗效果。MPF(NIR+)组肿瘤复发发生在治疗后第28天，主要是由于单一的光热疗法不足以完全消融肿瘤细胞。MPTF(NIR-)组由于单一的化疗的局限性，肿瘤生长仅受到一定程度的抑制。
此外，对肿瘤切片进行TUNEL染色以评估联合治疗效果(图10e)。各组肿瘤细胞凋亡率定量分析如下(图11)：MPTF(NIR+)(87.5％)>MPF(NIR+)(66.9％)>MPT(NIR+)(53.8％)>MPTF(NIR-)(29.3％)>MPT(NIR-)(18.4％)>MPF(NIR-)(7.5％)≈生理盐水(NIR-)(8.7％)≈生理盐水(NIR+)(7.2％)。以上结果表明，与单纯光热疗法或单纯化疗相比，光热联合化疗在肿瘤治疗中具有很高的疗效，能够清除残留癌细胞，显著抑制肿瘤复发。
表1 808nm激光照射(皮肤MPE:0.33w/cm2)下的光热治疗效果比较。
Figure GDA0003028273190000171
Figure GDA0003028273190000181
表中引用参考文献如下所示：
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2.7全身毒性和生物分布
为了进一步检测纳米平台的毒性和长期副作用，在第46天摘取不同治疗组的裸鼠的主要器官(心、肝、脾、肺和肾)并进行H&E染色(图12)。不同治疗组的脏器均未见坏死区，与生理盐水组相似。更重要的是，为了进一步评估治疗纳米平台的临床转化潜力，我们检测了主要的血液生化参数，包括血浆尿素氮(BU)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)(图10d)。不同组裸鼠的这些参数无显著性差异。尽管如此，AST、ALT、CK和CK-MB指标在对照组(生理盐水(NIR-)、生理盐水(NIR+)、MPF(NIR-)组最高，而MPTF(NIR+)治疗组最低，提示对照组较大的肿瘤负荷导致裸鼠多器官功能衰竭，而MPTF(NIR+)组有效的治疗可保护内脏器官。这些结果表明，所设计的纳米治疗平台和光热联合选择性化疗策略具有良好的生物安全性。
此外，我们在91天内监测裸鼠存活率(图10f)。对照组裸鼠从第62天到第71天全部死亡。单次光热疗法、单次化疗或非靶向联合治疗组的生存率分别为：MPF(NIR+)(91天66.7％)，MPT(NIR+)(91天33.3％)，MPT(NIR-)组(84天0％)，MPT(NIR-)组(78天0％)。值得一提的是，MPTF(NIR+)组91天后存活率仍为100％。这些结果证实，在安全的近红外辐射下，MPTF不仅能达到良好的肿瘤清除，且无复发，副作用很小，可显著延长裸鼠的生存寿命。
最后，追踪了MPTF在裸鼠体内的代谢途径。静脉注射后，用ICP-OES测定钼元素在不同时间点在主要器官和肿瘤中的生物分布(图10g)。由于实体瘤组织的高通透性和滞留性效应(enhanced permeability and retention effect,EPR效应)和主动靶向作用，Mo元素在注射后1h在肿瘤组织中积累最多，并在48h前维持在较高水平。在肝脏和脾脏，Mo元素在注射后24小时逐渐积累，然后在24小时后被代谢，说明MPTF在体内可以被网状内皮系统器官清除。
3、结论
综上所述，本发明首次将聚乙二醇化α-TOS和FA修饰的2D-MoS2成功地用于多模态CT/PA/热成像引导下的卵巢癌光热治疗和选择性化疗。本发明所制备的MPTF具有良好的生物降解性、高PCE、良好的光热稳定性、良好的生物相容性、特异性靶向性、选择性抗癌活性和增强肿瘤聚集性，可用于靶向多模态成像和增强肿瘤治疗，副作用轻微，且能有效地防止肿瘤复发。对于虚弱的晚期卵巢癌患者，光热联合选择性化疗是替代临床手术和化疗的理想策略，可避免巨大的手术风险和全身化疗的严重副作用。本发明所设计的纳米平台将为新一代纳米医学在临床上的应用提供蓝图。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种二维二硫化钼纳米片，其特征在于，所述二维二硫化钼纳米片由聚乙二醇化的α-生育酚琥珀酸酯和聚乙二醇化的叶酸通过二硫键修饰；
所述二维二硫化钼纳米片的制备方法包括以下步骤：
（1）将50mg (NH4)2MoS4粉末溶于10ml水中搅拌30min，然后超声搅拌10min，使粉末完全溶解，之后在搅拌下添加0.227mL (N2H4)·H2O，然后进一步超声处理30min，将反应混合物转移至含50mL聚四氟乙烯的不锈钢高压灭菌器中，再将高压灭菌器置于200℃的烘箱中10h，冷却至室温后得到黑色溶液，然后在10000rpm下离心10min，用水冲洗5次，收集MoS2纳米片；
（2）用EDC化学方法将靶向配体FA和抗癌药物α-TOS分别与聚乙二醇硫辛酸LA偶联，根据核磁共振积分，计算出每个PEG链中的FA和α-TOS数目；
用EDC化学方法分别合成LA-PEG-FA和LA-PEG-TOS的步骤如下：溶解于3 mL DMSO中的44.1 mg FA或53.1 mg α-TOS在剧烈搅拌下被溶于2 mL DMSO中的96.0 mg EDC活化30min，然后再添加溶于2 mL DMSO中的57.5 mg NHS反应3 h，之后，将溶解于3 mL DMSO中的200 mg BocNH-PEG-NH2添加到上述溶液中反应3天，然后再添加200μL 3-4M HCl反应1-2h以去除-Boc基团，然后使用透析膜MWCO=1000将反应混合物与水透析3天后冻干，获得NH2-PEG-FA或NH2-PEG-TOS；分别用溶于2mL DMSO 中的96.0 mg EDC和溶于2mL DMSO中的57.5mg NHS活化溶于3mL DMSO中的20.6mg LA，之后将溶解于3 mL二甲基亚砜中的244 mgNH2-PEG-FA或253 mg NH2-PEG-TOS加入上述溶液中反应3天，用透析膜MWCO=1000透析反应混合物并冷冻干燥以得到最终产物LA-PEG-FA或LA-PEG-TOS；
（3）分散在5ml水中的50mg MoS2纳米片与3ml水中的250mg LA-PEG-FA和3ml水中的250mg LA-PEG-TOS反应12h，将LA-PEG-FA和LA-PEG-TOS的功能性PEG链通过二硫键修饰到MoS2纳米片上，用透析膜MWCO=8000-14000透析，冻干得到聚乙二醇、α-TOS和叶酸FA共轭的2D-MoS2纳米片MoS2-PEG-TOS-FA。
2.一种权利要求1所述的二维二硫化钼纳米片在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。
3.一种权利要求1所述的二维二硫化钼纳米片在制备选择性化疗治疗卵巢癌的药物中的应用。
4.一种权利要求1所述的二维二硫化钼纳米片在制备光热剂中的应用。
5.一种权利要求1所述的二维二硫化钼纳米片在制备用于靶向多模态成像的医疗用品中的应用。
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