CN112946282A - 一种用于检测伊马替尼和/或n-去甲基伊马替尼的检测试剂和检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本申请涉及免疫学检测技术领域,更具体而言,其涉及一种用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂和检测试剂盒。
背景技术
甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂,以KIT、血小板源性生长因子受体(PDGFRA)为靶点发挥抗瘤活性,主要用于治疗费城染色体(Bcr-Abl)阳性的慢性粒细胞白血病(简称CML)以及不能手术切除或发生转移的恶性胃肠间质肿瘤(GIST)患者。
伊马替尼在人体内主要经CYP3A酶系代谢为N-去甲基哌嗪衍生物(N-去甲基伊马替尼),该代谢产物体外药效与原药相似。因此需要能够同时测定伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的检测方法。近年来,研究表明甲磺酸伊马替尼稳态血药谷浓度(Cmin)与CML和GIST患者临床获益以及疾病进展密切相关;另外,伊马替尼血药浓度存在较大的个体间和个体内变异,提示血药浓度监测可以在判断伊马替尼疗效、评价治疗效果、规避副反应以及个体化用药方案调整等方面发挥重要作用。
但是,目前伊马替尼血药浓度监测国内临床实践中开展很少,与伊马替尼血药浓度检测方法繁琐、中国人群伊马替尼治疗窗尚未确定、人们缺乏血药浓度监测的意识等有关。伊马替尼的检测分析主要有HPLC-UV、LC-MS-MS、MESED-LC-MS-MS、电化学分析法等,但是这些方法都满足不了临床高通量、快速准确的检测需求。
如授权公告日为2016年03月30日、授权公告号CN102625702B的专利文献公开了一种伊马替尼免疫测定法,提出一种伊马替尼分子衍生物,采用该衍生物制备的抗体特异性识别伊马替尼,但是同N-去甲基伊马替尼没有交叉反应,制备的检测试剂可能会造成对伊马替尼血药浓度的低谷,造成伊马替尼毒性。
如授权公告日为2018年07月13日、授权公告号CN104804079B的专利文献公开了一种伊马替尼免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法。该专利文献没有具体明确是否识别N-去甲基伊马替尼,但是从特异性的描述看是不能识别的。
综上所述,目前缺乏高灵敏度且同时测定伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的免疫学检测方法。
发明内容
为了能够同时测定伊马替尼和N-去甲基伊马替尼,且专一强、灵敏度,本申请提供一种用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂和检测试剂盒。
第一方面,本申请提供一种用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂采用如下的技术方案:
一种用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂,包括包括酶标工作液、磁微粒工作液、指示剂溶液;
所述酶标工作液包括由伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原和标记物得到的偶联物;
所述磁微粒工作液包括由伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗体和磁微粒偶联得到的偶联物;所述指示剂溶液包含用于定量检测标记物浓度的指示剂;
所述伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原的结构如式10所示:
所述伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗体是响应于伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗原而生成的,所述伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗原是由伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原和载体蛋白经过偶联而形成的偶联物。
值得指出的是,“检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼”代表:若样品中含有伊马替尼、不含有N-去甲基伊马替尼,能够单独测定伊马替尼的浓度;若样品中不含有伊马替尼、含有N-去甲基伊马替尼,能够单独测定N-去甲基伊马替尼的浓度;若样品中同时含有伊马替尼和N-去甲基伊马替尼,可以同时测定伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的总浓度。
优选的,所述半抗原采用下述方法制备:
(i)式1所示化合物与原甲酸三甲酯经过醛基保护反应得式2所示化合物;
(ii)式2所示化合物和式3所示化合物经过缩合反应得式4所示化合物;
(iii)式4所示化合物和式5所示化合物经过还原胺化反应得式6所示化合物;
(iv)式6所示化合物经过脱保护反应得式7所示化合物;
(v)式7所示化合物与溴乙酸乙酯经过取代反应得式8所示化合物;
(vi)式8所示化合物与间氯过氧苯甲酸经过氧化反应得式9所示化合物;
(vii)式9所示化合物经过水解反应得式10所示化合物;
具体合成路线如下:
优选的,步骤(i)中所述式1所示化合物与原甲酸三甲酯的摩尔比为1:(2-3),所述醛基保护反应是以对甲苯磺酸为催化剂,且所述对甲苯磺酸和所述式1所示化合物的摩尔比为(0.3-0.5):1。
优选的,步骤(ii)中所述式2所示化合物和式3所示化合物的摩尔比为1:(1-1.1),所述缩合反应是以HATU为缩合剂、以三乙胺为缚酸剂,且所述HATU、三乙胺和式2所示化合物的摩尔比为(1-1.2):(2-2.4):1。
优选的,步骤(iii)中所述式4所示化合物和式5所示化合物的摩尔比为1:(1-1.2),所述还原胺化反应是以三乙酰基硼氢化钠为还原剂,且所述三乙酰基硼氢化钠和4所示化合物的摩尔比为(1-1.2):1。
优选的,步骤(iv)中所述脱保护反应是以三氟乙酸为脱保护剂,且所述三氟乙酸和式6所示化合物的摩尔比为(20-50):1。
优选的,步骤(v)中所述式7所示化合物和溴乙酸乙酯的摩尔比为1:(1-1.2)。
优选的,步骤(vi)中所述式8所示化合物和间氯过氧苯甲酸的摩尔比为1:(1-1.2)。
优选的,步骤(vii)中所述水解反应是以氢氧化钠作为水解剂,且氢氧化钠和式9所示化合物的摩尔比为(1.5-3):1。
优选的,所述半抗原和标记物是以自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐为偶联剂进行偶联的。
优选的,所述抗体和磁微粒是以自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐为偶联剂进行偶联的。
优选的,所述半抗原和载体蛋白是以自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐为偶联剂进行偶联而获得所述抗原。
优选的,所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白中的任意一种。
优选的,所述抗原采用下述方法制备:
(i)将伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原溶解于二甲基亚砜中得半抗原的二甲基亚砜溶液;(ii)将偶联剂溶解于水中得偶联剂的水溶液;
(iii)将半抗原的二甲基亚砜溶液和偶联剂水溶液和混合,室温反应0.5-2小时得反应液,其中所述伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原和偶联剂的重量比为1:(0.5-2);
(iv)将载体蛋白溶解于PBS缓冲液中,得载体蛋白溶液;
(v)将载体蛋白溶液和反应液混合,室温搅拌1-3小时得反应混合液,其中,所述伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原和载体蛋白的重量比为1:(0.5-2);
(vi)将反应混合液对PBS缓冲液透析得所述抗原,其中,反应混合液和PBS缓冲液的体积比为1:(400-600)。
为获得纯净的抗原,优选的是所述透析的次数为多次;进一步,为避免PBS缓冲液的使用量,最优选的是所述透析的次数为四次。
优选的,所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
优选的,所述抗体采用下述方法制备而得:
(i)选择用于抗体产生的宿主;
(ii)采用所述抗原接种至宿主;
(iii)将来自接种宿主的细胞系与Sp2/0细胞融合,产生所述抗体的杂交瘤细胞;
(iv)所述杂交瘤细胞采用宿主腹水制备,并纯化获得所述抗体。
优选的,所述宿主选自小鼠、兔、山羊、绵羊中的任意一种。
优选的,所述标记物为碱性磷酸酶,所述指示剂为用于定量测定碱性磷酸酶含量的发光底物。
第二方面,本申请提供的一种用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂的制备方法采用如下的技术方案:
一种用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂的制备方法,包括如下步骤:S1磁微粒工作液的获取:
S1-1:磁微粒稀释于MES缓冲液中得磁微粒溶液,向磁微粒溶液中加入权利要求6或7所述的抗体得磁微粒-抗体混合液,其中磁微粒和抗体的重量比为(25-100):1;
S1-2:将偶联剂加入磁微粒-抗体混合液中,室温震荡反应2h,其中,偶联剂和抗体的重量比为(1-3):1;
S1-3:磁吸去除上清液,加入TBST缓冲液,室温反应1-5h;
S1-4:磁吸去除上清液,加入TBST缓冲液得磁微粒工作液,且磁微粒在磁微粒工作液中的浓度为磁微粒工作液0.3-0.5mg/mL;
S2酶标工作液的获取:
S2-1:将标记物溶解于PBS缓冲液中得标记物溶液;
S2-2:向标记物溶液中加入权利要求1所述的半抗原并混合均匀,然后加入偶联剂,室温混匀1-5h;其中标记物、半抗原和偶联剂的重量比为(1.5-3):1:(1.5-3);
S2-3:采用PBS透析方法得酶标工作液,且标记物在酶标工作液中的浓度为0.5-2ug/mL;S3指示剂溶液的获取。
第三方便,本申请提供的一种用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂盒,采用如下的技术方案:
一种用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂盒,包括上述所述的检测试剂。
综上所述,本申请具有以下有益效果:本申请通过制备一种伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的人工抗原,获得能够同时识别伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗体,并且该抗体同Pyridine-N-oxide-imatinib和Hydroxymethyl-phenyl-imatinib没有交叉反应。因此,本申请能够同时测定伊马替尼和N-去甲基伊马替尼,且专一强、灵敏度、操作简单、省时省力。
附图说明
图1是本申请提供的抗体所建立的磁微粒发光法测定伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的总浓度与HPLC-MS法相关性分析。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原的制备实施例
伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原的结构如式10所示,且式10化合物的具体合成路线如下:
以羧基苯甲醛和原甲酸三甲酯为起始物,顺次经过醛基保护反应、缩合反应、还原胺化反应、取代反应、氧化反应、水解反应等七步反应获得目标产物伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原。
向500mL单口瓶中加入对羧基苯甲醛(15g,0.01mol)、150mL甲醇、一水对甲苯磺酸(0.75g,0.00394mol)、原甲酸三甲酯(3mL),体系室温反应24小时,TLC检测反应结束。体系蒸干后,加入200mL水,水相用二氯甲烷萃取三次,每次二氯甲烷的用量为50mL,合并有机相,无水硫酸钠干燥,过滤,蒸干得粗品,粗品经过柱层析纯化得到式2化合物(7.8g,收率40%)。
向250mL单口瓶中加入式2所示化合物(7.8g,4.00mmol),HATU(16.6g,4.40mmol),二氯甲烷150mL、三乙胺(8.10g,8.8mmol)、式3所示化合物(11.1g,4.00mmol),体系25℃反应12小时,TLC检测反应结束,旋干得粗品,粗品经过柱层析纯化得到式4化合物(13g,收率72%)。
向250mL单口瓶中加入式4所示化合物(4.55g,10mmol)、冰醋酸5mL、甲醇150mL,体系搅拌3小时后加入式5所示化合物(1.86g,10mmol)和三乙酰基硼氢化钠(2.11g,10mmol),体系室温反应16小时,TLC检测反应结束,体系过滤,蒸干滤液得粗品,粗品经过柱层析纯化得到式6所示化合物(1.27g,收率22%)。
步骤(iv):式6所示化合物经过脱保护反应得式7所示化合物:
向100mL单口瓶中加入式6所示化合物(1.16g,2mmol)、二氯甲烷30mL、三氟乙酸5mL,体系室温反应12小时,TLC检测反应结束,加水20mL,并采用碳酸氢钠溶液调节pH=8,分出有机相,干燥,过滤,蒸干得粗品,粗品经过柱层析得到式7所示化合物(800mg,收率84%)。
步骤(v):式7所示化合物与溴乙酸乙酯经过取代反应得式8所示化合物:
向100mL单口瓶中加入式7所示化合物(800mg,1.67mmol)、四氢呋喃20mL、无水碳酸钾(460mg,3.34mmol)、溴乙酸乙酯(280mg,1.67mmol),体系室温反应16小时,TLC检测反应结束,体系过滤,蒸干滤液得粗品,粗品经过柱层析纯化得到式8所示化合物(700mg,收率74%)。
向100mL单口瓶中加入式8所示化合物(566mg,1mmol)、二氯甲烷20mL、间氯过氧苯甲酸(172mg,1mmol),体系室温反应16小时,TLC检测反应结束,体系过滤,蒸干滤液得粗品,粗品经过柱层析纯化得到式9所示化合物(203mg,收率34%)。
步骤(vii):式9所示化合物经过水解反应得式10所示化合物:
向100mL单口瓶中加入式9所示化合物(200mg,3.44mmol)、氢氧化钠(28mg,6.88mmol)甲醇20mL、水1mL,体系室温反应2小时,TLC检测反应结束,蒸干体系;然后加入水50mL,采用乙酸乙酯萃取二次水相,每次乙酸乙酯的用量为30mL;之后水相用盐酸调节pH=3,水相采用乙酸乙酯萃取水相三次,每次乙酸乙酯的用量为30mL;合并有机相,干燥,过滤,蒸干得粗品,粗品经过柱层析纯化得到式10所示化合物(110mg,收率58%)。
伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原的表征:1H-NMR(400MHZ,DMSOd6):δ2.12-2.49(m,3H),2.80(m,4H),3.34(m,4H),3.66(m,2H),4.18(m,2H),7.20(d,1H),7.39-7.55(m,5H),7.57(d,1H),7.92(d,2H),8.45-8.50(m,1H),8.50(d,1H),8.68(dd,1H),8.89(s,1H),9.24(d,1H),10.32(d,1H),12.22(brs,1H);
13C-NMR(400MHZ,DMSOd6):δ17.6,50.6,50.6,55.0,55.0,59.0,64.4,103.3,107.9,111.5,124.0,124.6,127.2,127.2,128.9,128.9,130.0,133.0,132.7,133.7,134.0,142.0,142.2,147.5,147.9,157.6,157.9,164.7,168.2,168.6;
MS:m/Z 554(M+H)。
伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗原的制备实施例
伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗原是由伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原和载体蛋白通过偶联而形成的偶联物。
伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗原的具体制备方法包括如下步骤:
(i)将12mg的伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原溶解于1mL的二甲基亚砜中得半抗原的二甲基亚砜溶液;
(ii)将10mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐溶解于100uL的水中得偶联剂的水溶液;
(iii)将半抗原的二甲基亚砜溶液和偶联剂水溶液和混合,室温反应1小时得反应液;
(iv)将16mg的载体蛋白溶解于5mL的PBS缓冲液中,得载体蛋白溶液;
(v)将载体蛋白溶液和反应液混合,室温搅拌2小时得反应混合液;
(vi)将反应混合液对PBS缓冲液透析,且反应混合液和PBS缓冲液的体积比为1:500,透析步骤重复四次,得伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗原。
值得指出的是,伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗原的保存条件为低温冷冻保存,具体的是-20℃冷冻保存。
伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗体的制备实施例
伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗体是响应于伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗原而生成的。
伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的单克隆抗体的具体制备方法包括如下步骤:
(i)选择用于抗体产生的宿主:其中,宿主可以采用小鼠、兔、山羊、绵羊等,本制备实施例采用小鼠作为宿主;
(ii)伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗原接种至宿主:采用PBS缓冲液将伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗原稀释到1mg/mL,加入等体积的弗氏完全佐剂,乳化完全,小鼠按照0.1mg/只的剂量首次免疫;间隔四周后,将1mg的伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗原和1mg的弗式不完全佐剂混合并在搅拌速度为2000rpm/min的条件下搅拌2小时完成乳化,经过首次免疫的小鼠按照0.1mg/只的剂量进行加强免疫;
(iii)将来自接种宿主的脾细胞与Sp2/0细胞融合,采用伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的抗原包被ELISA 96孔板,对融合细胞采用间接ELISA法和间接竞争ELISA法分别进行效价及竞争测定,筛选得到3株细胞,分别为6A、11B1、21C1。
(iv)上述三株细胞分别采用小鼠腹水制备和Protein A/G亲和纯化获得抗体。
采用间接竞争ELISA法测定上述三种抗体分别与伊马替尼、N-去甲基伊马替尼、Pyridine-N-oxide-imatinib、Hydroxymethyl-phenyl-imatinib等四种小分子化合物的结合能力,结果见表1。
表1伊马替尼抗体特异性分析
6A | 11B1 | 21C1 | |
伊马替尼 | 100% | 100% | 100% |
N-去甲基伊马替尼 | 54% | 62% | 96% |
Pyridine-N-oxide-imatinib | <0.1% | <0.1% | <0.1% |
Hydroxymethyl-phenyl-imatinib | <0.1% | <0.1% | <0.1% |
由表1可知,21C1细胞产生的抗体表现出对伊马替尼和N-去甲基伊马替尼基本一致的亲和力,并且对无活性的Pyridine-N-oxide-imatinib和Hydroxymethyl-phenyl-imatinib交叉反应非常低。因此,21C1细胞产生的抗体适合于同时检测伊马替尼和N-去甲基伊马替尼血药浓度监测方法的建立。
这是可能由于本申请提供的半抗原结构的衍生位点远离伊马替尼的特征结构,因此本申请制备的抗体同Pyridine-N-oxide-imatinib和Hydroxymethyl-phenyl-imatinib这两种伊马替尼无活性代谢物没有交叉反应;并且,半抗原结构的衍生位点位于N-去甲基伊马替尼的甲基位且采用一个极短的连接臂同载体蛋白偶联,载体蛋白会对N-去甲基伊马替尼的甲基部分造成遮蔽,因此本申请制备的抗体可以同时识别伊马替尼和N-去甲基伊马替尼,这对于同时测定伊马替尼和N-去甲基伊马替尼这两种活性物质是非常有利。
综上所述,本申请所提供的抗原和抗体,具有能够同时识别伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的能力,同时具备优于相关技术的抗体特异性,即同Pyridine-N-oxide-imatinib和Hydroxymethyl-phenyl-imatinib没有交叉反应。
用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂的制备实施例用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂包括磁微粒工作液、酶标工作液和指示剂溶液。
S1磁微粒工作液的获取:
S1-1:将50mg的Dynal beads M270 COOH磁微粒稀释于2mL的MES缓冲液(50mM,pH=6.0)中得磁微粒溶液,并向磁微粒溶液中加入1mg的抗体得磁微粒-抗体混合液;
S1-2:向磁微粒-抗体混合液中加入2mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐,室温震荡反应2小时;
S1-3:磁吸去除上清液,并加入TBST缓冲液使磁微粒的浓度达到0.5mg/mL,室温反应2h;S1-4:磁吸去除上清液,加入TBST缓冲液得磁微粒工作液,且磁微粒在磁微粒工作液中的浓度为0.4mg/mL。
S2酶标工作液的获取:
S2-1:将1mg的碱性磷酸酶溶解于1mL的PBS缓冲液中得碱性磷酸酶溶液;
S2-2:将0.5mg的伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的半抗原溶解于0.1mL的二甲基亚砜中得半抗原溶液;
S2-3:将碱性磷酸酶溶液和半抗原溶液混合均匀,加入1mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐,室温混匀2h;
S2-4:采用PBS透析方法得酶标工作液,且标记物在酶标工作液中的浓度为1ug/mL。
S3指示剂溶液的获取:商品化的AMPPD发光液。
上述用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂可以现配现用,也可以将上述用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂在2-8℃条件下保存随用随取;更一步,将上述用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂制成检测试剂盒,且检测试剂盒需在2-8℃条件下保存。
免疫学检测样本中伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测实施例
用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的免疫学检测方法,具体操作步骤如下:
将20uL血液样本、40uL磁微粒液工作液和50uL酶标工作液混合均匀,并37℃孵育反应5min,清洗,加入指示剂溶液显色并采用光电倍增管采集400-550nm的光信号。清洗的具体步骤包括磁吸去除上清液,加入TBST缓冲液重悬,再次磁吸去除上清液。
选取临床50例服用伊马替尼的患者血液样本,采用本申请提供的一种用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的免疫学检测方法和HPLC法分别测定上述血液样本中伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的总浓度,并对测定结果进行相关性分析,分析结果见图1。
由图1可知,基于本发明制备的抗体建立的磁微粒发光法测定伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的总浓度与HPLC法相关性良好,符合临床需求。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释,其并不是对本申请的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
3.根据权利要求2所述的检测试剂,其特征在于,步骤(i)中所述式1所示化合物与原甲酸三甲酯的摩尔比为1:(2-3),所述醛基保护反应是以对甲苯磺酸为催化剂,且所述对甲苯磺酸和所述式1所示化合物的摩尔比为(0.3-0.5):1;
步骤(ii)中所述式2所示化合物和式3所示化合物的摩尔比为1:(1-1.1),所述缩合反应是以HATU为缩合剂、以三乙胺为缚酸剂,且所述HATU、三乙胺和式2所示化合物的摩尔比为(1-1.2):(2-2.4):1;
步骤(iii)中所述式4所示化合物和式5所示化合物的摩尔比为1:(1-1.2),所述还原胺化反应是以三乙酰基硼氢化钠为还原剂,且所述三乙酰基硼氢化钠和4所示化合物的摩尔比为(1-1.2):1;
步骤(iv)中所述脱保护反应是以三氟乙酸为脱保护剂,且所述三氟乙酸和式6所示化合物的摩尔比为(20-50):1;
步骤(v)中所述式7所示化合物和溴乙酸乙酯的摩尔比为1:(1-1.2);
步骤(vi)中所述式8所示化合物和间氯过氧苯甲酸的摩尔比为1:(1-1.2);
步骤(vii)中所述水解反应是以氢氧化钠作为水解剂,且氢氧化钠和式9所示化合物的摩尔比为(1.5-3):1。
4.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于,所述半抗原和标记物是以自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐为偶联剂进行偶联的;所述抗体和磁微粒是以自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐为偶联剂进行偶联的;所述半抗原和载体蛋白是以自1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐为偶联剂进行偶联而获得所述抗原。
5.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于,所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于,所述抗原采用下述方法制备:
(i)将伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原溶解于二甲基亚砜中得半抗原的二甲基亚砜溶液;
(ii)将偶联剂溶解于水中得偶联剂的水溶液;
(iii)将半抗原的二甲基亚砜溶液和偶联剂水溶液和混合,室温反应0.5-2小时得反应液,其中所述伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原和偶联剂的重量比为1:(0.5-2);
(iv)将载体蛋白溶解于PBS缓冲液中,得载体蛋白溶液;
(v)将载体蛋白溶液和反应液混合,室温搅拌1-3小时得反应混合液,其中,所述伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的半抗原和载体蛋白的重量比为1:(0.5-2);
(vi)将反应混合液对PBS缓冲液透析得所述抗原,其中,反应混合液和PBS缓冲液的体积比为1:(400-600)。
7.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于,所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
8.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于,所述标记物为碱性磷酸酶,所述指示剂为用于定量测定碱性磷酸酶含量的发光底物。
9.一种制备如权利要求1-8中任意一项所述的一种用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1磁微粒工作液的获取:
S1-1:磁微粒稀释于MES缓冲液中得磁微粒溶液,向磁微粒溶液中加入权利要求6或7所述的抗体得磁微粒-抗体混合液,其中磁微粒和抗体的重量比为(25-100):1;
S1-2:将偶联剂加入磁微粒-抗体混合液中,室温震荡反应2h,其中,偶联剂和抗体的重量比为(1-3):1;
S1-3:磁吸去除上清液,加入TBST缓冲液,室温反应1-5h;
S1-4:磁吸去除上清液,加入TBST缓冲液得磁微粒工作液,且磁微粒在磁微粒工作液中的浓度为磁微粒工作液0.3-0.5mg/mL;
S2酶标工作液的获取:
S2-1:将标记物溶解于PBS缓冲液中得标记物溶液;
S2-2:向标记物溶液中加入权利要求1所述的半抗原并混合均匀,然后加入偶联剂,室温混匀1-5h;其中标记物、半抗原和偶联剂的重量比为(1.5-3):1:(1.5-3);
S2-3:采用PBS透析方法得酶标工作液,且标记物在酶标工作液中的浓度为0.5-2ug/mL;
S3指示剂溶液的获取。
10.一种用于检测伊马替尼和/或N-去甲基伊马替尼的检测试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1-8中任意一项所述的检测试剂。
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