CN112945918A - 一种细胞超声神经调控系统 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种细胞超声神经调控系统，包括：细胞盛放装置，用于盛放标记后的细胞，所述细胞盛放装置包括底座，所述底座上形成透光口；超声波刺激装置，包括超声换能器，所述超声换能器用于向标记后的细胞发射超声波；细胞成像装置，包括激光光源、物镜和图像采集器，所述激光光源通过所述物镜、所述透光口向标记后的细胞发射激光，所述图像采集器通过所述物镜采集标记后的细胞的荧光图像。本申请提供的调控系统能够从微观角度观察到细胞的神经活动，并且可以对细胞进行瞬时及持续的实时动态成像监测。本申请为体外细胞成像的超声神经调控提供了一种新的策略，使其在未来超声介导的神经调控中得到更安全有效的应用。

Description

一种细胞超声神经调控系统
技术领域
本申请涉及医学或者实验中使用的器具领域，特别涉及一种细胞超声神经调控系统。
背景技术
神经调控技术是利用植入性或非植入性技术，采用电刺激或药物等手段改变中枢神经、外周神经或自主神经系统活性从而来改善患病人群的症状，提高生命质量的生物医学工程技术。
基于超声的力学效应的超声神经调控技术是近年来出现的无创性脑刺激与调控新技术，通过不同强度、频率、脉冲重复频率、脉冲宽度、持续时间的超声波使刺激部位的中枢神经产生刺激或抑制效应，对神经功能产生双向调节的可逆性变化。基于超声的无创神经调控技术，被认为是最具有临床转化前景的下一代神经调控技术之一，它具有无创、大穿透深度、高时空分布率等优点。其调控效果在神经元、线虫、小鼠、非人灵长类动物等多种尺度目标上得到了验证。它可以调控深部脑区，如丘脑等神经活动，从而成为可能治疗帕金森症、癫痫、抑郁症等脑疾病的治疗方法。
当前的超声神经调控装置通常不能提供细胞变化的及时的、完整的信息，尚缺乏对细胞进行瞬时及持续的实时动态成像监测。
发明内容
本申请提供了一种细胞超声神经调控系统，能够从微观角度观察到细胞的神经活动，并且可以对细胞进行瞬时及持续的实时动态成像监测。本申请通过将超声刺激装置搭建于细胞成像装置之上而形成一体化设计，能够精简实验步骤、提高实验效率。
为解决上述问题，本申请实施例提供的技术方案为：一种细胞超声神经调控系统，包括：细胞盛放装置，用于盛放标记后的细胞，所述细胞盛放装置包括底座，所述底座上形成透光口；超声波刺激装置，包括超声换能器，所述超声换能器用于向所述标记后的细胞发射超声波；细胞成像装置，包括激光光源、物镜和图像采集器，所述激光光源通过所述物镜、所述透光口向所述标记后的细胞发射激光，所述图像采集器通过所述物镜采集所述标记后的细胞的荧光图像。
根据本申请实施例提供的细胞超声神经调控系统，利用超声波来刺激标记后的细胞，并且进一步向该标记后的细胞发射激光，之后通过图像采集器通过采集标记后的细胞的荧光图像，进而能够从微观角度观察到细胞的神经活动，并且可以对细胞进行瞬时及持续的实时动态成像监测，为神经调控研究提供可靠的数据支撑。
本申请实施例提供的细胞超声神经调控系统利用超声波的机械效应来改变细胞膜的张力，超声辐射力作用于细胞磷脂双分子层，通过以超声刺激诱导机械敏感型离子通道打开，引起离子内流(即引起细胞内离子浓度可逆性增加)，在超声刺激的系统上搭建了直接观察细胞荧光成像系统，增强超声神经调控的安全性和有效性。
本申请为细胞成像的超声神经调控技术提供了一种新的研究策略，使其在未来超声介导的神经调控中得到更安全有效的应用。本申请实施例提供的细胞超声神经调控系统能够使超声相关研究中的观察更直观，更准确，有利于细胞实验的大量开展，进而能够促进超声神经调控技术的大力发展。
本申请通过将超声刺激装置搭建于细胞成像装置之上而形成一体化设计，能够通过一个设备直接观察到细胞的神经活动，能够精简实验步骤、提高实验效率，减轻科研人员的工作负担。
在一种可能的设计中，所述底座包括底壁和周壁，所述周壁呈两端开口的中空结构，一端固定于所述底壁上，所述底壁的内部开设有第一透光孔，所述标记后的细胞被设置于透明的细胞爬片上，所述细胞爬片被设置于所述中空结构内并封堵所述第一透光孔。
细胞爬片的面积应当大于第一透光孔，从而能够封闭该第一透光孔，防止细胞液通过第一透光孔滴落，图像采集器可以通过第一透光孔实时采集细胞爬片上的细胞的荧光图像，能够实时动态观察细胞状态。
在一种可能的设计中，所述细胞盛放装置还包括嵌合盖，所述嵌合盖用于盖合于所述周壁的另一端，所述嵌合盖上开设有第二透光孔。
通过将嵌合盖盖合于底座之上，能够将细胞设置于嵌合盖和底座所围成的空间内，进而能够防止细胞受到环境的污染。而在嵌合盖上开设第二透光孔，可以用于光线的通过，此时用户可以使用显微镜通过该第二透光孔通过肉眼观察细胞的荧光图像。
在一种可能的设计中，所述嵌合盖包括盖体和嵌合块，所述嵌合块设置于所述盖体的一侧，所述嵌合块与所述中空结构的截面相适配。通过设置嵌合块，可以将嵌合盖可靠的盖合于底座上，防止二者之间发生相对位移，避免对细胞实验造成不良影响。
在一种可能的设计中，所述细胞爬片和所述底壁之间设置有橡胶垫圈。橡胶垫圈具有一定的粘性和表面摩擦系数，通过设置橡胶垫圈，不仅能够防止细胞爬片和底壁之间产生相对位移，还能够提高细胞爬片和底壁之间的密封效果。
在一种可能的设计中，所述底座和所述嵌合盖由不锈钢材料构成。不锈钢材料具有较大的强度和硬度，并且耐磨耐腐蚀，还具有塑性变形能力强、密封性能佳、便于加工、运输和安装，制作周期短、不容易破碎、外形美观免维护等优点。此外，底座和嵌合盖由不锈钢材料构成，还能够增大超声波的传播速度和距离，有利于提高实验效率。
在一种可能的设计中，所述第一透光孔为圆孔，直径为2～5厘米，优选为2～3厘米。
在一种可能的设计中，所述细胞盛放装置被设置于所述细胞成像装置的载物台上，所述载物台包括两根间隔设置的支撑杆，所述物镜通过两根所述支撑杆间的间隙对准所述透光口。
在一种可能的设计中，所述超声换能器被固定设置于所述细胞盛放装置上，所述超声换能器以15～60度角照射所述标记后的细胞，优选为40～50度。
在一种可能的设计中，所述超声换能器被固定设置于所述细胞盛放装置(100)的外侧壁上。
在一种可能的设计中，所述细胞爬片由透明玻璃构成，厚度为0.1～0.3毫米，优选为0.1～0.18毫米。
在一种可能的设计中，所述超声波刺激装置包括依次连接的信号发生器、功率放大器以及所述超声换能器。
在一种可能的设计中，所述细胞成像装置还包括依次设置于所述激光光源和所述物镜之间的第一针孔、振镜以及分光镜，所述分光镜的反射光路上设有所述物镜，所述分光镜的透射光路上依次设有第二针孔、滤波器以及所述图像采集器。
在一种可能的设计中，所述图像采集器为PMT探测器或者CCD相机。
在一种可能的设计中，所述细胞为神经细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞或者原代细胞。
本申请还提供了上述方案所述的调控系统在在运动性障碍、疼痛、癫痫、帕金森病、抑郁症、药物成瘾、睡眠功能障碍、神经系统受损后的功能恢复以及精神疾病研究中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的细胞超声神经调控系统的整体结构示意图。
图2是本申请实施例提供的细胞盛放装置的整体结构示意图。
图3是本申请实施例提供的细胞盛放装置的分解图。
图4是本申请实施例提供的嵌合盖和底座的结构示意图。
图5是超声刺激N2A细胞的钙成像图。
图6为超声刺激的N2A细胞平均相对荧光强度随时间的变化曲线图。
图7为接受超声刺激和未接受超声刺激的N2A细胞的最大平均相对荧光强度曲线图。
图8是不同超声声压处理后的N2A细胞的钙荧光成像图。
图9是不同声压下N2A细胞的时间荧光强度曲线图。
图10是不同声压下Fluo-4M平均荧光强度的分析图。
图11为经抑制剂处理后的单个N2A细胞的相对荧光强度随时间改变的曲线图。
图12为经抑制剂处理后的N2A细胞和对照组N2A细胞的平均最大相对荧光强度的对比图。
附图标记：100、细胞盛放装置；110、底座；111、第一透光孔；112、底壁；113、周壁；120、嵌合盖；121、第二透光孔；122、盖体；123、嵌合块；130、细胞爬片；140、橡胶垫圈；
200、超声波刺激装置；210、信号发生器；220、功率放大器；230、超声换能器；
300、细胞成像装置；310、激光光源；320、第一针孔；330、振镜；340、分光镜；350、物镜；360、载物台；370、图像采集器；380、滤波器；390、第二针孔。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本申请实施例的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本申请中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
在本申请中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本申请的描述中，需要理解的是，术语“内”、“外”、“上”、“底”、“前”、“后”等指示的方位或者位置关系(若有的话)为基于附图1所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或者暗示所指的装置或者元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。
神经调控技术是利用植入性或非植入性技术，采用电刺激或药物手段改变中枢神经、外周神经或自主神经系统活性从而来改善患病人群的症状，提高生命质量的生物医学工程技术。
神经调控是近二十年来医学科学领域发展最为迅速的学科之一，为很多疾病的治疗带来了颠覆性的改变。神经调控的原理是利用光、磁、电、超声等物理性或化学性手段改变神经系统信号传递，调节神经元及其所在神经网络活动性，最终引起特定脑功能改变的生物医学工程技术。目前神经调控主要有电刺激手段和药物手段，也是目前临床上应用最广泛的技术。但是，这些方法都是有创的，需要植入特定的装置到体内，会对人体造成损伤。
具体地，对于电刺激手段，应用最普遍的神经调控技术包括脑深部电刺激术(DeepBrain Stimulation，DBS)、脊髓电刺激术(Spinal Cord Stimulation，SCS)、迷走神经刺激术(Vagus Nerve Stimulation，VNS)和骶神经调节术(Sacral Neuromodulation，SNM)等，这些技术都是通过植入性电刺激装置到人体的大脑、脊髓和外周神经，利用电信号对神经进行刺激，从而达到治疗的目的。
一方面，上述电刺激神经调控技术是有创的，需要在人体内植入电极，对人体造成一定的伤害。另一方面，上述电刺激神经调控技术无法直接观察到细胞神经活动行为。
对于药物手段，应用最普遍的神经调控技术是通过植入药物微量泵装置，采用神经系统内药物缓释技术，向神经系统注射药物以达到治疗目的，可以治疗癌性疼痛、帕金森病、阿尔茨海默病(AD)、难治性痉挛等疾病。
然而，上述药物植入也是有创的，会对人体造成一定的伤害，而且该方法只是通过长期缓慢的注射药物到神经组织中，从而起到治疗和缓解神经类疾病的目的，并没有能够从神经调控机理角度出发对神经疾病进行治疗。
结合前述分析，开发一种新的神经调控方法，达到无创且刺激效果好的神经调节目的变得愈发迫切。
基于超声的力学效应的超声神经调控技术是近年来出现的无创性脑刺激与调控新技术，通过不同强度、频率、脉冲重复频率、脉冲宽度、持续时间的超声波使刺激部位的中枢神经产生刺激或抑制效应，对神经功能产生双向调节的可逆性变化。基于超声的无创神经调控技术，被认为是最具有临床转化前景的下一代神经调控技术之一，它具有无创、大穿透深度、高时空分布率等优点。其调控效果在神经元、线虫、小鼠、非人灵长类动物等多种尺度目标上得到了验证。它可以调控深部脑区，如丘脑等神经活动，从而成为可能治疗帕金森症、癫痫、抑郁症等脑疾病的治疗方法。
中国专利申请CN112156381A公开了一种超声神经调控装置，通过调节平面超声换能器发射的平面声波的频率，即可调节超声聚焦深度，为超声神经调控刺激不同深度大脑核团提供了一种简单的方法。
中国专利申请CN109011228A公开了一种高空间分辨率超声神经调控方法及系统，通过使用较低的超声声强就可以只在微纳材料聚集区域产生超声神经调控效果，降低了超声神经调控的阈值，提高了传统超声神经调控的空间分辨率。
然而，上述两篇专利公开的超声神经调控装置均无法直接观察细胞的神经活动，不能精准控制超声调控的安全性和有效性。
中国专利申请CN109771855A，发明一种基于多模成像的超声调控神经组织的装置及方法，通过将CT/MRI多模成像导引、超声发射电路、超声探头和人机交互界面结合起来，可以在无创的前提下以较高分辨率，对不同深度的神经组织进行调控。
然而，通过CT/MRI进行多模成像导引仅能在宏观层面上引导组织定位，无法做到微观观察到细胞的神经活动行为。并且CT/MRI成像存在费用昂贵，预约周期长，无法长期以及实时成像监测等缺点。
综上所述，当前的超声神经调控装置通常采用超声或声动力治疗后的不同时间点的细胞进行检测来研究超声对细胞的作用机理，但是并不能提供细胞变化的及时的、完整的信息，尚缺乏对细胞进行瞬时及持续的实时动态成像监测。
为了能够实时观察超声刺激引起的细胞的改变，本申请实施例提供了一种细胞超声神经调控系统，该细胞超声神经调控系统是基于荧光显微镜搭建的超声刺激细胞的实时成像装置，能够从微观角度观察到细胞的神经活动，并且可以对细胞进行瞬时及持续的实时动态成像监测。
图1是本申请实施例提供的细胞超声神经调控系统的整体结构示意图。图2是本申请实施例提供的细胞盛放装置100的整体结构示意图。图3是本申请实施例提供的细胞盛放装置100的分解图。图4是本申请实施例提供的嵌合盖120和底座110的结构示意图。
如图1-4所示，该细胞超声神经调控系统包括：
细胞盛放装置100，用于盛放标记后的细胞，该细胞盛放装置100包括底座110，底座110上形成透光口。
超声波刺激装置200，包括超声换能器230，超声换能器230用于向标记后的细胞发射超声波。
细胞成像装置300，包括激光光源310、物镜350和图像采集器370，激光光源310通过物镜350、透光口向标记后的细胞发射激光，图像采集器370通过物镜350采集该标记后的细胞的荧光图像。
具体地，细胞盛放装置100用于盛放标记后的细胞，在这里，标记后的细胞也可以被称为染色后的细胞，例如可以是通过钙离子荧光探针、钾离子荧光探针、钠离子荧光探针或其他离子的荧光探针染色而成。
在超声波刺激装置200的超声换能器230发出的超声波的作用下，细胞成像装置300的激光光源310发射出的特定波长的激光照射该标记后的细胞，图像采集器370能够捕捉到细胞的荧光图像，进而能够从微观角度观察到细胞的神经活动，并且可以对细胞进行瞬时及持续的实时动态成像监测。
细胞盛放装置100包括底座110，被标记后的细胞被设置于该底座110上，该底座110上形成透光口，细胞成像装置300的物镜350正对该透光口，激光可以通过该投光口照射细胞，采集器370通过该透光口采集荧光图像。透光口能够供光线穿过，以射向内部的细胞。本申请对透光口的形成方式不做限定。
例如，整个底座110可以由玻璃、塑胶或者树脂等透明材料制成，此时整个底座110均构成该透光口。
再例如，仅有该透光口由透明材质构成，而底座的其他部分由不透明材质构成。
再例如，如图2-4所示，整个底座110由不透明材质构成，可以在底座110上开设第一透光孔111，该第一透光孔111为通孔，连通底座110的内外，进而构成该透光口。
超声波刺激装置200包括超声换能器230，超声换能器230用于向标记后的细胞发射超声波。超声换能器230可以为超声探头。例如可以为聚焦式超声探头。
可选地，超声换能器230可以是单阵元超声换能器、线阵超声换能器、面阵超声换能器、相控阵超声换能器和叉指换能器等中的任意一种。
可选地，超声换能器230的频率为1～3MHz，优选2～3MHz，发射的超声波声压为0.01～0.50MPa，优选0.03～0.17MPa，功率为40～60dB，优选50～60dB。
如图1所示，超声波刺激装置200包括依次连接的信号发生器210、功率放大器220以及该超声换能器230。
信号发生器210用于产生正弦波脉冲，功率放大器220用于将该正弦波脉冲放大，超声换能器230用于将放大后的正弦波脉冲转换为超声波，并且向细胞进行辐照。
可选地，超声波刺激装置200还可以包括电子控制装置，该电子控制装置可用于设置信号发生器210和功率放大器220的工作参数，以及超声换能器230的开启和关闭。
细胞成像装置300用于使标记后的细胞产生荧光以及采集荧光图像。例如，该细胞成像装置300可以是荧光显微镜或者激光共聚焦。
如图1所示，细胞成像装置300还包括依次设置于激光光源310和物镜350之间的第一针孔320、振镜330以及分光镜340，分光镜340的反射光路上设有所述物镜350，分光镜340的透射光路上依次设有第二针孔390、滤波器380以及所述图像采集器370。
其中，图像采集器370用于采集荧光图像，例如可以为电荷耦合器件(Charge-coupled Device，CCD)相机。在本申请实施例中，图像采集器370为光电倍增管(Photomultiplier Tube，PMT)探测器。
可选地，图像采集器370还可以与计算机电连接，可以将采集到的荧光图像发送给计算机进行二次处理和展示。
激光光源310用于发射光源。振镜330由X-Y光学扫描头、电子驱动放大器和光学反射镜片组成。物镜350用于将标本作第一次放大，它是决定显微镜性能的最重要的部件—分辨力的高低。分光镜340能够反射激光波长。滤波器380具有频率选择作用的电路或运算处理系统，具备滤除噪声和分离不同信号的功能。PMT探测器是常用的一种光电探测器，是一种利用光电效应将光信号转换成电信号的器件，是光电系统的重要组成部分。
第一针孔320和第二针孔390也可以分别被称为激发针孔和探测针孔。激发针孔和探测针孔共轭(共焦)，共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。激发光经激发针孔后成为点光源，然后通过分光镜340反射和物镜350聚焦点状照射在细胞上，细胞被激发产生的荧光经同一物镜，聚焦在探测针孔。探测针孔后面是PMT探测器，非焦平面的光就不能通过针孔被PMT探测器检测。
根据本申请实施例提供的细胞超声神经调控系统，利用超声波来刺激标记后的细胞，并且进一步向该标记后的细胞发射激光，通过图像采集器370通过采集标记后的细胞的荧光图像，进而能够从微观角度观察到细胞的神经活动，并且可以对细胞进行瞬时及持续的实时动态成像监测，为神经调控研究提供可靠的数据支撑。
本申请实施例提供的细胞超声神经调控系统利用超声波的机械效应来改变细胞膜的张力，超声辐射力作用于细胞磷脂双分子层，通过以超声刺激诱导机械敏感型离子通道打开，引起离子内流(即引起细胞内离子浓度可逆性增加)，在超声刺激的系统上搭建了直接观察细胞荧光成像系统，增强超声神经调控的安全性和有效性。
本申请为体外细胞成像的超声神经调控技术提供了一种新的研究策略，使其在未来超声介导的神经调控中得到更安全有效的应用。本申请实施例提供的细胞超声神经调控系统能够使超声相关研究中的观察更直观，更准确，有利于细胞实验的大量开展，进而能够促进超声神经调控技术的大力发展。
本申请通过将超声刺激装置搭建于细胞成像装置之上而形成一体化设计，能够通过一个设备直接观察到细胞的神经活动，能够精简实验步骤、提高实验效率，减轻科研人员的工作负担。
本申请实施例提供的细胞超声神经调控系统能够被应用在运动性障碍、疼痛、癫痫、帕金森病、抑郁症、药物成瘾、睡眠功能障碍、神经系统受损后的功能恢复、精神疾病或其他系统疾病的研究中。
可选地，这里的细胞(有时也被简称为细胞)可以是深脑区域的神经细胞或浅脑区域的神经细胞，但不局限于神经细胞，还可以是肿瘤细胞，免疫细胞等其他细胞。
可选地，这里的机械敏感型离子通道可以是piezo1通道，还可以是其他外源性/内源性机械敏感性离子通道，比如MscL离子通道等等。
如图2-4所示，底座110包括底壁112和周壁113，周壁113呈两端开口的中空结构，一端固定于底壁112上，底壁112的内部开设有第一透光孔111，该标记后的细胞被设置于透明的细胞爬片130上，细胞爬片130被设置于中空结构内并封堵第一透光孔111。
在这里，细胞爬片130的面积应当大于第一透光孔111，从而能够封闭该第一透光孔111，防止细胞液通过第一透光孔111滴落，图像采集器370可以通过第一透光孔111实时采集细胞爬片130上的细胞的荧光图像，能够实时动态观察细胞状态。
具体地，此时可以将细胞接种于细胞爬片130上，用离子荧光试剂染色。设置于细胞盛放装置100侧壁上的超声换能器230启动超声刺激，超声能量辐照到细胞爬片130上，细胞的机械敏感离子通道(如Piezo1通道，2010年由Coste等在小鼠神经瘤细胞N2A中发现的一种机械敏感离子通道)打开，引起离子(例如钙离子)内流浓度增加，进而能够使用细胞荧光成像系统(即细胞成像装置300)观察。
第一透光孔111的截面形状可以是圆形、矩形、梯形、平行四边形、跑道形等任意形状，本申请对此不做限定。
细胞爬片130的形状和第一透光孔111的截面形状可以相同，也可以不同。例如，细胞爬片130的形状也可以是圆形、矩形、梯形、平行四边形、跑道形等任意形状。
在本申请实施例中，第一透光孔111为圆孔，直径为2～5厘米，优选为2～3厘米。细胞爬片130也为圆形，并且直径大于第一透光孔111的直径。
本申请中的细胞爬片130的形状、大小、厚度以及材质等可以灵活设计，在本实施例中使用的圆形的薄玻璃，厚度为0.1～0.3毫米，优选为0.1～0.18毫米，便于细胞的成像观察，也可用其他可透明便于成像的材料，例如可以使用塑料或者树脂材料。
如图2-4所示，在本申请实施例中，底壁112的形状(也即周壁113的开口形状)为圆形，在其他实施方式中，底壁112的形状也可以为矩形、梯形、平行四边形、跑道形等其他任意形状。
如图2-4所示，在本申请实施例中，细胞盛放装置100还包括嵌合盖120，嵌合盖120用于盖合于周壁113的另一端，嵌合盖120上开设有第二透光孔121。
通过将嵌合盖120盖合于底座110之上，能够将细胞设置于嵌合盖120和底座110所围成的空间内，进而能够防止细胞受到环境的污染。而在嵌合盖120上开设第二透光孔121，可以用于光线的通过，此时用户可以使用显微镜通过该第二透光孔121通过肉眼观察细胞的荧光图像。
该第二透光孔121与第一透光孔111正对设置，二者的形状、大小可以相同，也可以不同。在本申请实施例中，第二透光孔121也为圆孔，并且和第一透光孔111大小相同。
在本申请实施例中，底座110和嵌合盖120由不锈钢材料构成。
不锈钢材料具有较大的强度和硬度，并且耐磨耐腐蚀，还具有塑性变形能力强、密封性能佳、便于加工、运输和安装，制作周期短、不容易破碎、外形美观免维护等优点。此外，底座和嵌合盖由不锈钢材料构成，还能够增大超声波的传播速度和距离，有利于提高实验效率。
可选地，底座110和嵌合盖120也可以由其他金属材料(例如铝合金或者铜合金)构成。
可选地，底座110和嵌合盖120也可以由塑胶、橡胶、树脂、玻璃等其他透明或者不透明的材质构成。
如图2-4所示，在本申请实施例中，嵌合盖120包括盖体122和嵌合块123，嵌合块123设置于盖体122的一侧，嵌合块123与中空结构的截面相适配。此时，第二透光孔121贯穿该盖体122和嵌合块123。
通过设置嵌合块123，可以将嵌合盖120可靠的盖合于底座110上，防止二者之间发生相对位移，避免对细胞实验造成不良影响。
如图2-4所示，在本申请实施例中，细胞爬片130和底壁112之间设置有橡胶垫圈140。
橡胶垫圈140具有一定的粘性和表面摩擦系数，通过设置橡胶垫圈140，不仅能够防止细胞爬片130和底壁112之间产生相对位移，还能够提高细胞爬片130和底壁112之间的密封效果。
可选地，橡胶垫圈140包括两个，一个位于细胞爬片130和底壁112之间，另一个位于细胞爬片130的内侧。此时，细胞爬片130被放置于两个橡胶垫圈140之间，能够更好的固定细胞爬片130。
如图1所示，细胞盛放装置100被设置于细胞成像装置300的载物台360上，载物台360包括两根间隔设置的支撑杆，物镜350通过两根支撑杆间的间隙对准透光口(即第一透光孔111)。
如图2所示，超声换能器230被固定设置于细胞盛放装置100上，超声换能器230以15～60度角照射所述后的细胞。
具体地，超声换能器230被固定设置于细胞盛放装置100的外侧壁上(例如嵌合盖120的外侧壁上)，并且超声换能器230声波的发射方向与竖直方向之间的夹角为15～60度，从而能够更好的对细胞进行辐照，优选为40～50度。例如，超声换能器230以45度角照射标记后的细胞。
可选地，在其他实施方式中，超声换能器230也可以被固定设置于细胞盛放装置100的其他位置，例如被设置于细胞盛放装置100的外侧壁上。
可选地，可以通过绑带绑定、胶带粘接、胶水粘接以及卡接等任意方式将超声换能器230固定设置于细胞盛放装置100之上。
发明人所在的研究团队已经利用本申请实施例供的细胞超声神经调控系统进行实验验证，通过该细胞超声神经调控系统进行小鼠神经瘤细胞(N2A细胞)实验，能够从微观的角度观察到N2A细胞的超声调控神经活动行为，并且可以对N2A细胞进行瞬时及持续的实时动态成像监测，为后续研究提供了可靠的数据支撑。
下面将结合本申请中的实施例，对本申请中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1：超声刺激细胞钙荧光成像
①小鼠神经瘤细胞(N2A细胞)培养及接种，在对数期用胰酶消化N2A细胞，细胞计数，调节细胞以(4～6)×l05个/ml密度接种于6孔板内(6孔板内已经放入细胞爬片)，在37度恒温培养箱中培养24～48h。
②Ca2+荧光探针Fluo 4-AM标记细胞：将适量的钙离子荧光指示剂Fluo-4AM加入含20％的Pluronic F-127，制备成0.5mmol/L的储备液，使用时需稀释到2.5～3uM的探针工作液。待N2A细胞长到75～85％时，弃培养基，用磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffer Saline，PBS)洗两遍。然后每张细胞爬片加探针工作液，室温避光染色15～30min。染色结束后，吸出染液，用PBS洗一遍，加入Hank's平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)后用于检测。之后将细胞爬片放到底座上。
③超声刺激：启动超声刺激系统，刺激细胞爬片上的神经细胞。
④细胞钙荧光成像：基于荧光显微镜的细胞钙荧光成像用来监测超声刺激N2A引起的胞浆钙离子含量的变化，直接在显微镜下观察Ca2+荧光探针的成像。
⑤实验结果：图5是超声刺激N2A细胞的钙成像图。其中，图5中的第一列(BF列)是超声刺激N2A细胞的明场图，第二列(Fluo-4列)是Fluo-4染色图、第三列(PI列)是PI染色图，第四列(Merge列)是Fluo-4染色和PI染色融合图。图5中的US(-)表示未进行超声刺激，US(+)表示进行超声刺激，US(+5min)表示超声刺激五分钟后。图6为超声刺激的N2A细胞平均相对荧光强度随时间的变化曲线图。其中，US表示接受超声刺激，Control表示未接受超声刺激。图7为接受超声刺激和未接受超声刺激的N2A细胞的最大平均相对荧光强度曲线图。
如图5-7所示，结果显示N2A细胞在即刻超声刺激后钙荧光显著增强，5min后荧光强度降低。在钙升高的细胞中，PI染色阳性细胞很少，说明超声照射没有导致细胞死亡，钙内流不是由细胞膜通透性增加引起的。相比之下，没有接受超声照射的N2A细胞没有明显的荧光变化。
实施例2：超声刺激的N2A细胞胞浆游离钙离子水平声压依赖性增加
①小鼠神经瘤细胞(N2A细胞)接种于细胞爬片，然后使用Ca2+荧光探针Fluo 4-AM标记细胞，具体方法同实施例1。
②超声刺激：启动超声刺激系统，设置不同超声声压，本实施例使用0.03、0.06、0.11和0.17Mpa，然后用细胞钙荧光成像观测钙离子浓度改变。
③实验结果：图8是不同超声声压处理后的N2A细胞的钙荧光成像图；图9是不同声压下N2A细胞的时间荧光强度曲线图。图10是不同声压下Fluo-4M平均荧光强度的分析图。
如图8-10所示，结果显示当声压为0.03MPa，N2A细胞最大平均相对荧光强度值是0.03±0.03，当声压为0.06MPa，N2A细胞最大平均相对荧光强度值是0.09±0.05，当声压为0.11MPa，N2A细胞最大平均相对荧光强度值是0.68±0.15(P＝0.001<0.05)，当声压为0.17MPa，N2A细胞最大平均相对荧光强度值是1.48±0.19(P＝1.1x10-5<0.05)。当声压为0.11MPa和0.17MPa时，细胞的最大平均相对荧光强度显著增加。细胞的最大平均相对荧光强度随着声压的增加而增加。
实施例3：细胞膜上的piezo1通道在超声刺激的N2A细胞钙水平升高中的作用
①小鼠神经瘤细胞(N2A细胞)接种于细胞爬片，然后使用Ca2+荧光探针Fluo4-AM标记细胞，具体方法同实施例1。
②piezo1抑制剂处理细胞：3uM的piezo1通道特异性的阻断剂GsMTx-4处理N2A细胞30min。
③超声刺激：启动超声刺激系统，设置超声频率为2MHz，声压为0.17MPa的脉冲超声刺激N2A细胞10s，然后用细胞钙荧光成像观测钙离子浓度改变。
④实验结果：图11为经抑制剂处理后的单个N2A细胞的相对荧光强度随时间改变的曲线图。图12为经抑制剂处理后的N2A细胞和对照组N2A细胞的平均最大相对荧光强度的对比图。
如图11、12所示，结果显示经GsMTx-4处理后的N2A细胞的平均最大相对荧光强度是1.08±0.07，对照组N2A细胞的平均最大相对荧光强度是1.36±0.06。结果表明piezo1通道特异性的阻断剂GsMTX-4降低了超声刺激的N2A细胞钙水平升高(p＝0.004<0.05)，表明piezo1通道也参与了超声刺激的N2A细胞钙水平升高。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (16)

1.一种细胞超声神经调控系统，其特征在于，包括：
细胞盛放装置(100)，用于盛放标记后的细胞，所述细胞盛放装置(100)包括底座(110)，所述底座(110)上形成透光口；
超声波刺激装置(200)，包括超声换能器(230)，所述超声换能器(230)用于向所述标记后的细胞发射超声波；
细胞成像装置(300)，包括激光光源(310)、物镜(350)和图像采集器(370)，所述激光光源(310)通过所述物镜(350)、所述透光口向所述标记后的细胞发射激光，所述图像采集器(370)通过所述物镜(350)采集所述标记后的细胞的荧光图像。
2.根据权利要求1所述的调控系统，其特征在于，所述底座(110)包括底壁(112)和周壁(113)，所述周壁(113)呈两端开口的中空结构，一端固定于所述底壁(112)上，所述底壁(112)的内部开设有第一透光孔(111)，所述标记后的细胞被设置于透明的细胞爬片(130)上，所述细胞爬片(130)被设置于所述中空结构内并封堵所述第一透光孔(111)。
3.根据权利要求2所述的调控系统，其特征在于，所述细胞盛放装置(100)还包括嵌合盖(120)，所述嵌合盖(120)用于盖合于所述周壁(113)的另一端，所述嵌合盖(120)上开设有第二透光孔(121)。
4.根据权利要求3所述的调控系统，其特征在于，所述嵌合盖(120)包括盖体(122)和嵌合块(123)，所述嵌合块(123)设置于所述盖体(122)的一侧，所述嵌合块(123)与所述中空结构的截面相适配。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的调控系统，其特征在于，所述细胞爬片(130)和所述底壁(112)之间设置有橡胶垫圈(140)。
6.根据权利要求3或4所述的调控系统，其特征在于，所述底座(110)和所述嵌合盖(120)由不锈钢材料构成。
7.根据权利要求2-4中任一项所述的调控系统，其特征在于，所述第一透光孔(111)为圆孔，直径为2～5厘米。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的调控系统，其特征在于，所述细胞盛放装置(100)被设置于所述细胞成像装置(300)的载物台(360)上，所述载物台(360)包括两根间隔设置的支撑杆，所述物镜(350)通过两根所述支撑杆间的间隙对准所述透光口。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的调控系统，其特征在于，所述超声换能器(230)被固定设置于所述细胞盛放装置(100)上，所述超声换能器(230)以15～60度角照射所述标记后的细胞。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的调控系统，其特征在于，所述超声换能器(230)被固定设置于所述细胞盛放装置(100)的外侧壁上。
11.根据权利要求2-4中任一项所述的调控系统，其特征在于，所述细胞爬片(130)由透明玻璃构成，厚度为0.1～0.3毫米。
12.根据权利要求2-4中任一项所述的调控系统，其特征在于，所述超声波刺激装置(200)包括依次连接的信号发生器(210)、功率放大器(220)以及所述超声换能器(230)。
13.根据权利要求1-4中任一项所述的调控系统，其特征在于，所述细胞成像装置(300)还包括依次设置于所述激光光源(310)和所述物镜(350)之间的第一针孔(320)、振镜(330)以及分光镜(340)，所述分光镜(340)的反射光路上设有所述物镜(350)，所述分光镜(340)的透射光路上依次设有第二针孔(390)、滤波器(380)以及所述图像采集器(370)。
14.根据权利要求1-4中任一项所述的调控系统，其特征在于，所述图像采集器(370)为PMT探测器或者CCD相机。
15.根据权利要求1-4中任一项所述的调控系统，其特征在于，所述细胞为神经细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞或者原代细胞。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的调控系统在运动性障碍、疼痛、癫痫、帕金森病、抑郁症、药物成瘾、睡眠功能障碍、神经系统受损后的功能恢复以及精神疾病研究中的应用。
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