CN112945835A - 基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法，针对由于激光扫描共聚焦显微镜成像过程中实际扫描步长与设定值不一致和图像质量下降导致构建细胞模型精确度不高的问题，使用光线追迹方法计算得到实际扫描步长，并以实际扫描步长逐层计算不同探测深度下探测平面的点扩散函数，将不同探测深度的点扩散函数分别对相应深度的细胞图层进行反卷积操作，以改善原始图像的质量，在图像平面方向提高了构建细胞的准确度，将反卷积后的图像以实际扫描步长进行空间拼接，在扫描步进方向提高了构建细胞的准确度。本发明方法能构建出更为精确的细胞三维形态模型，从而应用在生物医学研究领域中，具有非常重要的理论意义与实际应用价值。
Description
技术领域
本发明属于免标记细胞检测三维形态建模研究领域，涉及基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法。
背景技术
细胞光散射是一种重要的非干预式检测手段。光散射是由于电磁波与介质相互作用产生的，散射光携带了有关介质属性的大量信息。细胞的光学散射信息不仅蕴含同类细胞的共性特征，也包含了细胞的个体化特征，并且能在非干预状态下准确的反映生物细胞的物理特征，被誉为“细胞指纹”信息。
采用荧光标记、放射性同位素标记等方法对人体外周血细胞(循环肿瘤细胞、白细胞、红细胞等)检测，是临床诊断与生物学研究中广泛使用的检测方法。细胞免疫标记检测技术是一种基于生物化学手段的干预性间接检测技术，存在生物毒性乃至灭活性危害，且操作过程繁琐、靶向探针昂贵、环境污染严重等问题。细胞病变过程随着形态、结构、组份等物理特征的明显变化,故此被誉为“细胞指纹”的光学散射方法实现对细胞非接触、免标记、非干预式测量，无疑是一种更直接、更有效、更绿色的医疗诊断技术，对细胞癌变状态跟踪，细胞免疫治疗，临床精准医疗等领域具有重要的研究意义与潜在的临床应用价值。在免标记细胞光散射的研究中，获取完整的细胞内外部真实三维形态是获取其本征物理特性的基础和关键。除此之外，得到的精确三维细胞模型也可以应用在病变状态细胞的精确三维形态分析、病变状态细胞的反演规律研究以及不同细胞的形态学识别等研究领域。
然而，常用的根据激光扫描共聚焦图像构建细胞三维模型的方法，由于成像过程中光线经过了分层介质，产生了像差，图像质量下降，实际扫描步长与设定值不一致等问题，直接通过原始图像进行三维拼接构建的细胞模型不准确，即使采用现有的盲反卷积方法，也不能得到很好的效果，更无法获得有效的细胞物理匹配属性，如细胞散射与其结构的匹配属性。鉴于此，实有必要提供基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法，以解决以上技术问题。
发明内容
本发明提供了基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法，使用激光扫描共聚焦显微镜采集细胞的层析图像，通过光线追迹的方法分析成像过程中实际扫描步长与设定扫描步长的关系，计算得到实际扫描步长，根据Wolf的矢量理论，以实际扫描步长逐层计算不同探测深度下探测平面的点扩散函数，将不同探测深度的点扩散函数分别对相应深度的细胞图层进行反卷积操作，以此改善原始图像的质量，将反卷积后的图像以实际扫描步长进行空间拼接，能够恢复出更为精确的细胞三维形态模型，从而应用在更准确细胞光散射模型的建立、病变状态细胞的精确三维形态分析、病变状态细胞的反演规律研究以及不同细胞的形态学识别等研究领域。
基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法，具体包括以下步骤：
(1)使用激光扫描共聚焦显微镜采集细胞的层析图像；
(2)使用光线追迹的方法分析成像过程中实际扫描步长与设定扫描步长的关系，计算得到实际扫描步长；
(3)根据Wolf的矢量理论，以实际扫描步长逐层计算不同探测深度下探测平面的点扩散函数；
(4)将不同探测深度的点扩散函数分别对相应深度的细胞图层进行反卷积操作，以此来改善原始图像的质量；
(5)将反卷积后的图像以实际扫描步长进行空间拼接，从而构建出更为精确的细胞三维形态。
步骤(1)中，激光扫描共聚焦显微镜采集细胞的层析图像时，使用数值孔径为1.4的60倍浸油物镜，x、y方向像素距离为0.04-0.05微米，z方向扫描步长设定为0.1-0.2微米，能在构建精度与采集时间达到较好的平衡。
步骤(2)使用光线追迹的方法分析成像过程中实际扫描步长与设定扫描步长的关系，实际的扫描步长δ能够由以下公式计算得到：
其中δ0为设定扫描步长，n1为成像过程中物镜浸入介质的折射率，n2为样本浸入介质的折射率，θmax为透镜所能接收光线最大的立体角，由透镜的数值孔径NA与n2所决定：当NA<n2时，
当NA>n2时，
由此就可以准确计算出细胞图层间的实际间隔距离。
步骤(3)根据Wolf的矢量理论，以实际扫描步长逐层计算不同探测深度下探测平面的点扩散函数，得到一组随深度变化的用于校正原始细胞图像的点扩散函数。其中每一层所计算出的点扩散函数均为大小为201×201的矩阵，且计算间隔与采集的共聚焦图像像素间隔一致。
步骤(4)将不同探测深度的点扩散函数分别对相应深度的细胞图层进行Lucy-Richardson反卷积操作，能改善原始图像的质量，使物体的边界更清晰，能够提高构建细胞模型在图像平面方向的精确度。
步骤(5)以实际扫描步长对反卷积后的图像进行三维拼接，能够提高构建细胞模型在步进扫描方向上的精确度。
本发明与现有技术相比，主要进步如下：(1)通过对每层细胞原始图像使用计算得到的点扩散函数进行反卷积，改善了图像质量，清晰了图像物体的边缘，在图像平面方向提高了构建细胞的准确度；(2)以实际扫描步长对反卷积后的图像进行拼接，在扫描步进方向提高了构建细胞的准确度。
附图说明
图1为本发明的总体实施流程图。
图2为荧光小球的共聚焦结果。
图3为计算得到每一层的点扩散函数。
图4为点扩散函数反卷积荧光小球原始图像结果图。
图5为细胞的共聚焦构建结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细的说明：
参照图1所示，本发明提供了基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法，针对由共聚焦原始细胞层析图像以设定扫描步长直接进行三维拼接所得到的细胞三维模型准确度不高的问题，提出了由光线追迹的方法，分析成像过程中实际扫描步长与设定扫描步长的关系，计算得到实际扫描步长，以实际扫描步长逐层计算不同探测深度下探测平面的点扩散函数，将不同探测深度的点扩散函数分别对相应深度的细胞图层进行反卷积操作，以此改善原始图像的质量，将反卷积后的图像以实际扫描步长进行空间拼接，从而构建出更为精确的细胞三维形态模型。
参照图2所示，荧光小球共聚焦图像的获取：通过将荧光小球单层的图像与圆的图像进行对比，可以评估图像的质量，而将由荧光小球图像拼接构建出的三维结构与理想球体模型对比，则能够评估恢复模型，因此使用标准荧光聚苯乙烯小球进行实验。该荧光的激发波长为488纳米、发射波长为525纳米。纯水稀释后的荧光小球悬浊液被放置于共聚焦观察皿上，使用数值孔径为1.4的60倍浸油物镜进行LSCM观察和成像。沿着z方向步长为0.2微米扫描得到一叠像素间距离为0.04微米的512×512切片图像。(a)为采集的荧光小球共聚焦图像，(b)为在共聚焦显微镜自带的软件中构建的结果，(c)为直接将原始图像以设定扫描步长构建出的小球三维模型。
计算实际扫描步长：研究共聚焦成像的物理过程，采用光线追迹的方法，分析得到实际扫描步长与设定扫描步长的关系，由如下公式计算出实际的扫描步长δ：
其中δ0为设定扫描步长，n1为成像过程中物镜浸入介质的折射率，n2为样本浸入介质的折射率，θmax为透镜所能接收光线最大的立体角，一般由透镜的数值孔径NA所决定：
当数值孔径增大，特别是浸油物镜的数值孔径大于样本溶液介质的折射率时，会发生全内反射，此时θmax则为发生内发射的临界角，可以由斯涅尔折射定理确定：
参照图3所示，根据Wolf矢量理论，以实际扫描步长，以实际扫描步长逐层计算不同探测深度下探测平面的点扩散函数，得到一组96个用于校正原始细胞图像的点扩散函数。共聚焦成像系统的点扩散函数的计算步骤为先计算照明点扩散函数，再将照明点扩散函数用于计算系统的点扩散函数，照明点扩散函数根据如下公式：
系统的点扩散函数由照明点扩散函数的值由如下公式进行计算：
每一层所计算出的点扩散函数均为大小为201×201的矩阵，且计算间隔与采集的共聚焦图像像素间隔一致。
参照图4所示，将不同探测深度的点扩散函数分别对相应深度的细胞图层进行Lucy-Richardson反卷积操作，经过20次迭代，分析处理前后的图像质量。(a)中对比了各层原始图像、盲去卷积后的图像以及点扩散函数反卷积后图像的Tenengrad值，该值代表了图像的清晰度越大则说明图像越清晰，(b)左边从上到下分别第40层的原始图像、盲去卷积后的图像以及点扩散函数反卷积后图像，它们的Tenengrad值分别为0.21、0.34和0.89，右边为它们的局部细节放大图。
参照图4(c)所示，将反卷积后的图像以实际扫描步长进行空间拼接。上面分别是由原始图像、盲去卷积后的图像以及点扩散函数反卷积后图像以实际扫描步长构建出的小球三维模型，下面是将其面积与理想的二次曲线作对比的结果，(d)中显示了(c)图中的相对误差，三者的平均相对误差分别为18.88％、13.82％和9.75％。
参照图5所示，细胞的处理过程除了采集共聚焦图像与荧光小球的采集过程不一样外，该过程需要采用荧光染料CM-Dil标记细胞膜，荧光染料DAPI标记细胞核。将荧光标记后的淋巴细胞悬浊液样品放置在荧光共聚焦显微镜下以获得层析扫描图组，(a)为采集的细胞共聚焦图像，扫描步长为0.2微米，像素间距离为0.04微米，(b)为直接将原始图像以设定扫描步长构建出的细胞三维模型，(c)为经过本发明恢复后的细胞三维模型。
Claims (7)
1.基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法，其特征在于：使用激光扫描共聚焦显微镜采集细胞的层析图像，通过光线追迹的方法分析成像过程中实际扫描步长与设定扫描步长的关系，计算得到实际扫描步长，根据Wolf的矢量理论，以实际扫描步长逐层计算不同探测深度下探测平面的点扩散函数，将不同探测深度的点扩散函数分别对相应深度的细胞图层进行反卷积操作，以此改善原始图像的质量，将反卷积后的图像以实际扫描步长进行空间拼接，能够恢复出更为精确的细胞三维形态模型，从而应用在更准确细胞光散射模型的建立、病变状态细胞的精确三维形态分析、病变状态细胞的反演规律研究以及不同细胞的形态学识别等研究领域；
具体包括以下步骤：
(1)使用激光扫描共聚焦显微镜采集细胞的层析图像；
(2)使用光线追迹的方法分析成像过程中实际扫描步长与设定扫描步长的关系，计算得到实际扫描步长：
在激光扫描共聚焦显微镜的层析扫描过程中，细胞图层间的实际距离并不等于设定扫描步长，因此使用光线追迹的方法得到成像过程中实际扫描步长δ与设定扫描步长δ0的关系：
其中n1为成像过程中物镜浸入介质的折射率，n2为样本浸入介质的折射率，θmax为透镜所能接收光线最大的立体角，由透镜的数值孔径NA与n2所决定：当NA<n2时，
当NA>n2时，
由此公式就可以准确计算出细胞图层间的实际间隔距离；
(3)根据Wolf的矢量理论，以实际扫描步长逐层计算不同探测深度下探测平面的点扩散函数；
(4)将不同探测深度的点扩散函数分别对相应深度的细胞图层进行反卷积操作，以此来改善原始图像的质量；
(5)将反卷积后的图像以实际扫描步长进行空间拼接，从而构建出更为精确的细胞三维形态。
2.根据权利要求1所述的基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法，其特征在于：步骤(1)中，激光扫描共聚焦显微镜采集细胞的层析图像时，使用数值孔径为1.4的60倍浸油物镜，x、y方向像素距离为0.04-0.05微米，z方向扫描步长设定为0.1-0.2微米，能在构建精度与采集时间达到较好的平衡。
3.根据权利要求1所述的基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法，其特征在于：步骤(3)中，根据Wolf的矢量理论，以实际扫描步长逐层来分析不同探测深度下探测平面的点扩散函数，能够计算出一组随探测深度变化的用于校正原始细胞图像的点扩散函数。
4.根据权利要求1所述的基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法，其特征在于：步骤(3)中，计算出的每一层点扩散函数均为大小为201×201的矩阵。
5.根据权利要求1所述的基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法，其特征在于：步骤(3)中，每一层点扩散函数的计算间隔与采集的共聚焦图像像素间隔一致。
6.根据权利要求1所述的基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法，其特征在于：步骤(4)中，将不同探测深度的点扩散函数分别对相应深度的细胞图层进行Lucy-Richardson反卷积操作，能改善原始图像的质量，使物体的边界更清晰，能够提高所构建细胞模型在图像平面方向上的精确度。
7.根据权利要求1所述的基于深度变化点扩散函数的细胞精确三维形态恢复方法，其特征在于：步骤(5)中，以光线追迹方法计算得到的实际扫描步长对反卷积后的图像进行三维拼接，能够提高所构建细胞模型在步进扫描方向上的精确度。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115690567A (zh) * | 2022-10-25 | 2023-02-03 | 广州三海海洋工程勘察设计有限公司 | 机器学习水深反演方法、装置、计算机设备以及存储介质 |
| CN115690567B (zh) * | 2022-10-25 | 2023-09-26 | 广州三海海洋工程勘察设计有限公司 | 机器学习水深反演方法、装置、计算机设备以及存储介质 |
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