CN112912047A - 用于闭环胰岛素递送的具有葡萄糖响应基质的微针阵列贴片 - Google Patents

用于闭环胰岛素递送的具有葡萄糖响应基质的微针阵列贴片 Download PDF

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Abstract

本发明公开了微针贴片的组合物和方法，所述微针贴片包含经设计用于葡萄糖触发的胰岛素递送的共聚物。一方面，本文公开了包含载有胰岛素的共聚物的微针贴片及其使用方法；其中所述胰岛素在高血糖环境中从所述微针中解离；其中所述共聚物包含聚(N‑乙烯基吡咯烷酮‑共聚‑2‑(二甲基氨基)丙烯酸乙酯‑共聚‑3‑(丙烯酰胺基)苯基硼酸。

Description

用于闭环胰岛素递送的具有葡萄糖响应基质的微针阵列贴片
本申请要求于2018年8月24日提交的美国临时申请号62/722，438以及于2018年9月5日提交的美国临时申请号62/727，290的权益，这两件临时申请的全部内容以引用方式并入本文。
背景技术
糖尿病目前影响着全球4.15亿人口，并且预计到2040年这一数字将增加到6.42亿。胰岛素对于1型糖尿病的存活至关重要，并且通常也是治疗2型糖尿病所需的，以便控制血糖并预防并发症。然而，传统的外源性胰岛素施用“开环皮下注射”无法与由朗格罕斯胰岛细胞内的β-细胞对血糖实现的精细调节相匹配，其中内源性胰岛素分泌通过新陈代谢与葡萄糖转运关联起来。血糖控制不良导致高糖尿病并发症风险，诸如截肢、失明和肾衰竭。此外，低血糖可导致行为和认知障碍、癫痫、昏迷、脑损伤或死亡。
迫切需要闭环系统，该系统能够响应于高血糖而“分泌”所需量的胰岛素，同时在血糖正常的情况下维持基础胰岛素释放动力。为此开发的电子闭环装置在算法精度和传感器可靠性方面仍然存在挑战。或者，在GOx、苯基硼酸(PBA)和葡萄糖结合蛋白(GBP)的辅助下，化学工程制剂或装置也引起了越来越多的关注。尽管如此，要展示出能够结合所需性质的智能胰岛素递送的配方或装置，仍然面临着艰巨的挑战，所述功能包括(i)具有与胰岛β细胞相似的药代动力学的快速体内葡萄糖响应行为，(ii)足够的每天使用的负载能力，(iii)体积小和/或设计简单，易于施用，(iv)可大规模生产；和(v)生物相容性，无急性和长期毒性。因此，仍然不断需要开发新的智能胰岛素递送系统而不受现有系统缺陷的阻碍。
发明内容
本文公开了与用于胰岛素递送的微针贴片相关的方法和组合物。例如，本文公开了包含胰岛素负载共聚物的微针贴片；其中在高血糖环境中胰岛素从所述微针中解离。
一方面，本文公开了包含载有胰岛素的共聚物的微针贴片；其中在高血糖环境中，胰岛素从所述微针中解离；其中所述共聚物包含聚(N-乙烯基吡咯烷酮-共聚-2-(二甲基氨基)丙烯酸乙酯-共聚-3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸。
本文还公开了任何前述方面的微针贴片，其中所述共聚物还包含二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)，并且其中所述EGDMA并入所述微针中并交联所述载有胰岛素的聚合物。
本文还公开了包含任何前述方面的微针贴片的自调节胰岛素递送系统。
一方面，本文公开了治疗、减少、抑制或预防受试者的高血糖症或包含高血糖症作为症状的疾病(包括但不限于糖尿病(I型或II型))的方法，其包括向受试者施用任何前述方面的微针贴片或自调节胰岛素递送系统。因此，一方面，本文公开了治疗、减少、抑制或预防高血糖症或包含高血糖症作为症状的疾病(包括但不限于糖尿病(I型或II型))的方法，其包括向受试者施用包含载有胰岛素的共聚物的微针贴片；其中所述共聚物包含N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、聚乙烯醇(PVA)或丙烯酸甲酯PVA(m-PVA)、丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(DMAEA)、3-(丙烯酸酰胺基)苯基硼酸(3APBA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯和/或4-(溴乙基)苯基硼酸(诸如例如，聚(N-乙烯基吡咯烷酮-共聚-2-(二甲基氨基)丙烯酸乙酯-共聚-3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸)；其中所述共聚物还包含胰岛素；并且其中所述胰岛素在高血糖环境中从所述微针中解离。
附图说明
图1A、图1B和图1C显示了使用具有葡萄糖响应基质(GR-基质)的MNs-阵列贴片的葡萄糖响应胰岛素递送系统的示意图。图1A显示了使用原位光聚合策略由硅酮模具制造智能胰岛素贴片的过程的示意图。图1B显示了葡萄糖触发的从GR-MNs释放胰岛素的机制。在高血糖状态下，葡萄糖-硼酸酯复合物的形成增加的负电荷可以诱导聚合物基质的体积相转变，并削弱带负电荷的胰岛素与聚合物之间的静电相互作用，从而促进胰岛素从MN的快速释放。糖尿病猪的血糖水平可以通过施用智能胰岛素贴片来有效调节。图1C显示了GR-MN的特性。(i)GR-MN贴片的代表性照片。(ii)MN阵列的代表性SEM图像。比例尺：500μm。(iii)代表性相位衬度(上)和荧光显微镜(下)。
图2A、图2B、图2C、图2D、图2E和图2F显示了GR-MN的体外特性。图2A显示了GR-MN的机械性能。图2B通过比较注射胰岛素溶液后的初始BGL和在60min的BGL，显示了从新鲜制备的1型糖尿病小鼠贴片中提取的胰岛素的降糖活性。数据以平均值±标准偏差表示(n＝5)。图2C显示了从室温下保存的贴片中提取的胰岛素的降糖活性。数据以平均值±标准偏差表示(n＝5)。图2D显示了葡萄糖浓度依赖性葡萄糖结合能力。数据以平均值±标准偏差表示(n＝5)。图2E显示了在37℃下几种葡萄糖浓度下的体外累积胰岛素释放。数据以平均值±标准偏差表示。(n＝5)。图2F显示搏动释放曲线，表示载有罗丹明B标记胰岛素(红色)的MN贴片的胰岛素释放速率与葡萄糖浓度的函数关系(蓝色：100mg/dL；红色：400mg/dL)。比例尺：500μm。
图3显示了在37℃下，不同葡萄糖浓度下从DMAEA与3APBA的比例为1:1比例(左)或1:20比例(右)的聚合物基质中体外累积的胰岛素释放。数据以平均值±标准偏差表示。(n＝3)。
图4显示了DMAEA与3APBA的比例为1:4的聚合物基质的胰岛素释放随葡萄糖浓度的变化。数据以平均值±标准偏差表示(n＝3)。
图5A、图5B、图5C、图5D、图5E和图5F显示了在1型糖尿病小鼠模型中GR-MN的体内评价。图5A显示了用MN贴片经皮治疗的小鼠背部皮肤(蓝色虚线内的区域)。图5B和图5C，用PBS溶液、CR-MN和GR-MN治疗后，在STZ诱导的糖尿病小鼠中BGL(5B)和血浆人胰岛素浓度(5C)。胰岛素剂量：0.5mg。施用GR-MN的**P<0.01，施用CR-MN的***P<0.001。数据以平均值±标准偏差表示(n＝5)。图5D显示了与健康对照小鼠相比，在施用GR-MN或CR-MN后4h的糖尿病小鼠的体内腹膜内葡萄糖耐量试验。葡萄糖剂量：1.5g/kg。施用GR-MN的**P<0.01，施用CR-MN的***P<0.001。数据以平均值±标准偏差表示(n＝5)。图5E显示了基于120分钟内曲线下面积计算的响应，其中将基线设置为0min血糖读数。数据以平均值±标准偏差表示(n＝5)。***P<0.001，学生t检验。图5F显示了在GR-MN施用后4h，腹膜内葡萄糖激发促进了体内葡萄糖响应性胰岛素释放。葡萄糖剂量：3g/kg。数据以平均值±标准偏差表示(n＝5)。蓝色箭头指示在(5B-5C)中MN施用的时间点，红色箭头指示在(5D)和(5F)中葡萄糖施用的时间点。
图6A、图6B、图6C、图6D、图6E和图6F显示了在1型糖尿病小型猪模型中GR-MN的体内评价。图6A显示了在腿部部位(上)用GR-MN治疗的具有CGMS的小型猪的示意图。GR-MN在猪腿上的照片(左下)。小型猪皮肤的H&E染色部分被一个MN穿透(右下)。比例尺：200μm。图6B和图6C显示分别在用GR-MN(6B)和CR-MN(6C)处理后的三只STZ诱导的糖尿病小型猪的BGL。胰岛素剂量：7mg。图6D显示了在施用GR-MN或CR-MN后4h的糖尿病小型猪的体内口服葡萄糖耐量试验。葡萄糖剂量：1g/kg。数据以平均值±标准偏差表示(n＝3)。图6E显示了基于150min内曲线下面积计算的响应，其中将基线设置为0min血糖读数。数据以平均值±标准偏差表示(n＝3)。**P<0.01，学生t检验。图6F显示了在GR-MN施用后4h，静脉内葡萄糖激发促进了体内葡萄糖响应性胰岛素释放。葡萄糖剂量：0.7g/kg。数据以平均值±标准偏差表示(n＝3)。蓝色箭头指示MN施用的时间点，粉红色箭头指示进食(6B-6C)的时间点。红色箭头指示(6D)和(6F)中葡萄糖施用的时间点。
图7显示在三个单独的实验中进行的多轮测试，在GR-MN施用后4h，静脉内葡萄糖激发促进了体内葡萄糖响应性胰岛素释放。每轮葡萄糖剂量：0.7g/kg。红色箭头指示葡萄糖施用的时间点。
图8显示了由一个葡萄糖分子与两个PBA分子形成的双络合的示意图(左)。胰高血糖素在pH 7.4磷酸盐缓冲液中的体外葡萄糖响应释放，其中缓冲液补充了模仿高血糖(200mg/dL，400mg/dL)、正常血糖(100mg/dL)或低血糖(50mg/dL)的葡萄糖。数据以平均值±标准偏差表示(n＝3)(右)。
具体实施方式
本文公开了用于治疗、减少、抑制或预防高血糖症的组合物和方法，其中高血糖症包括但不限于包含高血糖症作为症状的疾病，例如糖尿病(I型或II型)。所述组合物包含胰岛素分子。在一些实施例中，所述组合物还包含胰岛素的生物活性衍生物。用于治疗糖尿病的合适的非基于胰岛素的治疗剂包括但不限于胰岛素敏化剂、DPP IV抑制剂、胰高血糖素样肽1(GLP-1)及其类似物、胰岛素促分泌剂，例如但不限于磺酰脲类、格列奈类、人抑胃肽(GIP)、胰岛素受体激活剂、双胍类、噻唑烷二酮类，α-葡萄糖苷酶抑制剂等。葡萄糖响应微针配置为可逆地结合胰岛素分子，在高葡萄糖条件下释放胰岛素。治疗糖尿病的方法包括施用包含胰岛素分子的组合物。在一些实施例中，将药学有效量的组合物施用于患有糖尿病的受试者。
本申请通篇使用的术语应以本领域普通技术人员的普通和典型含义来解释。然而，申请人希望以下术语被赋予如下定义的特定定义。
如本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。例如，术语“一个单元”包括多个单元，其中包括它们的混合物。
如本领域的普通技术人员所理解的，术语“约”和“大约”被定义为“接近”。在一个非限制性实施例中，术语被定义为在10％以内。在另一个非限制性实施例中，术语被定义为在5％以内。在另一个非限制性实施例中，术语被定义为在1％以内。
蛋白质的“活性”，包括与“生物活性”有关的那些，其中包括例如转录、翻译、细胞内易位、分泌、激酶磷酸化、蛋白酶切割和/或与其他蛋白质的同嗜性和异嗜性结合。
术语“施用”是指通过吸入或通过植入式储液器的口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌肉内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道施用。可使用透皮微针-阵列贴片进行给药。术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。
“生物相容的”通常是指材料及其任何代谢物或降解产物通常对接受者无毒并且不对受试者造成任何显著的副作用。
“组合物”旨在包括活性剂和惰性的(例如，可检测的试剂或标记物)或活性的诸如佐剂的另一种化合物或组合物的组合。
如本文所用，术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所述的元素，但是不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由…组成”应指排除对组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文所定义的元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药用载体，诸如磷酸盐缓冲液、防腐剂等。“由…组成”应指排除多于其他成分的痕量元素和用于施用本发明的组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个所定义的实施例都在本发明的范围内。
“对照”是在实验中用于比较目的的替代受试者或样本。对照可为“阳性对照”或“阴性对照”。
如本文所用，“缀合”是指不可逆的结合相互作用。
如本文所用，“置换”是指通过对特定蛋白质结构域具有比被要置换的肽、化学物质或核酸的亲和力大的化学物质、肽或核酸干扰例如蛋白质结构域和肽，蛋白质结构域和化学物质，蛋白质结构域和核酸序列之间的分子或化学相互作用。
“控释”或“缓释”是指为了在体内达到所需的药代动力学曲线，以可控的方式从给定剂型释放药剂。“控释”药剂递送的一个方面是操纵制剂和/或剂型以建立所需的药剂释放动力学的能力。
“有效量”是足以产生有益或期望结果的量。“有效的”药剂的量将在不同受试者之间变化，取决于受试者的年龄和一般情况、特定的一种或多种药剂等许多因素。因此，并不总是能够指定量化的“有效量”。然而，任何受试者病例中的适当的“有效量”可由本领域的普通技术人员使用常规实验方法确定。此外，如本文所用，并且除非另外特别说明，否则药剂的“有效量”也可以指涵盖治疗有效量和预防有效量的量。实现治疗效应所需的药剂的“有效量”可根据诸如受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可每天施用若干分开的剂量，或者可按照治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。
如本文所用，术语“高葡萄糖条件”是指具有大于或等于200mg/dL的葡萄糖浓度的环境。例如，“高血糖水平”是指血流中的葡萄糖水平大于或等于200mg/dL。在一些实施例中，高葡萄糖条件为200-400mg/dL。在其他实施例中，高葡萄糖条件为300-400mg/dL。
如本文所用，“接头”是指连接相邻分子的分子。一般来讲，除连接相邻分子或保持它们之间的一些最小距离或其他空间关系之外，接头无特定的生物活性。在一些情况下，可选择接头以影响或稳定相邻分子的某些特性，诸如分子的折叠、净电荷或疏水性。
如本文所用，术语“低葡萄糖条件”是指具有0至200mg/dL的葡萄糖浓度的环境。例如，“低血糖水平”是指血流中的葡萄糖水平小于200mg/dL。
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用，是指包含两个或更多个氨基酸的天然或合成分子，所述氨基酸通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的α-氨基连接。
术语“载体”或“药用载体”意指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药用或治疗用的药用载体。如本文所用，术语“载体”或“药用载体”包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”包括任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂、脂质或本领域中熟知的用于药物制剂的其他材料，并且如下文所详述。
如本文所用，术语“聚合物”是指相对高分子量的天然或合成有机化合物，其结构可由重复的小单元、单体(例如，聚乙烯、橡胶、纤维素)表示。合成聚合物通常由单体的加成或缩聚形成。如本文所用，术语“共聚物”是指由两种或更多种不同的重复单元(单体残基)形成的聚合物。以举例的方式并且非限制性地，共聚物可为交替共聚物、无规共聚物、嵌段共聚物或接枝共聚物。还可设想，在某些方面，嵌段共聚物的各种嵌段链段本身可包含共聚物。术语“聚合物”包括所有形式的聚合物，包括但不限于天然聚合物、合成聚合物、均聚物、杂聚物或共聚物、加成聚合物等。
范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一特定值。当表达此类范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，在利用前词“约”将值表示为近似值时，应当理解，该特定值形成另一个实施例。还应当理解，每一个范围的端点在相对于另一个端点和独立于另一个端点方面都是显著的。还应当理解，本文公开了许多值，并且每一个值在本文中除值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。
向受试者“给药/施用”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。可通过任何合适的途径进行施用，包括口服、局部、静脉、皮下、经皮、穿皮、肌肉内、关节内(intra-joint)、肠外、小动脉内、皮内、脑室内、颅内、腹腔内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过植入的存贮器、肠外(例如，皮下、静脉、肌肉内、关节内(intra-articular)、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹腔内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所用，“并行施用”、“联合施用”、“同时施用(simultaneous administration或administered simultaneously)”意指化合物在同一时间点施用或基本上紧接着施用。在后一种情况下，该两种化合物的施用时间足够接近，以至于观察到的结果与在同一时间点施用化合物时获得的结果不可区分。“全身施用”是指通过将药剂引入或递送到受试者身体的广泛区域(例如，超过身体的50％)的途径，例如通过进入循环或淋巴系统，将药剂引入或递送给受试者。相比之下，“局部施用”是指通过一条途径向受试者引入或递送药剂，该途径将该药剂引入或递送到紧邻施用点的一个或多个区域，并且不以治疗上显著的量系统地引入该药剂。例如，局部施用的药剂在局部施用点的附近很容易被检测到，但在受试者身体的远侧部分不可检测到或检测到的量可以忽略不计。施用包括自我施用和他人施用。
“药理活性”(或仅“活性”)，正如在“药理活性”衍生物或类似物中所用的那样，可指具有与母体化合物相同类型的药理活性并且程度大致相等的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。
“治疗剂”是指任何具有有益生物效应的组合物。有益的生物效应包括治疗效应和预防效应两者，其中治疗效应为例如治疗疾病或其他不希望的生理症状，预防效应为例如预防疾病或其他不希望的生理症状(例如，1型糖尿病)。该术语还涵盖本文中具体提及的有益剂在药用的药理活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药剂、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或者当明确标识特定的药剂时，应当理解，该术语包括药剂本身以及在药用的药理活性盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
组合物(例如，包含药剂的组合物)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效地达到所需的治疗结果的量。在一些实施例中，所需的治疗结果是控制I型糖尿病。在一些实施例中，所需的响应是控制II型糖尿病。给定治疗剂的治疗有效量通常将根据诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。术语还可指有效促进所需的治疗效应(诸如疼痛缓解)的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间推移的量)。精确的所需治疗效应将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待施用的药剂和/或药剂制剂(例如，治疗剂的效力、制剂中的药剂浓度等)，以及本领域中的普通技术人员所理解的各种其他因素而变化。在一些情况下，在向受试者连续几天、几周或几年施用多种剂量的该组合物后，可获得所需的生物或医学反应。
术语“受试者”在本文中定义为包括动物，诸如哺乳动物，包括但不限于灵长类(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在一些实施例中，受试者是人。
如本文所用，术语“治疗”、“治疗过程”、“治疗方法”及其语法变体包括部分或完全延迟、缓解、减轻或减小疾病或病症的一种或多种伴随症状的强度和/或缓解、减轻或阻止一种或多种疾病或病症的原因。根据本发明所述的治疗可防范性、预防性、姑息性或补救性地应用。预防性治疗是在发病前(例如，在出现明显的癌症迹象之前)、在早期发作期间(例如，在癌症的初始体征和症状之后)或在癌症的确定发展之后向受试者施用。预防性给药可在感染症状出现之前数天至数年发生。在一些情况下，术语“治疗”及其语法变化包括与治疗对象之前或与一般人群或研究人群中此类症状的发生率相比，控制血糖水平并降低糖尿病症状的严重性。
1.“减少”可以指导致较少的症状数量、疾病、组合物、病症或活动的任何变化。当含有该物质的基因产物的遗传产量与不含该物质的基因产物的遗传产量相比较小时，物质也被理解为减少基因的遗传产量。此外，举例来说，减少可以是一种障碍症状的改变，使得症状比以前观察到的要少。减少可以是统计学上显著的量的病症、症状、活动、组合物中的任何个体、中位数或平均减少。因此，只要减少非常显著，减少可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
2.“抑制(Inhibit、inhibiting和inhibition)”意指降低活性、反应、病症、疾病或其他生物参数。这可以包括但不限于活动、反应、病症或疾病的完全消融。这也可以包括，例如，与未经处理的或对照水平相比，活动、反应、病症或疾病减少10％。因此，与未经处理的或对照水平相比，减少量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或介于两者之间的任何减少量。
3.“减少”或其他形式的单词，是指降低事件或特征(例如，肿瘤生长)。应当理解，这通常是与某个标准或期望值有关的，换言之，这是相对的，但是并非总是需要参考的标准或相对值。例如，“减少肿瘤生长”是指相对于标准或对照，降低肿瘤的生长速率。
4.“预防”或其他形式的词是指停止特定事件或特征，稳定或延迟特定事件或特征的发展或进程，或最小化发生特定事件或特征的机会。预防不需要与对照进行比较，因为它通常比例如减少更绝对。如本文所使用的，某些事情可以减少但不能预防，但是减少的某些事情也可以预防。同样，某些事情可以预防但不能减少，但是预防的某些事情也可以减少。应当理解，在使用减少或预防的情况下，除非另外特别指出，否则还明确公开了另一个词的使用。
如本文所用，术语“特异性结合”当指多肽(包括抗体)或受体时是指结合反应，其决定了蛋白质或多肽或受体在蛋白质和其他生物制品的异质种群中的存在。因此，在指定条件下(例如抗体情况下的免疫测定条件)，当指定的配体或抗体与样品中存在的其他蛋白质或配体或抗体可能在生物体中接触的其他蛋白质并非大量结合时，指定的配体或抗体“特异性结合”其特定的“靶标”(例如，特异性结合内皮抗原的抗体)。通常，与第二个分子“特异性结合”的第一分子与第二个分子的亲和常数(Ka)大于约105M–1(例如106M–1、107M–1、108M–1、109M–1、1010M–1、1011M–1和1012M–1或更高)。
此处，描述了一种用于自调节胰岛素递送的新型葡萄糖响应微针(MN)阵列贴片。具体而言，开发了一种新的策略，利用PBA作为葡萄糖响应部分来实现按需微针(MN)介导的透皮胰岛素递送。PBA可以与葡萄糖可逆地相互作用，生成环状的硼酸酯，从而使平衡从不带电荷的基团转移到带负电荷的基团(图1a)。应当理解并且在本文中预期还可以包括其他葡萄糖响应部分。例如，所有天然或合成的葡萄糖结合分子和蛋白质，以及与pH、H2O2或氧敏感聚合物形成的载有葡萄糖氧化酶(Gox)的微针。
一方面，葡萄糖响应(GR)微针(MN)贴片(GR MN)由以下单体的聚合物制成：N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、聚乙烯醇(PVA)或丙烯酸甲酯PVA(m-PVA)、丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(DMAEA)、3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸(3APBA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯和/或4-(溴乙基)苯基硼酸。
应当理解并且在本文中预期的是，公开的在微针中使用的葡萄糖响应聚合物基质可以由三种不同种类的单体组成：a)带有葡萄糖响应基团的单体；b)带有正电荷的基团的单体；c)用于形成基质骨架的主要单体。一方面，微针可以包含具有一个乙烯基的单体和一个可以使用的葡萄糖响应基团。葡萄糖响应基团可以是硼酸酯基团。在生理条件下结合葡萄糖的硼酸酯传感器是优选的。有用的硼酸酯的实例包括但不限于芳基硼酸酯、氨基甲基-芳基-2-硼酸酯和在附近具有氨基的其他硼酸酯或被吸电子基团取代的芳基硼酸酯，例如，磺基苯基硼酸酯、羧基苯基硼酸酯、硝基苯基硼酸酯、氰基苯基硼酸酯、氟苯基硼酸酯、吡啶硼酸酯、吡啶鎓硼酸酯或它们的组合。在一个实例中，使用3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸(3APBA)。制备微针的聚合物还可以包含具有一个乙烯基和一个可以使用的带正电荷的基团的单体。有用的带正电荷基团的实例包括但不限于氨基、仲胺基、叔胺基、季铵基和咪唑鎓。在一个实例中，使用丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(DMAEA)。此外，可以使用具有至少一个乙烯基的单体来形成基质的骨架。液态单体是优选的。有用的单体的实例包括但不限于杂芳族乙烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、烯丙基酯、含单官能氧化乙炔的(甲基)丙烯酸酯，例如聚(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯。应该理解，可以使用一种或多种类型的烯烃单体来制备本发明的基质。根据最终用途，可以选择所需的单体组合以及所需的官能化类型和数量。在一个实例中，使用N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)。因此，一方面，聚合物可以是共聚物(包括二嵌段共聚物)，诸如例如聚(N-乙烯基吡咯烷酮-共聚-2-(二甲基氨基)丙烯酸乙酯-共聚-3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸)[p(NVP-共聚-DMAEA-共聚-3APBA)]、mPEGn-聚(2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯-4-(溴乙基)苯硼酸)n1(MPEGn-P(DMAEMA-PBA)n1)；其中n表示MPEG重复次数，并且可以为在约1到约8000重复之间，优选地，在约2K到约6K重复之间，最优选地，在约4.5K到约5.5K重复之间的任意重复次数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1K、1.1K、1.2K、1.3K、1.4K、1.5K、2K、2.5K、3K、3.5K、4K、4.5K、4.6K、4.7K、4.8K、4.9K、5K、5.1K、5.2K、5.3K、5.4K、5.5K、6K、6.5K、7K、7.5K或8K)；并且其中，n1表示P(DMAEMA-PBA)重复次数，可以为在约1到约18000之间，优选地，在约4K到约16K重复之间，最优选地，在约6K到约14K重复之间的任意重复次数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1K、1.1K、1.2K、1.3K、1.4K、1.5K、2K、2.5K、3K、3.5K、4K、4.5K、4.6K、4.7K、4.8K、4.9K、5K、5.1K、5.2K、5.3K、5.4K、5.5K、6K、6.5K、7K、7.5K、8K、8.5K、9K、9.5K、10K、10.5K、11K、11.5K、12K、12.5K、13K、13.5K、14K、14.5K、15K、15.5K、16K、16.5K、17K、17.5K或18K)。例如，本文所公开的是微针贴片，其包含胰岛素和/或葡萄糖响应酶的胶束，其中该胶束包含MPEG5K-P(DMAEMA-PBA)14K或MPEG5K-P(DMAEMA-PBA)6K。
一方面，EGDMA可以用作交联剂，例如诸如具有EGDMA交联剂的p(NVP-共聚-DMAEA-共聚-3APBA)(图1b)。可以在所公开的微针贴片中使用的其他交联剂包括具有至少两个乙烯基的交联剂，可以用于交联聚合物基质。有用的交联剂的实例包括但不限于二甲基丙烯酸乙二醇酯、亚甲基双丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯。在一个实例中，使用二甲基丙烯酸乙二醇酯。
简而言之，当暴露于高血糖条件时，由于在3-APBA单元中形成葡萄糖-硼酸酯复合物，聚合物基质内电荷的增加导致MN肿胀，从而触发了预载的胰岛素在皮肤组织中的快速扩散。在正常血糖情况下，受抑制的体积相变会降低胰岛素释放速率，从而降低低血糖的风险。
为了稳定微针聚合物，微针可以包含聚乙烯醇(PVA)、EGDMA或丙烯酸甲酯PVA(m-PVA)。在PVA或N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)上，P(DMAEMA-PBA)的苯硼酸与顺-1,3-二醇之间通过酸惰性酯键交联而稳定。在一个方面，包封胰岛素的胶束的交联可以被降解。掺入预载的胰岛素的微针中m-PVA的交联可形成不可裂解的共价键。
所公开的微针在高血糖条件下释放胰岛素。应当理解并且在本文中的是，在高血糖条件下，由于在3-APBA单元中形成葡萄糖-硼酸酯复合物，聚合物基质内电荷的增加导致MN肿胀，从而触发了预载的胰岛素在皮肤组织中的快速扩散。在正常血糖情况下，受抑制的体积相变会降低胰岛素释放速率，从而降低低血糖的风险。一方面，治疗有效量的胰岛素持续释放至少24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、96小时。
在一个方面，所公开的微针贴片可包含多个微针，其中该多个微针具有约200μm至约800μm的中心到中心间隔，例如约200μm、225μm、250μm、275μm、300μm、325μm、350μm、375μm、400μm、425μm、450μm、475μm、500μm、525μm、550μm、575μm、600μm、625μm、650μm、675μm、700μm、725μm、750μm、775μm或800μm的中心到中心间隔。
还可以理解和预期，当针的长度足够长以到达真皮层下的所需组织时，所公开的微针贴片中的多个微针是有效的。因此，在一个方面中，本文公开了其中多个微针具有约600nm到1.8μm的高度的设备。例如，该多个微针可以具有约600nm、650nm、700nm、750nm、800nm、850nm、900nm、950nm、1.0m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m或1.8μm的高度。
在一个方面，所公开的微针贴片可以是自调节胰岛素递送系统的组件。
所公开的微针贴片可向需要胰岛素的受试者提供自调节的胰岛素施用。因此，在一个方面，本文所公开的是治疗、减少、抑制或预防受试者中的高血糖(诸如例如，糖尿病受试者中的高血糖)的方法，包括向受试者施用任何前述方面的微针贴片。因此，例如，本文公开了治疗、减少、抑制或预防受试者的糖尿病(例如I型或II型糖尿病)的方法，其包括向受试者施用包含任何共聚物的葡萄糖响应微针贴片(例如，本文公开的p(NVP-共聚-DMAEA-共聚-3APBA))；并且其中胰岛素在酸性、高血糖和/或氧化环境中从微针中解离。
如本文所用，“I型糖尿病”是指由于自身免疫性破坏胰岛素产生细胞和降低身体产生胰岛素的能力而导致的糖尿病。胰岛素的缺失导致血糖升高。
实例
糖尿病是一种经常导致严重的继发性并发症的慢性疾病，如今困扰着全球超过4.25亿人。频繁监测血糖水平和注射胰岛素是患有1型和2型糖尿病的人的传统方法，这被称为开环系统。但是，这种开环策略无法令人满意，甚至在用药过量时致命。闭环系统可以在无需患者参与的情况下进行监测和递送，它能够响应升高的葡萄糖浓度重新释放胰岛素，并在正常范围内严格调节血糖水平，而无低血糖的风险。因此，可以智能地模拟胰腺β细胞功能的葡萄糖响应胰岛素递送系统被认为是糖尿病治疗的优选方案。
为此，已经研究了多种基于葡萄糖氧化酶(Gox)、苯基硼酸(PBA)和葡萄糖结合蛋白作为葡萄糖监测部分的葡萄糖响应胰岛素递送系统。然而，这些方法通常受到一些挑战的限制，包括低胰岛素负载效率和含量、响应速度慢、施用过程复杂以及潜在的生物相容性问题。
智能胰岛素贴片的制备和表征。
GR-MN贴片的针由载有胰岛素的葡萄糖响应聚合物基质组成，该基质是由载有NVP、DMAEA、3APBA和EGDMA的预载有胰岛素的单体混合物在4℃下原位光聚合制成的。选择NVP作为主要单体，因为它在环境条件下呈液态，因此可以充当溶解其他单体的溶剂。所得的MN以20×20的阵列排列，每个金字塔形针的底侧为400μm，高度为900μm。然后，使用柔性的可商购的UV可固化材料进一步制备贴片的基底。GR-MN贴片的荧光图像显示，罗丹明B标记胰岛素均匀地分布在每个针的尖端区域(图1C)。另外，原位光聚合方法几乎导致了胰岛素的100％包封效率，对MN的负载能力高达20wt％，这是潜在临床应用的目标。使用拉伸压缩机(图2A)进一步确定MN的断裂力为0.75N/针，这足以使皮肤穿透而不会破裂。
在制造MN贴片的过程中，需要避免有机溶剂和高温以维持胰岛素的稳定性。从所得贴片中提取的胰岛素在糖尿病小鼠中表现出与新鲜胰岛素相似的降血糖作用(图2B)。另外，聚合MN可以防止负载的胰岛素在室温下变性。通过将室温储存的贴片中提取的胰岛素与新鲜的胰岛素溶液进行比较，可以估计贴片中胰岛素的稳定性可以在室温下保持至少8周(图2C)。
体外葡萄糖响应胰岛素释放。
先前已将PBA基团用于检测葡萄糖。选择性结合葡萄糖的基本参数是PBA基团的pKa。为了降低3APBA的pKa以增强其在生理pH下的葡萄糖识别能力，引入了路易斯碱DMAEA以通过质子化的二甲基氨基通过静电吸引(B--N+)来稳定硼酸酯。通过在具有不同葡萄糖浓度的PBS缓冲液中孵育来测量所得的包含3APBA/DMAEA的聚合物基质的葡萄糖结合能力。在典型的高血糖状态(400mg/dL)下，聚合物基质结合葡萄糖的量比在正常血糖状态(100mg/dL)下结合的葡萄糖量高5.7倍(图2D)。
高血糖条件下增强的葡萄糖结合会导致聚合物基质中负电荷的密度增加，从而引起体积相变并削弱胰岛素与基质之间的静电相互作用。在具有不同比例的正电荷单元(DMAEA)与负电荷单元(3APBA)的样品中研究了胰岛素的释放速率。如图2E所示，在DMAEA与3APBA的比例为1:4的聚合物基质中，在400mg/dL葡萄糖水平观察到胰岛素快速释放，而在0mg/dL或100mg/dL葡萄糖水平观察到相对缓慢的释放。相比之下，在DMAEA与3APBA比例为1:1的样品中，胰岛素在所有葡萄糖浓度下的释放速率慢。
而在DMAEA与3APBA比例为1:20的样品中胰岛素的释放速率快，这归因于基质内过量的正电荷或负电荷(图3)。因此，在随后的所有体外和体内研究中均使用了DMAEA与3APBA比例为1:4的聚合物基质。此外，在DMAEA与3ABPA的比例为1:4的情况下，随着葡萄糖浓度从正常血糖状态逐渐变为高血糖状态，胰岛素释放的速率增加(图4)。通过在正常和高血糖溶液中交替孵育，也可以获得几个周期的胰岛素的搏动释放曲线(图2F)。综合在一起，结果证实胰岛素从聚合物基质中的释放速率以葡萄糖依赖性方式调节。
1型糖尿病小鼠模型中智能胰岛素贴片的体内研究。
在链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠模型中评估了GR-MN的体内性能。将糖尿病小鼠随机分组，并经皮暴露于不同样品，包括GR-MN和无响应交联的MN(CR-MN)贴片作为对照(胰岛素剂量：0.5mg)(图5A)。随着时间监测经处理小鼠的BGL。如所预期的，经CR-MN和GR-MN处理的小鼠中BGL均降低至低于200mg/dL(图5B)。然而，用CR-MN处理的组不能维持正常血糖状态，BGL在4h后恢复为高血糖状态。相反，由于智能葡萄糖响应，GR-MN显示可以在目标范围(<200mg/dL)内调节BGL超过10h。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行的血浆胰岛素测量显示，GR-MN组的持续胰岛素释放较高，与持续的正常血糖BGL水平一致(图5C)。
接下来，在施用后4h以1.5g/kg的葡萄糖剂量进行腹膜内葡萄糖耐量试验(IPGTT)以评估血糖调节能力。如图5D和图5E所示，用GR-MN处理的健康小鼠中BGL和糖尿病小鼠中BGL在血糖峰值后恢复到血糖正常，而用CR-MN处理的小鼠中BGL在120min内显示BGL逐渐增加。为了确认血糖促进的胰岛素在体内的释放，在GR-MN施用后4h，对糖尿病小鼠进行了更高剂量(3g/kg)的葡萄糖激发。BGL升高后，血浆胰岛素水平明显升高，此后BGL逐渐降低，表明GR-MN的葡萄糖响应迅速(图5F)。苏木精和曙红(H&E)染色结果显示，在1周后，GR-MN处理部位的中性粒细胞浸润不明显。
1型糖尿病小型猪模型中智能胰岛素贴片的体内研究。
与啮齿动物模型相比，小型猪的葡萄糖代谢与人类系统更为相似。另外，就通常结构、厚度、毛发稀疏、胶原蛋白和脂质组成而言，猪皮肤被认为是人类皮肤的良好模型。因此，在STZ诱导的1型哥廷根小型猪模型中评估GR-MN的体内性能。糖尿病小猪在麻醉下用7mg胰岛素剂量的CR-MN或GR-MN经皮处理，然后通常每天进食2餐。如图6A所示，MN贴片可以有效地穿透小型猪的皮肤。为了获得小型猪BGL的实时和持续记录，在小型猪实验中集成了连续的葡萄糖监测系统(CGMS，Dexcom，美国)。2h后，CR-MN和GR-MN处理的猪的BGL均降至正常血糖水平(图6B和图6C)。下午饭后，CR-MN处理的猪立即升高为高血糖状态。但是，用GR-MN处理的猪中的BGL显示出少量增加，并且在进餐后迅速恢复到正常的血糖状态。可以将BGL维持在减少的状态一整夜，直到第二天下一顿饭为止。尽管在施用期间BGL确实降低至40mg/dL(CGMS的检测下限)以下，但未观察到低血糖的症状，因为小型猪的正常血糖范围较低(猪为40-80mg/dL，人类为80-120mg/dL)。
CR-MN和GR-MN处理后4h进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。与小鼠模型中的结果相似，在用CR-MN处理的小型猪中进行葡萄糖激发后，BGL迅速升高至高血糖状态(图6D和图6E)。相比之下，所施用的GR-MN在葡萄糖激发后能够抑制BGL的升高，并在100min后重新建立正常血糖。进行静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)以确认体内葡萄糖依赖性胰岛素释放。如图6F所示，注入的右旋糖溶液导致前20min内BGL立即增加，这促进了胰岛素向血液中的释放，这已通过ELISA结果验证。在实验过程中，通过测量血液中的猪C肽水平证明了内源性猪胰岛素可以忽略不计。此外，当BGL恢复至血糖正常时进行第二次IVGTT，并且随着BGL的增加，它还可以导致血清胰岛素水平的增加(图7)，表明GR-MN可以实现持续的葡萄糖响应。使用H&E染色的组织学图像表明，在施用MN后发生了有限的急性炎症。
胰高血糖素递送
通过调节DMAEA与3APBA的比例，还可以利用当前系统用于葡萄糖响应胰高血糖素的输送以治疗低血糖，这要求在降血糖条件下快速释放胰高血糖素。当葡萄糖浓度低于PBA浓度时，一个葡萄糖分子可以与两个PBA分子反应形成双络合，导致DMAEA与3APBA的比例为0:10的聚合物基质收缩。如图8所示，在低血糖状态下(50mg/dL)，胰高血糖素的释放速率快，而在正常血糖(100mg/dL)和高血糖条件下(200和400mg/dL)，胰高血糖素的释放速率低。可以使用用于生物医学应用的相同方法将这种聚合物基质与微针贴片整合。
讨论
已经开发了基于MN的透皮胰岛素技术，可为糖尿病患者提供连续、方便且无痛的治疗。葡萄糖响应制剂的进一步整合具有改善BGL调节的巨大希望。然而，这种胰岛素贴片临床使用转化的一个瓶颈涉及的胰岛素的有限负载能力。为此，开发了这种智能胰岛素贴片，其具有由PBA基团组成的整个聚合物基质作为葡萄糖响应部分，而不是在其中嵌入诸如纳米颗粒的葡萄糖响应制剂。基于原位光聚合策略的MN制造过程既简便又高效，同时避免使用有机溶剂和高温来维持胰岛素的生物活性。体内研究证实，贴片中载有的胰岛素的生物活性可以在室温下保持8周以上。
调整带正电荷的单元(DMAEA)和带负电荷的单元(3APBA)的比例，以得到具有显著葡萄糖依赖性胰岛素释放曲线的优化产品。在STZ诱导的糖尿病小鼠中进行的体内实验表明，GR-MN贴片长时间提供BGL的葡萄糖响应调节，而没有低血糖的风险。IPGTT结果表明，葡萄糖激发可以触发GR-MN快速释放胰岛素。基于在糖尿病小鼠模型中的有希望的结果，对具有CGMS的糖尿病小型猪进行了一系列研究。结果表明，在正常喂养条件下，GR-MN能够将小型猪BGL维持在接近正常范围的时间超过20小时。静脉输注右旋糖溶液引起的BGL升高，可促进GR-MN大量释放胰岛素。此外，重复的IVGTT显示GR-MN具有对多轮葡萄糖激发的BGL变化进行快速响应的能力。
由于GR-MN的交联聚合物基质是不可降解的，因此贴片可以在治疗后从皮肤上完全去除。与会引起与异物对沉积的针尖材料的响应有关的安全问题的可溶解的MN不同，精心设计的GR-MN显示出与皮肤组织的良好生物相容性。这是在具有透皮装置的大型糖尿病动物模型中葡萄糖响应行为的首次证明。在这项研究中开发的GR-MN贴片还提供了一种新的平台技术，用于开发刺激响应的透皮药物递送系统，从而以智能和简单的方式治疗其他疾病。
材料和方法
材料。
除非另有说明，所有化学品均购自Sigma-Aldrich，并在收到时使用。诺兰光学胶粘剂81(NOA 81)购自Norland Products,Inc。3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸购自美国BoronMolecular公司。采用微孔纳米纯净化系统(电阻率大于18.2MΩcm-1)制备去离子水。
葡萄糖响应微针(GR-MN)和非响应交联微针(CR-MN)的制备。
GR-MN贴片是在紫外线照射下通过原位聚合制备的。首先通过将丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(DMAEA)和3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸(3APBA)按一定比例溶于含有二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA，0.5mol％)的N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)单体液体中作为交联剂和Irgacure2959(1mol％)作为光引发剂制备具有光引发剂的液体单体。然后，通过移液管将预载有胰岛素的单体(20wt％)直接沉积在MN模具表面上。然后将模具在真空下放置10min，以使液体填充到微针模具中。除去多余的溶液后，将模具放在4℃的UV灯(100W，365nm，Blak-Ray，美国)下放置20min，以引发光聚合。之后，将可UV固化的基础材料(NOA 81)添加到模具中，并在UV灯下进一步固化10min，以形成贴片的基底。将所得的贴片从模具中小心分离，并在室温下储存在密封的六孔容器中以备进一步研究。CR-MN以相似的方法制备，但未添加DMAEA和3APBA。
使用1型糖尿病小鼠的体内研究。
以链脲佐菌素(STZ)诱导的成年糖尿病小鼠(雄性C57B6，美国Jackson实验室)为研究对象，评价葡萄糖响应胰岛素贴片用于治疗糖尿病的体内疗效。使用Clarity GL2Plus血糖仪测量小鼠的尾静脉血样(约3μL)中的血浆等效葡萄糖。用于小鼠的贴片具有11×11的金字塔形微针阵列，底侧为300μm，高度为700μm。选择每组五只小鼠用CR-MN或载有人重组胰岛素的GR-MN经皮处理(胰岛素剂量：每只小鼠0.5mg)。随时间监测每只小鼠的葡萄糖水平。为了测量体内血浆胰岛素浓度，在指定的时间点从小鼠的尾静脉采集25μL血液样本。分离血清并在-20℃下保存直至测定。根据制造商的方案(Invitrogen，美国.)使用人胰岛素ELISA试剂盒测量血浆胰岛素浓度。
进行腹膜内葡萄糖耐量试验，以证实在交联的MN和葡萄糖响应MN施用后4h，MN的体内葡萄糖响应。简而言之，给小鼠施用CR-MN和GR-MN，然后以1.5g/kg的剂量将PBS中的葡萄糖溶液腹膜内注射到所有小鼠中。注射后随时间监测葡萄糖水平。健康小鼠的葡萄糖耐量试验用作对照。为了验证体内IPGTT促进了胰岛素的释放，在GR-MN贴片施用后4h给予高葡萄糖剂量(3g/kg)。监测葡萄糖水平，并在指定的时间点从小鼠的尾静脉抽取25μL血液样品。分离血清并在-20℃下保存直至测定。使用人胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia，美国)测量血浆胰岛素浓度。使用STZ诱导的糖尿病小型猪的体内研究。
使用三只雄性哥廷根小型猪(Marshall BioResources，美国)，年龄为6个月。通过STZ输注(150mg/kg)在小型猪中诱发糖尿病。恢复七天后，通过使用连续血糖监测系统(CGMS，Dexcom，美国)监测血糖水平，证实成功建立1型糖尿病模型。所有小型猪(体重：25kg-30kg)在施用前禁食过夜。小型猪在腿部部位用CR-MN和GR-MN经皮处理，每只猪的胰岛素剂量为7mg。用于小型猪的贴片具有20×20的金字塔形微针阵列，底侧为400μm，高度为900μm。使用CGMS连续监测血糖水平，实验期间通常每天提供两餐。
对糖尿病猪进行了口服葡萄糖耐量试验，以评估MN贴片的葡萄糖响应。所有小型猪施用前禁食过夜。小型猪在腿部部位用CR-MN和GR-MN经皮处理，每只猪的胰岛素剂量为7mg。在治疗后4h将葡萄糖溶液以1g/kg的剂量口服施用到小型猪。使用CGMS连续监测血糖水平。
进一步进行静脉葡萄糖耐量试验以证实血糖促进的胰岛素从MN的释放。禁食过夜后，对三只糖尿病猪进行GR-MN的经皮处理。在处理后4h，以0.7g/kg的剂量将右旋糖溶液(5wt％)以1L/h的速率静脉内输注到猪中。在指定的时间点从颈静脉收集血液以使用Clarity GL2Plus血糖仪测量血糖，然后使用血清分离管(BD)分离血清。使用人胰岛素ELISA试剂盒测定血清胰岛素水平，并根据制造商的方案(Mercodia，美国)使用猪C肽ELISA试剂盒测量猪C肽水平。
统计分析。
所有结果均为平均值±标准偏差。采用学生t检验进行统计分析。在p值<0.05的情况下，实验组与对照组之间的差异具有统计学意义。
机械强度测试。
通过将MN压在不锈钢板上，测定微针(MN)的机械强度。MN尖与不锈钢板之间的初始距离设置为2.00mm，称重传感器容量为10.00N。顶部不锈钢板向MN移动的速度为0.1mm/s。当针开始弯曲时，记录MN的破坏力。
体外葡萄糖结合研究。
将样品在具有各种葡萄糖浓度(50mg/dL，100mg/dL和400mg/dL)的1mL PBS溶液(NaCl，137mM；KCl，2.7mM；Na2HPO4，10mM；KH2PO4，2mM；pH 7.4)中在37℃下孵育4h。除去样品后，使用Clarity GL2Plus血糖仪(Clarity Diagnostics，Boca Raton，Florida)测量溶液中的葡萄糖残留量。使用葡萄糖标准曲线校准浓度。
体外释放研究。
为了评估葡萄糖响应基质的葡萄糖响应，将样品在具有各种葡萄糖浓度(0mg/dL，100mg/dL和400mg/dL)的1mL PBS溶液中在37℃孵育。在预定的时间点，去除50μL培养基，并使用Coomassie Plus蛋白测定法测定释放的胰岛素量。在Infinite 200PRO多模式酶标仪(Tecan Group Ltd，瑞士)上在595nm处检测吸光度，并用胰岛素标准曲线校准胰岛素含量。为了测试适应葡萄糖水平周期性变化的能力，首先将样品在含有100mg/dL葡萄糖的PBS缓冲液中孵育15min。此时，将样品移出，随后在含有400mg/dL葡萄糖的PBS缓冲液中再孵育15min。将该循环重复几次。使用与上述相同的方法测量释放的胰岛素。
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Claims (10)

1.一种包含载有胰岛素的共聚物的微针贴片；其中所述胰岛素在高血糖环境中从所述微针中解离。
2.根据权利要求1所述的微针贴片，其中所述共聚物包含单体，所述单体包含N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、聚乙烯醇(PVA)或丙烯酸甲酯PVA(m-PVA)、丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(DMAEA)、3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸(3APBA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯和/或4-(溴乙基)苯基硼酸。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的微针贴片，其中所述共聚物进一步包含并入所述微针中的交联所述载有胰岛素的聚合物的交联剂；并且其中所述交联剂选自由乙二醇、聚乙烯醇(PVA)、丙烯酸甲酯PVA(m-PVA)、亚甲基双丙烯酰胺、聚(乙二醇)二丙烯酸酯和二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)组成的组。
4.根据权利要求3所述的微针贴片，其中所述交联剂包含EGDMA。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的微针贴片，其中所述共聚物包含聚(N-乙烯基吡咯烷酮-共聚-2-(二甲基氨基)丙烯酸乙酯-共聚-3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸。
6.一种自调节胰岛素递送系统，其包含根据权利要求1-5中任一项所述的微针贴片。
7.一种治疗受试者高血糖的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-5中任一项所述的微针贴片。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述高血糖是糖尿病的症状。
9.一种治疗受试者糖尿病的方法，其包括向所述受试者施用包含载有胰岛素的共聚物的微针贴片；其中所述共聚物包含N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、聚乙烯醇(PVA)或丙烯酸甲酯PVA(m-PVA)、丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯(DMAEA)、3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸(3APBA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯和/或4-(溴乙基)苯基硼酸；其中所述共聚物进一步包含胰岛素；并且其中所述胰岛素在高血糖环境中从所述微针中解离。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述共聚物包含聚(N-乙烯基吡咯烷酮-共聚-2-(二甲基氨基)丙烯酸乙酯-共聚-3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸。
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