CN112924675B

CN112924675B - 尿液胰腺甘油三酯脂肪酶蛋白及其多肽片段在正常妊娠中的应用

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Publication number: CN112924675B
Application number: CN201911234165.4A
Authority: CN
Inventors: 张曼; 胡智颖
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2023-01-13
Anticipated expiration: 2039-12-05
Also published as: CN112924675A

Abstract

本发明提供一种尿液胰腺甘油三酯脂肪酶（pancreatic triacylglycerol lipase，PTL）蛋白及其多肽片段的应用，具体为尿液PTL蛋白及其多肽片段在制备用于监测正常妊娠制剂中的应用。本发明通过研究证实，与正常育龄妇女组（正常对照）相比，PTL蛋白及其多肽片段在正常妊娠组表达升高，可用于妊娠状态的监测。本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液PTL蛋白及其多肽片段。

Description

尿液胰腺甘油三酯脂肪酶蛋白及其多肽片段在正常妊娠中的应用

技术领域

本发明涉及尿液胰腺甘油三酯脂肪酶(PTL)蛋白及其多肽片段的新用途，具体涉及尿液PTL蛋白及其多肽片段在监测正常妊娠中的应用。

背景技术

妊娠过程中，为适应胎儿生长发育需要，孕妇的生殖、血液循环、泌尿、呼吸、消化及内分泌等系统会发生一系列变化，尤其是内分泌系统，促性腺激素分泌减少，催乳素、促甲状腺激素和促肾上腺皮质激素、糖皮质醇、醛固酮、甲状腺激素等分泌增加。妊娠中晚期，部分孕妇对胰岛素的敏感性下降，对胰岛素产生分解、拮抗作用，使胰岛素活性降低，孕妇不能正常代偿这种生理变化而出现妊娠期糖尿病（Gestational Diabetes Mellitus,GDM）。如果血糖水平控制不佳，妊娠期糖尿病妇女在妊娠期高血压疾病、流产、剖宫产、早产、新生儿低血糖、新生儿高胆红素血症等不良妊娠结局发生率明显高于正常孕产妇。对于确诊的妊娠期糖尿病患者，后期血糖控制标准和控制要求会更加严格，监测更加频繁。为提高妊娠期患者的生活质量和医从性，减轻妊娠期血糖检测多次采血的痛苦，针对不同孕期制定更为精细化、个性化的监测指标，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测或监测体内糖水平及糖代谢情况，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。

作为胰腺外分泌蛋白，胰甘油三酯脂肪酶对于有效消化膳食脂肪是必不可少的。胰甘油三酯脂肪酶除了在脂肪消化中的重要性外，在医学治疗、医学诊断和工业中也有潜在的应用。胰腺脂肪酶的发育不仅与年龄相关，还受到膳食结构、内分泌激素等的调节，其表达的改变与肥胖等代谢性疾病有着密切的关系。胰腺脂肪酶的调节可能是治疗肥胖等代谢性疾病的靶点。在成人胰液中PLT占总蛋白的7.7%是断奶后和成年期甘油三脂消化的主要酶类，PLT有高效水解脂肪的作用，高脂饮食增加增加PLT的表达和酶活性。也有研究显示PTL也可能参与视黄醇酯的水解，促进视黄醇的利用和吸收。

妊娠期妇女不仅膳食结构更加合理、随着孕龄的增加，摄入的膳食脂肪不断增加，因此胰腺分泌的胰甘油三酯脂肪酶增加，本实验通过可尿液中可检测到胰甘油三酯脂肪酶的变化。

与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；没有稳态调节，可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后，会很快被排泄进入尿液，这些蛋白和多肽在尿液中被检测到的概率比在血中大很多；尿液收集之前，尿中可能的蛋白降解过程已经完成，所以尿蛋白可在较长时间内保持稳定。为减轻妊娠妇女血糖检测多次采血的痛苦，本实验在前期方法学摸索的基础上，希望通过尿液蛋白或多肽的检测能够实现对妊娠状态的监测和了解。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尿液胰腺甘油三酯脂肪酶(PTL)蛋白及其多肽片段在制备用于监测正常妊娠制剂中的应用。

优选地，所述尿液PTL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示（MLPLWTLSLL LGAVAGKEVCYERLGCFSDD SPWSGITERP LHILPWSPKD VNTRFLLYTN ENPNNFQEVA ADSSSISGSN FKTNRKTRFIIHGFIDKGEE NWLANVCKNL FKVESVNCIC VDWKGGSRTG YTQASQNIRI VGAEVAYFVE FLQSAFGYSPSNVHVIGHSL GAHAAGEAGR RTNGTIGRIT GLDPAEPCFQ GTPELVRLDP SDAKFVDVIH TDGAPIVPNLGFGMSQVVGH LDFFPNGGVE MPGCKKNILS QIVDIDGIWE GTRDFAACNH LRSYKYYTDS IVNPDGFAGFPCASYNVFTA NKCFPCPSGG CPQMGHYADR YPGKTNDVGQ KFYLDTGDAS NFARWRYKVS VTLSGKKVTGHILVSLFGNK GNSKQYEIFK GTLKPDSTHS NEFDSDVDVG DLQMVKFIWY NNVINPTLPR VGASKIIVETNVGKQFNFCS PETVREEVLL TLTPC）；或由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

优选地，所述PTL蛋白及其多肽片段来自于尿液。

优选地，所述尿液PTL蛋白及其多肽片段在正常妊娠妇女中高表达。

优选地，所述制剂为正常妊娠妇女尿液PTL蛋白及其多肽片段检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒包括能够特异性结合PTL蛋白及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。

优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。

优选地，所述标准品包括PTL蛋白标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：PTL蛋白控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜。

优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种。

发明人首先收集了正常育龄妇女、正常妊娠妇女和妊娠糖尿病患者的尿液标本，离心后取上清，利用弱阳离子交换磁珠纯化和分离尿液标本。将 1μl标本与10μl基质混匀后，取1μl点在 Anchorchip靶板上，标本离子化后进行质谱分析，采集1000-10000Da范围内的数据，获得由不同质荷比的蛋白峰构成的质谱多肽图。应用BioExplorer分析软件对正常育龄妇女、正常妊娠妇女和妊娠糖尿病组的所有质谱图进行分析，筛选差异性多肽。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定，在数据库检索得到差异表达的PTL蛋白，并且与正常育龄组相比，PTL蛋白在正常妊娠妇女和妊娠期糖尿病患者的尿液中呈高表达。

本发明通过研究证实与正常育龄组相比，PTL蛋白及其多肽片段在正常妊娠妇女和妊娠期糖尿病患者的尿液中高表达。从而提出检测尿液PTL蛋白及其多肽片段可用于正常妊娠的监测或辅助诊断。

本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检尿液PTL蛋白及其多肽片段。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是PTL蛋白在正常育龄妇女、正常妊娠妇女和妊娠糖尿病患者尿液的峰面积分布图。

图2是PTL蛋白在正常育龄妇女、正常妊娠妇女和妊娠糖尿病患者尿液标本中表达的散点图。

具体实施方式

实施例1 尿液标本的收集与处理

收集首都医科大学附属北京世纪坛医院产科门诊及住院临床诊断妊娠期糖尿病患者（GDM）60例，其中30例为妊娠中期（GDM-M、13～27周末）样本、30例妊娠晚期（GDM-L、28周及以后）样本；31例门诊常规产检的正常妊娠妇女（N）；31例健康体检正常的孕龄妇女（T）即对照组的清洁中段尿液标本，年龄均为15岁～49岁。尿液收集后，400×g离心5min，取上清，分装，-80℃冻存。纳入标准：

妊娠期糖尿病患者和正常妊娠妇女自早孕期（8-12周）在我院首次孕检和建档，资料齐全；

孕24-28周行75g口服葡萄糖耐量试验（Oral GlucoseTolerance, OGTT），均符合第九版《妇产科学》中妊娠期糖尿病诊断标准；排除标准：

存在急慢性感染性、肿瘤、心血管疾病者；

既往存在糖耐量异常；

严重肝肾功能障碍者；

合并精神、智力障碍者。这些研究对象的临床特征的比较如表1-1所示。

表1-1 正常孕龄妇女（T）、正常妊娠孕妇（N）和妊娠期糖尿病（GDM）患者

注：Alb/Cr表示尿微量白蛋白与肌酐的比值<30。

实施例2 磁珠纯化和尿液多肽的筛选

利用弱阳离子交换磁珠富集尿液中的多肽，利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）分析尿液中的多肽谱。用标准品校正仪器后，将1μl洗脱液与10μl基质（0.3 %的α-氰基-4-羟基肉桂酸，HCCA）混匀，取1μl点在 Anchorchip（Autoflex MALDITOF，Bruker-Dalton）靶板上，室温干燥。通过氮激光器照射使标本离子化后进行质谱分析，采集1000-10000Da范围内的数据，获得由不同质荷比的蛋白峰构成的质谱图。对于每一个MALDI结晶点来说，共照射400次激光（每个结晶点的8个不同的位置各照射50次），平均值代表一个标本，从而得到所有样本的多肽图谱。每个样品进行三个生物学重复。应用BioExplorer分析软件对正常孕龄妇女（T）、正常妊娠孕妇（N）和妊娠期糖尿病（GDM）组的质谱图进行分析，筛选差异性多肽。质荷比（m/z）2561.6的多肽峰的在3组之间差异具有统计学差异（P<0.05），其平均峰面积的分布如图1所示。

实施例4 差异多肽的鉴定及分析

从样品管中取20ul用于LC-MS/MS分析。EASY-nLC1000 HPLC系统用于分离。液相A为0.1％甲酸乙腈溶液（2％乙腈），液相B为0.1％甲酸乙腈溶液（98％乙腈）。100％A溶液平衡100×100mm的BEHnanoACquity柱，流速400nl/min。色谱喷雾针为PN：FS360-20-10-N-20-C12。通过毛细管高效液相色谱分离样品，Q-Exactive质谱仪（Thermo）进行分析。离子源电压3.5kv，分析时间120min，母离子扫描范围为300-2000m/z。按照以下方法收集多肽和多肽片段的质荷比:每次完整扫描后收集20个片段（MS2scan，HCD）。在M/Z 200下，MS1分辨率为70,000，MS2的分辨率17,500。使用数据分析软件PD（Proteome Discoverer 1.4，thermo）进行检索。检索数据库为Mascot。母离子误差设定为20ppm，碎片离子误差设为1Da，酶切方式为非酶切,可变修饰为Oxidation（M）蛋氨酸的氧化。数据卡值，Percolator算法，FDR≤1%。差异表达的质荷比（m/z）2561.6的多肽峰在数据库中检索鉴定为PTL蛋白。

与正常对照组相比，PTL蛋白在正常妊娠孕妇（N）和妊娠期糖尿病（GDM）组患者的尿液中高表达，如图2所示，PTL蛋白在正常孕龄妇女、正常妊娠妇女和妊娠期糖尿病患者三组尿液中的表达有显著性差异，但在正常妊娠妇女和妊娠期糖尿病患者两组中差异无显著性。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110> 张, 曼

<120> 尿液胰腺甘油三酯脂肪酶蛋白及其多肽片段在正常妊娠中的应用

<130> 19PPTL-CN

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 465

<212> PRT

<213> Amino acid sequence of pancreatic triglyceride lipase

<400> 1

Met Leu Pro Leu Trp Thr Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ala Val Ala Gly

1 5 10 15

Lys Glu Val Cys Tyr Glu Arg Leu Gly Cys Phe Ser Asp Asp Ser Pro

20 25 30

Trp Ser Gly Ile Thr Glu Arg Pro Leu His Ile Leu Pro Trp Ser Pro

35 40 45

Lys Asp Val Asn Thr Arg Phe Leu Leu Tyr Thr Asn Glu Asn Pro Asn

50 55 60

Asn Phe Gln Glu Val Ala Ala Asp Ser Ser Ser Ile Ser Gly Ser Asn

65 70 75 80

Phe Lys Thr Asn Arg Lys Thr Arg Phe Ile Ile His Gly Phe Ile Asp

85 90 95

Lys Gly Glu Glu Asn Trp Leu Ala Asn Val Cys Lys Asn Leu Phe Lys

100 105 110

Val Glu Ser Val Asn Cys Ile Cys Val Asp Trp Lys Gly Gly Ser Arg

115 120 125

Thr Gly Tyr Thr Gln Ala Ser Gln Asn Ile Arg Ile Val Gly Ala Glu

130 135 140

Val Ala Tyr Phe Val Glu Phe Leu Gln Ser Ala Phe Gly Tyr Ser Pro

145 150 155 160

Ser Asn Val His Val Ile Gly His Ser Leu Gly Ala His Ala Ala Gly

165 170 175

Glu Ala Gly Arg Arg Thr Asn Gly Thr Ile Gly Arg Ile Thr Gly Leu

180 185 190

Asp Pro Ala Glu Pro Cys Phe Gln Gly Thr Pro Glu Leu Val Arg Leu

195 200 205

Asp Pro Ser Asp Ala Lys Phe Val Asp Val Ile His Thr Asp Gly Ala

210 215 220

Pro Ile Val Pro Asn Leu Gly Phe Gly Met Ser Gln Val Val Gly His

225 230 235 240

Leu Asp Phe Phe Pro Asn Gly Gly Val Glu Met Pro Gly Cys Lys Lys

245 250 255

Asn Ile Leu Ser Gln Ile Val Asp Ile Asp Gly Ile Trp Glu Gly Thr

260 265 270

Arg Asp Phe Ala Ala Cys Asn His Leu Arg Ser Tyr Lys Tyr Tyr Thr

275 280 285

Asp Ser Ile Val Asn Pro Asp Gly Phe Ala Gly Phe Pro Cys Ala Ser

290 295 300

Tyr Asn Val Phe Thr Ala Asn Lys Cys Phe Pro Cys Pro Ser Gly Gly

305 310 315 320

Cys Pro Gln Met Gly His Tyr Ala Asp Arg Tyr Pro Gly Lys Thr Asn

325 330 335

Asp Val Gly Gln Lys Phe Tyr Leu Asp Thr Gly Asp Ala Ser Asn Phe

340 345 350

Ala Arg Trp Arg Tyr Lys Val Ser Val Thr Leu Ser Gly Lys Lys Val

355 360 365

Thr Gly His Ile Leu Val Ser Leu Phe Gly Asn Lys Gly Asn Ser Lys

370 375 380

Gln Tyr Glu Ile Phe Lys Gly Thr Leu Lys Pro Asp Ser Thr His Ser

385 390 395 400

Asn Glu Phe Asp Ser Asp Val Asp Val Gly Asp Leu Gln Met Val Lys

405 410 415

Phe Ile Trp Tyr Asn Asn Val Ile Asn Pro Thr Leu Pro Arg Val Gly

420 425 430

Ala Ser Lys Ile Ile Val Glu Thr Asn Val Gly Lys Gln Phe Asn Phe

435 440 445

Cys Ser Pro Glu Thr Val Arg Glu Glu Val Leu Leu Thr Leu Thr Pro

450 455 460

Cys

465

Claims

1.尿液胰腺甘油三酯脂肪酶蛋白PTL在制备用于监测妇女正常妊娠制剂中的应用，所述尿液PTL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿液PTL蛋白在正常妊娠妇女中高表达。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为正常妊娠妇女尿液PTL蛋白检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括能够特异性结合PTL蛋白的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述标准品包括PTL蛋白标准品、人源化标签抗体标准品；所述质控品包括：PTL蛋白控品、人源化标签抗体质控品；所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种。