CN112940988A - 富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法及菌群及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法及菌群及应用。本发明利用乳酸和溴代阻燃剂从厌氧土壤或者沉积层中富集可降解卤代有机物的微生物菌群，并可通过乙酸作为碳源，氢气作为电子供体，经氨苄青霉素和溴代阻燃剂的筛选，富集更高丰度的微生物菌群，富集方法简单、能耗低且应用广，能够在厌氧环境中经济、高效的移除卤代有机污染物，在废水、废气和土壤治理等领域有巨大应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法及菌群及应用。
背景技术
溴代阻燃剂通常具有很强的疏水性，在扩散到环境中后极易吸附于土壤和沉积物，进入厌氧环境。通过卤代还原机制的微生物降解已经被证实可以在厌氧环境中高效、环保、经济的移除卤代有机污染物。然而目前有效地应用仅停留在卤代烷烃类物质，对于作为卤代芳香类物质的溴代阻燃剂，缺乏有效的微生物。主要是由于这类微生物生长周期长，仅可利用环境中低浓度(相对卤代烃类的低浓度，污染环境中的浓度仍然高于标准规范数倍)的溴代阻燃剂作为生长来源，在环境中属于极低丰度，难于富集。现有技术中，通过卤代还原机制的微生物降解技术还有待提高。
发明内容
本发明的目的是提供富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法及菌群及应用，该富集方法利用乙酸作为碳源，氢气作为电子供体，方法简单，富集培养后的目标微生物能够在厌氧环境中经济、高效的移除卤代有机污染物，在废水、废气和土壤治理等领域有巨大应用前景。
本发明提供一种富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，包括以下步骤：
采集厌氧环境下的土壤或者沉积物，加入基础培养基中，并加入乳酸和溴代阻燃剂，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群。
本发明还提供富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，包括以下步骤：
1)采集厌氧环境下的土壤或者沉积物，加入基础培养基中，并加入乳酸和溴代阻燃剂，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群；
2)在基础培养基中加入乙酸、氢气和溴代阻燃剂，并将步骤1)中获得的微生物菌群置于该培养基中培养，得到高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群。
本发明还提供富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，包括以下步骤：
1)采集厌氧环境下的土壤或者沉积物，加入基础培养基中，并加入乳酸和溴代阻燃剂，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群；
2)在基础培养基中加入乙酸、氢气、溴代阻燃剂和氨苄青霉素，并将步骤1)中获得的微生物菌群置于该培养基中培养，连续继代三次，得到高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群。
本发明还提供富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，包括以下步骤：
1)采集厌氧环境下的土壤或者沉积物，加入基础培养基中，并加入乳酸和溴代阻燃剂，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群；
2)在基础培养基中加入乙酸、氢气、三氯乙烯和氨苄青霉素，并将步骤1)中获得的微生物菌群置于该培养基中培养，连续继代三次，得到高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群。
作为优选，所述基础培养基包括矿物元素和微量元素，矿物元素为：1g NaCl、0.5gMgCl2*6H2O、0.2gKH2PO4、0.3gNH4Cl、0.3gKCl、0.015g CaCl2*2H2O、30mM NaHCO3，微量元素为：1.5mg FeCl2*4H2O、0.19mg CoCl2*6H2O、0.1mg MnCl2*4H2O、70μg ZnCl2、6μgH3BO3、36μgNa2MoO4*2H2O、24μg NiCl2*6H2O、2μg CuCl2*2H2O、6μg Na2SeO3*5H2O、8μg Na2WO4*2H2O，加入去离子水，定容至1000ml，厌氧处理，调节基础培养基pH值为7.2-7.4，121℃灭菌20min，所述溴代阻燃剂为五溴代联苯醚或者十溴二苯乙烷，所述土壤或者沉积物与基础培养基的质量体积比为1-10:50，所述乳酸、溴代阻燃剂在基础培养基中的终浓度为1-10mM乳酸和0.5-1.5μM溴代阻燃剂。
作为优选，步骤2)中所述乙酸、氢气和溴代阻燃剂在基础培养基中的终浓度为1-10mM乙酸、0.05-0.5atm氢气和0.5-1.5μM溴代阻燃剂。
作为优选，步骤2)中所述氨苄青霉素在该培养基中的终浓度为50-100mg/L。
作为优选，步骤2)中所述乙酸、氢气和三氯乙烯在该培养基中的终浓度为1-10mM乙酸、0.05-0.5atm氢气和0.1-0.5mM三氯乙烯。
本发明还提供如前述所述的富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法制得的可降解卤代有机物微生物菌群。
本发明还提供如前述所述的可降解卤代有机物微生物菌群在降解卤代有机污染物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明利用乳酸和溴代阻燃剂从厌氧土壤或者沉积层中富集可降解卤代有机物的微生物菌群，并可通过乙酸作为碳源，氢气作为电子供体，经氨苄青霉素和溴代阻燃剂的筛选，富集更高丰度的微生物菌群，富集方法简单、能耗低且应用广，能够在厌氧环境中经济、高效的移除卤代有机污染物，在废水、废气和土壤治理等领域有巨大应用前景。
附图说明
图1为实施例1中微生物菌群相对丰度和对五溴代联苯醚降解的影响图；
图2为实施例2中微生物菌群相对丰度和对五溴代联苯醚降解的影响图；
图3为实施例3中微生物菌群相对丰度和对五溴代联苯醚降解的影响图；
图4为实施例4中微生物菌群相对丰度和对三氯乙烯降解的影响图；
图5为实施例5中微生物菌群相对丰度和对五溴代联苯醚降解的影响图；
其中，BDE-99为五溴代联苯醚。
具体实施方式
为了理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明所使用的基础培养基包括矿物元素和微量元素，矿物元素为：1g NaCl、0.5gMgCl2*6H2O、0.2gKH2PO4、0.3gNH4Cl、0.3gKCl、0.015g CaCl2*2H2O、30mM NaHCO3，微量元素：1.5mg FeCl2*4H2O、0.19mg CoCl2*6H2O、0.1mg MnCl2*4H2O、70μg ZnCl2、6μgH3BO3、36μgNa2MoO4*2H2O、24μg NiCl2*6H2O、2μg CuCl2*2H2O、6μg Na2SeO3*5H2O、8μg Na2WO4*2H2O，加入去离子水，定容至1000ml，厌氧处理，调节基础培养基pH值为7.2-7.4，121℃灭菌20min。
定期检测五溴代联苯醚的降解活性，利用异辛烷对菌液中的五溴代联苯醚或者三氯乙烯进行萃取，两者体积比为1:1，震荡1h后取溶剂相，利用气象质谱仪进行定量检测。
目前已知的在厌氧环境中可降解卤代有机物的微生物菌属有Dehalococcoides和Dehalogenimonas，通过实时荧光定量PCR对这两种菌属在实施例1至实施例4中微生物菌群在多溴联苯醚降解过程中丰度的变化进行监测，其中菌属Dehalococcoides采用引物对为SQ1：GGTAATACGTAGGAAGCAAGCG和SQ2：CCGGTTAAGCCGGGAAATT，菌属Dehalogenimonas采用引物对为SQ3：GGYACAATGGGTTGCCACCGG和SQ4：AACGCGCTATGCTGACACGCGT。
微生物菌群中总细菌数定量检测：
实施例1至实施例4中微生物菌群中总菌数的定量检测所用的引物对为SQ5：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和SQ6：ATTACCGCGGCTGCTGG。
利用Dehalococcoides和Dehalogenimonas的细菌数除以总细菌数，得到可降解卤代有机物微生物菌群的相对丰度值。
实施例1
一种富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，包括以下步骤：
采集厌氧环境下的土壤20g，加入100mL基础培养基中，并加入终浓度为5mM乳酸和1.5μM五溴代联苯醚，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群，测试可降解卤代有机物的微生物菌群的丰度和对五溴代联苯醚的降解效果。
实施例2
一种富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，包括以下步骤：
1)采集厌氧环境下的土壤10g，加入100mL基础培养基中，并加入终浓度为5mM乳酸和1.5μM五溴代联苯醚，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群；
2)在基础培养基中加入5mM乙酸、0.1atm氢气和1.5μM五溴代联苯醚，并将步骤1)中获得的微生物菌群置于该培养基中培养，得到高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群，测试可降解卤代有机物的微生物菌群的丰度和对五溴代联苯醚的降解效果。
实施例3
一种富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，包括以下步骤：
1)采集厌氧环境下的沉积物5g，加入100mL基础培养基中，并加入终浓度为5mM乳酸和1.5μM五溴代联苯醚，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群；
2)在基础培养基中加入5mM乙酸、0.1atm氢气、1.5μM五溴代联苯醚和100mg/L氨苄青霉素，并将步骤1)中获得的微生物菌群置于该培养基中培养，连续继代三次，得到高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群，测试可降解卤代有机物的微生物菌群的丰度和对五溴代联苯醚的降解效果。
实施例4
一种富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，包括以下步骤：
1)采集厌氧环境下的土壤18g，加入100mL基础培养基中，并加入终浓度为5mM乳酸和1.5μM五溴代联苯醚，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群；
2)在基础培养基中加入5mM乙酸、0.1atm氢气、0.5μM三氯乙烯和100mg/L氨苄青霉素，并将步骤1)中获得的微生物菌群置于该培养基中培养，连续继代三次，得到高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群，测试可降解卤代有机物的微生物菌群的丰度和对五溴代联苯醚的降解效果。
实施例5
将实施例4制得的高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群加入基础培养基中，并加入5mM乙酸、0.1atm氢气和1.5μM五溴代联苯醚，连续继代三次，测试可降解卤代有机物的微生物菌群的丰度和对五溴代联苯醚的降解效果。
实施例6
一种富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，包括以下步骤：
采集厌氧环境下的土壤18g，加入100mL基础培养基中，并加入终浓度为1mM乳酸和1.5μM五溴代联苯醚，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群。
实施例7
一种富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，包括以下步骤：
1)采集厌氧环境下的土壤20g，加入100mL基础培养基中，并加入终浓度为10mM乳酸和0.5μM五溴代联苯醚，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群；
2)在基础培养基中加入10mM乙酸、0.3atm氢气和0.1μM五溴代联苯醚，并将步骤1)中获得的微生物菌群置于该培养基中培养，得到高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群。
实施例8
一种富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，包括以下步骤：
1)采集厌氧环境下的沉积物15g，加入100mL基础培养基中，并加入终浓度为6mM乳酸和0.8μM五溴代联苯醚，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群；
2)在基础培养基中加入3mM乙酸、0.5atm氢气、1.2μM五溴代联苯醚和100mg/L氨苄青霉素，并将步骤1)中获得的微生物菌群置于该培养基中培养，连续继代三次，得到高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群。
实施例9
一种富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，包括以下步骤：
1)采集厌氧环境下的土壤2g，加入100mL基础培养基中，并加入终浓度为5mM乳酸和1.5μM五溴代联苯醚，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群；
2)在基础培养基中加入5mM乙酸、0.3atm氢气、0.1μM三氯乙烯和100mg/L氨苄青霉素，并将步骤1)中获得的微生物菌群置于该培养基中培养，连续继代三次，得到高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群。
目标微生物只能利用乙酸作为碳源，氢气作为电子供体，卤代有机物作为电子受体，三氯乙烯和溴代阻燃剂均可作为电子受体，且目标微生物对抗生素具有一定的抗性。
在基础培养基中加入乳酸和溴代阻燃剂，一部分非目标微生物因为不能够利用乳酸或者因为低浓度的碳源，生长受限，目标微生物得以富集，培养完成后进行富集测试。
由图1和图2实施例1和实施例2中微生物菌群相对丰度和对五溴代联苯醚降解的影响图，由图1和图2分析可知，溴代阻燃剂的降解周期由3个月缩短为2个月，同时可降解卤代有机物微生物菌群的丰度由0.4％增加为2.2％。
图3是实施例3中微生物菌群相对丰度和对五溴代联苯醚降解的影响图，在连续三代氨苄青霉素培养后，降解周期由2个月缩短为3周，同时可降解卤代有机物微生物菌群的丰度由2.2％增加为15％。
图4是实施例4中微生物菌群相对丰度和对三氯乙烯降解的影响图，利用三氯乙烯连续三代培养后，微生物菌群对三氯乙烯的降解。
图5是实施例5中微生物菌群相对丰度和对五溴代联苯醚降解的影响图，由图5看出利用三氯乙烯连续三代培养后，菌群仍旧保留对溴代阻燃剂的降解特性，目标微生物的丰度由1E6增加至1E8水平，在菌群中的相对丰度由15％提升至70％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何的简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，其特征在于，包括以下步骤：
采集厌氧环境下的土壤或者沉积物，加入基础培养基中，并加入乳酸和溴代阻燃剂，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群。
2.富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采集厌氧环境下的土壤或者沉积物，加入基础培养基中，并加入乳酸和溴代阻燃剂，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群；
2)在基础培养基中加入乙酸、氢气和溴代阻燃剂，并将步骤1)中获得的微生物菌群置于该培养基中培养，得到高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群。
3.富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采集厌氧环境下的土壤或者沉积物，加入基础培养基中，并加入乳酸和溴代阻燃剂，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群；
2)在基础培养基中加入乙酸、氢气、溴代阻燃剂和氨苄青霉素，并将步骤1)中获得的微生物菌群置于该培养基中培养，连续继代三次，得到高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群。
4.富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采集厌氧环境下的土壤或者沉积物，加入基础培养基中，并加入乳酸和溴代阻燃剂，厌氧环境下进行3次继代培养，得到可降解卤代有机物微生物菌群；
2)在基础培养基中加入乙酸、氢气、三氯乙烯和氨苄青霉素，并将步骤1)中获得的微生物菌群置于该培养基中培养，连续继代三次，得到高丰度的可降解卤代有机物的微生物菌群。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，其特征在于，所述基础培养基包括矿物元素和微量元素，矿物元素为：1gNaCl、0.5gMgCl2*6H2O、0.2gKH2PO4、0.3gNH4Cl、0.3gKCl、0.015g CaCl2*2H2O、30mM NaHCO3，微量元素为：1.5mg FeCl2*4H2O、0.19mg CoCl2*6H2O、0.1mg MnCl2*4H2O、70μg ZnCl2、6μgH3BO3、36μgNa2MoO4*2H2O、24μg NiCl2*6H2O、2μgCuCl2*2H2O、6μg Na2SeO3*5H2O、8μg Na2WO4*2H2O，加入去离子水，定容至1000ml，厌氧处理，调节基础培养基pH值为7.2-7.4，121℃灭菌20min，所述溴代阻燃剂为五溴代联苯醚，所述土壤或者沉积物与基础培养基的质量体积比例为1-10:50，所述乳酸、溴代阻燃剂在基础培养基中的终浓度为1-10mM乳酸和0.5-1.5μM溴代阻燃剂。
6.根据权利要求2-3中所述的富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，其特征在于，步骤2)中所述乙酸、氢气和溴代阻燃剂在基础培养基中的终浓度为1-10mM乙酸、0.05-0.5atm氢气和0.5-1.5μM溴代阻燃剂。
7.根据权利要求3和4中所述的富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，其特征在于，步骤2)中所述氨苄青霉素在该培养基中的终浓度为50-100mg/L。
8.根据权利要求4所述的富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法，其特征在于，步骤2)中所述乙酸、氢气和三氯乙烯在该培养基中的终浓度为1-10mM乙酸、0.05-0.5atm氢气和0.1-0.5mM三氯乙烯。
9.如权利要求1-4中任意一项所述的富集可降解卤代有机物微生物菌群的方法制得的可降解卤代有机物微生物菌群。
10.根据权利要求9所述的可降解卤代有机物微生物菌群在降解卤代有机污染物中的应用。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN107267435A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-10-20 | 中国科学院南京土壤研究所 | 一种溴代烃厌氧降解菌剂的制备方法及应用 |
| CN112501044A (zh) * | 2019-12-16 | 2021-03-16 | 新加坡国立大学 | 一株降解多溴联苯醚的菌株及其在污染土壤或地下水修复中的应用 |
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Patent Citations (2)
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| Title |
|---|
| 熊举坤: "酚类溴代阻燃剂的污染特征、生物强化降解及其相关微生物群落变化研究", 《中国博士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》 * |
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