CN112899343A - 一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品 - Google Patents

一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品,由以下成分组成:缓冲液、稳定剂、氯化钾、谷胱甘肽还原酶、表面活性剂、防腐剂。该校准品是稳定性强、均一性好、准确度高、有效期长的液体校准品。

Description

一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域,特别是涉及一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品。
背景技术
谷胱甘肽还原酶(GR)是一种黄素蛋白氧化还原酶,GR是抗氧化损伤防御机制,由辅酶NADPH供氢,催化氧化型谷胱甘肽(GSSG),生成还原型谷胱甘肽(GSH)。还原型谷胱甘肽(GSH)可使含巯基(-SH)的酶处于还原状态及活性状态,维持红细胞膜的完整性,防止血红蛋白氧化。GR在机体内活性强弱,依次为肝、肾、胰、心、甲状腺、红细胞和血浆。GR定位于微粒体及细胞液部分。因各脏器的组织细胞普遍含有GR,因而GR在机体氧化还原反应中起了举足轻重的地位。
在正常机体代谢过程中,机体存在有效的抗氧化防御系统,不断产生的氧自由基在抗氧化系统的作用下不断地被清除,从而维持生理水平的浓度。抗氧化系统包括细胞内抗氧化酶系统和非酶性的抗氧化剂,其中最主要的是谷胱甘肽抗氧化物酶系统。谷胱甘肽抗氧化物酶系统主要包括谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(GPX),谷胱甘肽还原酶(GR),谷胱甘肽巯基转移酶(GST)。谷胱甘肽是人类细胞中自然合成的,主要在肝内合成,由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的小分子三肽化合物,是细胞内主要的非蛋白质巯基化合物,在许多生命活动包括基因表达调控、酶活性和代谢调节、对细胞的保护、氨基酸转运、免疫功能调节等起着直接或间接的作用。在细胞内正常环境下以硫醇还原(GSH)存在,还原型是其主要的活性状态,大约占 95%;氧化型谷胱甘肽(GSSG)是非活性状态,约占1%。内源性GSH主要存在于胞浆内,GSH含有的巯基是其发挥主要作用的基团,由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶催化合成。氧化应激或亲电化合物攻击可使细胞内GSH含量下降,或使其转变为双硫氧化性(GSSG)。GR是一种黄素蛋白氧化还原酶,以还原性辅酶Ⅱ为供氢体,能催化GSSG还原成GSH,对于维持生物体GSH和GSSG比的稳定、保持体内氧自由基平衡起着重要作用。
为了保证检测结果的准确性,谷胱甘肽还原酶(GR)校准品质控品发挥重要作用,而校准品质控品中谷胱甘肽还原酶 (GR)的稳定性成为重点,谷胱甘肽还原酶 (GR)酶稳定性受时间和贮存温度等多种因素的影响。目前市场上的谷胱甘肽还原酶校准品主要是冻干品,冻干过程中谷胱甘肽还原酶的分子结构容易遭到破坏,影响酶活,而且冻干品复溶比较麻烦,复溶过程中,水质差异及人为操作误差可能导致校准品复溶后的浓度与靶值有偏差,从而造成临床检测结果的不准确,复溶后的校准品不易保存,保存时间短。而液态酶在温度升高的情况下,如果酶不稳定会出现酶活降低,甚至会产生絮凝、沉淀及酸变的现象。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种稳定的谷胱甘肽还原酶校准品,该校准品是稳定性强、均一性好、准确度高、有效期长的液体校准品。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品由以下成分组成:
缓冲液 0-200mM
稳定剂 1-20g/L
氯化钾 0.5-1 mM
谷胱甘肽还原酶 0-1KU
表面活性剂 0.1-10g/L
防腐剂 0.1-10g/L。
优选地,所述校准品的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的任一种。
优选地,所述校准品的pH为6.0-8.0.
优选地,所述校准品中的稳定剂为黄原胶、右旋糖酐、4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)和叶酸,且质量比为1-2:2-3:2-3:1-2。
优选地,所述校准品的表面活性剂为非离子型Surfynol表面活性剂,更优选的Surfynol 465、Surfynol 485和Surfynol 104E一种或多种。
优选地,所述试剂校准品中的防腐剂为尼泊金酯类。
优选地,所述试剂校准品中的防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯中的一种或多种。
上述所述的谷胱甘肽还原酶校准品制备方法,包括以下步骤:先加入缓冲液、氯化钾、稳定剂、防腐剂和表面活性剂,用盐酸或氢氧化钠调节pH,pH值调节为6.0-8.0,再加入谷胱甘肽还原酶,制成谷胱甘肽还原酶校准品。
有益效果:
1、本发明校准品不用冻干,有效避免冻干过程对谷胱甘肽还原酶的分子结构的破坏,使用时也无需复溶,减少了复溶过程中可能出现的不可控因素,使得临床检测结果更为准确。
2、通过在校准品中加入黄原胶、右旋糖酐、叶酸、4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)组成复合稳定剂,各组分协同作用保护谷胱甘肽还原酶,有效地增强了校准品的稳定性。
3、本发明校准品添加非离子型Surfynol表面活性剂,Surfynol表面活性剂与经典的表面活性剂相比,降低溶液表面张力和增溶效果更好,从而获得均一的分散体系,有利于校准品均一性的提高。
4、本发明校准品添加尼泊金酯类防腐剂,尼泊金酯类防腐剂为广谱型防腐剂,对多种微生物作用,在pH 6.0-8.0性能稳定,防腐效果好,进一步提高了校准品的稳定性,延长了校准品的有效期限。
5、本发明制备的谷胱甘肽还原酶校准品稳定性好、均一性好、准确度高、有效期长,液体产品在2~8℃条件下可保存两年,37℃可保存两周,明显优于市售的同类型产品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明:
实施例1
一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品:
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 200mmol/L
黄原胶 1g/L
右旋糖酐 3g/L
4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA) 3g/L
叶酸 2g/L
氯化钾 0.5mmol/L
Surfynol 465 1g/L
对羟基苯甲酸甲酯 1g/L
谷胱甘肽还原酶 0.061KU/L
校准品pH值为6.0。
实施例2
一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品:
HEPES缓冲液 100mmol/L
黄原胶 1g/L
右旋糖酐 2g/L
4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA) 2g/L
叶酸 1g/L
氯化钾 0.5mmol/L
Surfynol 485 1g/L
对羟基苯甲酸乙酯 1g/L
谷胱甘肽还原酶 0.032KU/L
校准品pH值为6.5。
实施例3
一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品:
HEPES缓冲液 200mmol/L
黄原胶 1g/L
右旋糖酐 3g/L
4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA) 3g/L
叶酸 2g/L
氯化钾 1mmol/L
Surfynol 485 1g/L
对羟基苯甲酸乙酯 1g/L
谷胱甘肽还原酶 0.162KU/L
校准品pH值为7.0。
对比例1
朗道谷胱甘肽还原酶校准品。
对比例2
与实施例1中谷胱甘肽还原酶校准品的区别仅在于稳定剂不含黄原胶,其它与实施例1相同。
对比例3
与实施例1中谷胱甘肽还原酶校准品的区别仅在于稳定剂不含右旋糖酐,其它与实施例1相同。
对比例4
与实例1中谷胱甘肽还原酶校准品的区别仅在于稳定剂不含4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA),其它与实施例1相同。
对比例5
与实施例1中谷胱甘肽还原酶校准品的区别仅在于稳定剂不含叶酸,其它与实施例1相同。
对比例6
与实施例1中谷胱甘肽还原酶校准品的区别仅在于不含有Surfynol表面活性剂,其它与实施例1相同。
对比例7
与实施例1中谷胱甘肽还原酶校准品的区别仅在于不含有Surfynol表面活性剂,而含有等量的Tween-20,其它与实施例1相同。
对比例8
与实施例1中谷胱甘肽还原酶校准品的区别仅在于不含有防腐剂对羟基苯甲酸甲酯,其它与实施例1相同。
性能验证
Figure 261115DEST_PATH_IMAGE001
………………………………(1)
Figure 614736DEST_PATH_IMAGE002
………………………………………(2)
Figure 553874DEST_PATH_IMAGE003
……………………(3)
Figure 283932DEST_PATH_IMAGE004
……………………(4)
1、准确度验证
对实施例所得到的谷胱甘肽还原酶校准品进行准确度验证。
用朗道谷胱甘肽还原酶测定试剂及配套校准品对制备好的校准品进行测定。
表1 实施例2和实施例3校准品测定结果
Figure 780509DEST_PATH_IMAGE005
将实施例30.5U/L的校准品和160.8U/L的校准品按照表2的方法进行混合,获得6个稀释浓度,用在售的朗道谷胱甘肽还原酶测定试剂及配套校准品,对其进行检测。检测方法:每个浓度校准品重复测试3次,按照公式(1)和(2)计算测定结果均值与理论值的偏差。校准品的检测值(M)与理论值(T)的相对偏差(B)应不超±5%。
表2 校准品稀释表
Figure 367348DEST_PATH_IMAGE006
表3谷胱甘肽还原酶校准品准确度验证结果(U/L)
Figure 387256DEST_PATH_IMAGE007
由验证结果可知,所制备的谷胱甘肽还原酶校准品准确度满足要求。
2、均一性验证
对实施例所得到的谷胱甘肽还原酶校准品的均一性验证过程及结果如下:取谷胱甘肽还原酶校准品准确度验证过程中获得的不同浓度的校准品和对比例6、7制成的校准品,分别连续测试10次,按照公式(1)(3)计算测试结果的平均值和标准差(SD);按照公式(4)计算瓶内均一性 (CV瓶内),CV瓶内应≤5%,检测结果见表4。
表4谷胱甘肽还原酶校准品的均一性验证结果
Figure 530793DEST_PATH_IMAGE008
由检测数据可知,由实施例制备的校准品瓶内均一性(CV瓶内)在5%以内,满足检测的要求,而对比例6制备的校准品,由于Surfynol表面活性剂的缺失,导致校准品CV瓶内为6.37%,大于5%,校准品体系均一性不好,对比例7制备的校准品由于Tween-20的添加CV瓶内虽然有所降低,但不如Surfynol表面活性剂效果好,因此Surfynol表面活性剂对光谷甘肽还原酶校准品体系的均一稳定有重要作用。
3、对实施例和对比例所得到的谷胱甘肽还原酶校准品的稳定性验证过程及结果如下:
(1)37℃加速稳定性
检测方法:在密闭前提下,将实施例1、3和对比例制备的谷胱甘肽还原酶校准品,放入37℃恒温培养箱中,第0天、第3天、第5天、第7天、第9天、第12天、第14天分别进行检测5次,取平均值,按照公式(2)计算平均值与标示值的相对偏差,相对偏差应不大于±10%。结果见表5。
表5谷胱甘肽还原酶校准品37℃加速稳定性验证结果(U/L)
Figure 585337DEST_PATH_IMAGE009
(2)效期稳定性
检测方法:在密闭前提下,将制备好的谷胱甘肽还原酶校准品置于2-8℃条件下保存,第0个月、第3个月、第6个月、第9个月、第12个月、第15个月、第24个月分别进行检测5次,取平均值,按照公式(2)计算检测结果平均值与标示值的相对偏差,相对偏差应不大于±10%,结果见表6:
表6 谷胱甘肽还原酶校准品效期稳定性验证结果
Figure 670973DEST_PATH_IMAGE010
综上所述:由黄原胶、右旋糖酐、4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA) 、叶酸组成的复合稳定剂比单一稳定剂的稳定效果好,对谷胱甘肽还原酶有协同保护作用。添加的尼泊金酯类防腐剂能防止体系内微生物生长,对校准品稳定性增强和有效期的延长有重要作用。因此本发明制备的谷胱甘肽还原酶测定试剂的校准品,校准品在无需冻干的情况下也具有很好的稳定效果,校准品在在2℃~8℃密闭条件下保存可稳定2年,存储有效期长。本发明提供的稳定的谷胱甘肽还原酶校准品适于工业化大规模生产,解决校准品保存不稳定的困难,同时降低了生产成本。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代,但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (9)

1.一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品,由以下成分组成:
缓冲液 0-200mM
稳定剂 1-20g/L
氯化钾 0.5-1 mM
谷胱甘肽还原酶 0-1KU
表面活性剂 0.1-10g/L
防腐剂 0.1-10g/L。
2.根据权利要求1所述的一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品,其特征在于,所述校准品的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的任一种。
3.根据权利要求1所述的一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品,其特征在于,所述校准品的pH为6.0-8.0。
4.根据权利要求1所述的一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品,其特征在于,所述校准品中的稳定剂由黄原胶、右旋糖酐、4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)和叶酸组成,且质量比为1-2:2-3:2-3:1-2。
5.根据权利要求1所述的一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品,其特征在于,所述的表面活性剂为非离子型Surfynol表面活性剂。
6.根据权利要求5所述的一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品,其特征在于,所述的表面活性剂为Surfynol 465、Surfynol 485和Surfynol 104E中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品,其特征在于,所述的防腐剂为尼泊金酯类。
8.根据权利要求1所述的一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品,其特征在于,所述的防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的一种或多种。
9.一种权利要求1-8之一所述的一种稳定的液体谷胱甘肽还原酶校准品的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:先加入缓冲液、氯化钾、稳定剂、防腐剂和表面活性剂,用盐酸或氢氧化钠调节pH,pH值调节为6.0-8.0,再加入谷胱甘肽还原酶,制成谷胱甘肽还原酶校准品。
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