CN112899227B - 一种调控辅助性t细胞功能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫技术领域，研究了一种调控辅助性T细胞CTLA‑4表达水平的新方法，通过在CD4+辅助性T细胞中过表达Th1，Th17型转录因子，研究这些转录因子对CD4+辅助性T细胞的CTLA‑4水平的调控的能力，而后进一步通过敲除实验确认目标转录因子对于CTLA‑4的调控功能，并通过比较野生型CD4+T细胞与敲除目标转录因子的细胞，确定其对CD4+辅助性T细胞增殖能力的影响。本发明上述研究为干预T细胞功能提供了新的可能。

Description

一种调控辅助性T细胞功能的方法
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，更具体地，涉及一种调控辅助性T细胞功能的方法。
背景技术
CTLA-4(Cytotoxic T lymphocytes associated protein 4)，全称为细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，也称CD152，是属于免疫球蛋白超家族CD28家族的抑制性受体，主要表达于活化T细胞及调节性T细胞表面。
CTLA-4最先由Jean-Francois Brunet和Pierre Golstein在活化的CD8+T细胞基因组中发现并命名。CTLA-4与CD28的结构具有一定保守性，CTLA-4可以结合B7配体，且其亲和力比CD28更高。此后，研究人员发现，可溶性的CTLA-4可以强烈抑制T细胞的增殖。JamesP.Allison和Jeff Bluestone分别发表论文，提出了CTLA-4具有与CD28相反的抑制性功能。该功能在Arlene H.Sharpe构建了CTLA-4的基因敲除小鼠后得到了证实。缺乏CTLA-4的小鼠会自发严重的自身免疫性疾病，并于几周内死亡，这有力的证明了CTLA-4具有免疫抑制功能。CTLA-4作为重要的免疫抑制性分子，若机体内缺乏会导致T细胞过度活化产生自发炎症，这一点在敲除小鼠中得到了证明。小鼠全身敲除CTLA-4后，会导致自发性的严重炎症反应，小鼠淋巴结肿大，各器官均有不同程度的炎症淋巴细胞浸润，并且会在几周内死亡。CTLA-4在人体中也起着同样的作用。2014年Kuehn等发表文献，报道了六位在CTLA-4基因的一个拷贝上发生了突变的病人，他们具有过度的免疫反应，身体器官中也存在炎症细胞浸润，显示CTLA-4在人体中也起着重要的免疫抑制作用。同时Desirée Schubert等也发表文献证实CTLA-4突变会引起病人的自发性免疫疾病。
此外，CTLA-4作为肿瘤免疫中重要的免疫检查点(checkpoint)分子，在抗肿瘤治疗中也是重要的靶点。而基于免疫检查点对于肿瘤进行免疫治疗的概念也在2019年获得了诺贝尔奖。FDA于2011年批准了百时美施贵宝公司开发的人源化CTLA-4单克隆抗体易普利姆玛(Ipilimumab)作为黑色素瘤的临床治疗药品。其作用机制主要是能够阻断帮助肿瘤逃避免疫检查的信号通路。它可以结合T细胞表面的CTLA-4，使其不能传递抑制信号，从而改变肿瘤的免疫抑制状态，使T细胞对肿瘤发动攻击。
因此，调控T细胞表面的CTLA-4表达水平，可能通过CTLA-4的抑制功能来调控T细胞的活化增殖等一系列功能活动，进而对T细胞功能进行干预。
CD4+幼稚型T(
Figure BDA0002898064490000011
T)细胞具备分化为若干不同的亚群的能力。辅助T(T helper，Th)细胞来说，其谱系定性(lineage commitment)主要由其在活化时暴露的细胞因子环境所决定，不同的细胞因子信号可在早期激活不同谱系的主调控转录因子的表达，而主调控转录因子则进一步激活或抑制谱系相关特征基因的表达，从而完成细胞谱系的决定过程。Th细胞主要可以分化为Th1、Th2、Th17和滤泡辅助T细胞(Follicular T helper，Tfh)几个亚群。其中Th1细胞可在白介素12(IL-12)和γ干扰素(IFN-γ)细胞因子存在的情况下分化形成，其主调控因子为T-bet；Th2细胞可在有白介素4(IL-4)的条件下分化形成，其主调控因子则为GATA3；Th17细胞需要在转化生长因子(TGF-β)，白介素6(IL-6)的信号刺激下形成，Th17的主调控因子为RORγt；而Tfh的分化则需要IL-21信号，其重要的转录调控因子为Bcl-6。Th细胞亚群在其主调控因子的作用下，表达各自不同的细胞因子，它们可在免疫反应中发挥不同的作用。Th1细胞特征性细胞因子为IFN-γ，主要介导细胞免疫，参与杀灭胞内病原体，介导迟发型超敏反应，同时也是引起移植排异和自身免疫性疾病的主要原因；Th2细胞主要表达IL-4、IL-5、IL-13，主要参与体液免疫，抵御寄生虫等胞外病原体，参与速发型超敏反应，是引起多种变态反应性过敏疾病的原因；Th17细胞作为较新发现的细胞亚群，主要表达IL-17A，IL-17F，IL-22等细胞因子；Th17细胞被发现与多种疾病相关，除类风湿关节炎，系统性红斑狼疮、多发性硬化症等自身免疫疾病外，Th17细胞还与很多皮肤、黏膜、肠道等组织或器官的细菌真菌感染等相关。而Tfh细胞则主要通过辅助B细胞来发挥作用，通过在生发中心区域与B细胞相互作用，Tfh细胞可以促进记忆性B细胞的形成和分泌抗体的浆细胞的抗体类别转换及其分化与成熟；有报道指出，在辅助性T细胞亚群中，Th1细胞较之Th17细胞，其CTLA-4的表达水平更低，因此Th1及Th17细胞亚群的特征性转录因子很可能是CTLA-4的重要调控因素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述技术问题，首先提供一种非治疗目的调控辅助性T细胞CTLA-4表达水平的方法。
在此基础上，本发明还提供上述方面在非治疗目的调控T细胞增殖方面的应用。
本发明还提供一种用于调控T细胞活化增殖的功能产品。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
用于调控T细胞活化增殖的功能产品，所述功能产品能够：
(1)用于调控辅助性T细胞表面的CTLA-4的表达水平，或，
(2)用于调控Th1或Th17型转录因子在T细胞中的表达水平。
本发明结合CTLA-4的免疫抑制作用和辅助型T细胞的不同亚型的作用，推测Th1及Th17细胞亚群的特征性转录因子很可能是CTLA-4的重要调控因素，考虑到，在Th1，Th17及T-bet+Th17亚群形成过程中，主要有三种转录因子起决定性作用：Th1的主调控因子T-bet；Th17的主调控因子RORγt；以及可以直接调控RORγt表达并能够促进T-bet+Th17细胞形成的转录因子。因此后续研究了这些转录因子对CD4+辅助性T细胞的CTLA-4水平的调控的能力，而后进一步通过敲除实验确认目标转录因子对于CTLA-4的调控功能，并通过比较野生型CD4+T细胞与敲除目标转录因子的细胞，确定其对CD4+辅助性T细胞增殖能力的影响。
因此，优选的，所述T细胞为CD4+T细胞。
因此，优选的，所述Th1型转录因子为T-bet，所述Th17型转录因子为RORγt。
因此，优选的，所述功能产品能过表达T-bet和/或RORγt在CD4+T细胞中的表达水平。
通过调控T细胞增殖，从而干预T细胞的功能，因此，本发明还提供所述的功能产品在制备干预T细胞功能的药剂方面的应用。
本发明还提供一种非治疗目的调控辅助性T细胞CTLA-4表达水平的方法，是在CD4+辅助性T细胞中过表达Th1或Th17型转录因子。
优选的，所述Th1型转录因子为T-bet，所述Th17型转录因子为RORγt。
本发明还提供上述方法在非治疗目的调控T细胞增殖方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明研究了一种调控辅助性T细胞CTLA-4表达水平的新方法，通过在CD4+辅助性T细胞中过表达Th1，Th17型转录因子，研究这些转录因子对CD4+辅助性T细胞的CTLA-4水平的调控的能力，而后进一步通过敲除实验确认目标转录因子对于CTLA-4的调控功能，并通过比较野生型CD4+T细胞与敲除目标转录因子的细胞，确定其对CD4+辅助性T细胞增殖能力的影响。本发明上述研究为干预T细胞功能提供了新的可能。
附图说明
图1为外源性表达T-bet对CD4+T细胞中CTLA-4蛋白和mRNA水平的影响，其中图1A为流式分析显示各转录因子逆转录病毒外源性表达后CTLA-4的表达强度，从左到右依次为空白对照(黑色线条)、T-bet逆转录病毒载体(红色线条)、RunX1逆转录病毒载体(橙色)、RORγt逆转录病毒载体(绿色线条)；对照为外源表达后报告基因阴性细胞(灰色)的CTLA-4的强度；图1B统计分析图1A中各组转录因子外源性表达后CTLA-4的相对表达强度的变化(依据报告基因阴性细胞的CTLA-4MFI进行标准化)；图1C统计分析图1A中各组转录因子外源性表达后细胞内CTLA-4 mRNA的水平(-2ΔΔCt法计算，依据报告基因阴性细胞的CTLA-4mRNA进行标准化)；实验结果来源于三次以上独立重复试验，统计使用t检验，“ns”代表没有明显差异，*P﹤0.05，**P﹤0.01，***P﹤0.001；
图2A流式分析显示外源表达的T-bet对于CTLA-4表达的影响，左图为带有报告基因Thy1.1的空载体对照，右图为插入了T-bet的载体；图2B统计分析图2A中对照或T-bet外源性表达后CTLA-4的相对表达强度的变化(依据报告基因阴性细胞的CTLA-4MFI进行标准化)。实验结果来源于三次以上独立重复试验，统计使用t检验，“ns”代表没有明显差异，*P﹤0.05，**P﹤0.01，***P﹤0.001；
图3A流式分析体外活化的CD45.1+CD4+WT T细胞(黑色)和CD45.2+CD4+T-bet敲除T细胞(红色)的CTLA-4表达情况；图3B统计分析图3A中细胞的CTLA-4的平均荧光强度；实验结果来源于四次独立重复试验，用线连接的两个点代表一次实验的结果，统计使用配对t检验，“ns”代表没有明显差异，*P﹤0.05，**P﹤0.01，***P﹤0.001；
图4A显示随时间增加，CD45.1+WT与CD45.2+WT CD4+Tconv对照组混合培养体系中CD45.2+细胞占比几乎不变，而CD45.1+WT与CD45.2+Tbx21-/-CD4+Tconv混合培养体系中CD45.2+细胞的占比减少；图4B显示随时间增加CD45.1+WT与CD45.2+WT CD4+Tconv对照组混合培养体系中CD45.1+和CD45.2+细胞增殖指数相同，而CD45.1+WT与CD45.2+Tbx21-/-CD4+Tconv混合培养体系中CD45.2+细胞增殖指数较低；实验结果来源于三次独立重复试验，统计使用two-way ANOVA检验，“ns”代表没有明显差异，*P﹤0.05，**P﹤0.01，***P﹤0.001。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实验操作：
1、T细胞体外活化培养
1.1、无抗原提呈细胞的CD4+T细胞活化培养
(1)用浓度为2μg/mL anti-CD3抗体(克隆号2C11)及1μg/mL的anti-CD28抗体(克隆号PV1)的PBS包被24孔板，每孔300μL，4℃过夜，加入细胞前弃去孔内的液体。
(2)将富集后的CD4+T细胞重悬于含10％FBS的1640培养基中，1.5×106个细胞每孔，培养基体积为1～2mL，加入100U/mL的rhIL-2。
(3)24～48h后，细胞会明显活化增大，之后则会明显增殖。
1.2、含有抗原提呈细胞的CD4+T细胞活化培养
培养体系中含有抗原提呈细胞，则不再需要anti-CD28抗体提供共刺激信号。因而只需要在培养体系中加入1μg/mL的anti-CD3抗体即可。
2、逆转录病毒包装和感染T细胞
2.1、逆转录病毒包装
(1)逆转录病毒包装细胞系Plat-E细胞消化后计数，以1.5×105细胞每孔铺于6孔板，培养基体积为1.5mL，CO2培养箱37℃培养过夜使细胞贴壁。
(2)第二天，待细胞贴壁，细胞融合度达到70％-80％时，将培养基吸出，换为37℃预热的新鲜DMEM培养基。重新放回37℃培养箱孵育1h。
(3)将4μg的逆转录病毒质粒及1μg的病毒包装质粒加入100μL的opti-MEM培养基中吹匀；另取10μL的转染试剂lipofectamine 2000，同样加入100μL opti-MEM中轻轻吹匀。将二者轻柔的混合均匀，孵育5min。
(4)将孵育好的体系轻柔的加入6孔板的一个孔中，全部样品体系加完之后轻轻晃动，彻底混匀。
(5)转染后4h可以更换新鲜培养基，或第二天培养基变黄时更换新鲜培养基。
(6)48h后收集上清，使用0.45μm滤器过滤，即为包装出的病毒悬液。
2.2、T细胞的逆转录病毒转导
逆转录病毒需要感染处于分裂期的细胞，因此需要预先活化T细胞。T细胞需要在收集病毒的同时活化好，以进行感染实验。
(1)活化CD4+T细胞。
(2)48h后，使用加入了1000×8μg/μL Polybrene的逆转录病毒悬液重悬细胞，并置于24孔板中。
(3)将上述24孔板置于离心机中，室温，1800rpm离心40min。
(4)取出24孔板，置于培养箱中孵育4h，吸出病毒液并换上含有100u/mL rhIL-2的新鲜的1640培养基。
(5)培养48～72h后可流式检测细胞。
(6)培养期间视细胞生长状况，可分孔培养或更换新鲜培养基。
3、细胞流式染色
3.1细胞表面染色
(1)收集细胞样品，每个样品约需2×106个细胞。用FACS液洗细胞，离心去除上清。为防止稀释抗体，需要彻底吸干。
(2)使用FACS液将需要染色的细胞表面分子的荧光素标记抗体稀释到合适的浓度，每个样品加入15μL稀释好的抗体。避光，冰上孵育30min。
(3)用1ml FACS液洗去游离抗体，离心弃去上清。即完成表面染色。
(4)用适量上清悬浮细胞，即可直接进行流式细胞实验。或进一步处理，进行胞内染色。
3.2胞内染色
(1)将完成表面染色的细胞用500μL 4％PFA液重悬，室温固定8min。
(2)加入1ml FACS液洗去固定液，离心去上清。
(3)加入500μL perm液，重悬细胞后离心去除perm液，并彻底吸干残余液体。
(4)使用perm液将CTLA-4分子的荧光素标记抗体稀释至合适浓度；将稀释好的抗体加入已吸干的样品细胞中，每个样品15μL。重悬细胞，避光，冰上孵育40min。
(5)使用perm液洗去游离抗体，离心去除上清。
(6)用适量FACS液重悬细胞，样品即制备完成。
4、实时荧光定量PCR
4.1、Trizol法提取RNA
由于RNA很容易被RNase降解，该实验所用耗材试剂均需为RNase free。
(1)流式分选出的细胞转移至1.5mL EP管中，弹散细胞，加入1mL Trizol试剂迅速剧烈吹打或涡旋，以充分裂解细胞。此时样品可置于-80℃冻存。
(2)Trizol裂解后室温放置5min。1mL Trizol中加入200μL三氯甲烷，剧烈摇晃15s，室温静置3min。然后4℃，12000g离心15min。
(3)取上层液体400～500μL，转移至新的EP管中，加入500μL异丙醇后与室温静置10min。然后4℃，12000g离心10min。
(4)弃去上清，加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，然后4℃，7500g离心5min。
(5)尽量去净乙醇，并在超净台迅速吹干RNA沉淀，加入适量DEPC水溶解RNA样品。
(6)使用NanoDrop测定RNA浓度，并使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。检测后的RNA样品可用于反转录。
4.2、RNA的反转录
(1)根据SUPERSCRIPT III REV TRANSCRIPT反转录酶(Invitrogen，18080044)说明书进行反转录。
(2)使用42℃90min，72℃7min的条件进行反转录。
(3)反转录得到cDNA样品，可于-80℃长期冻存。
4.3、qPCR
本文中的qPCR使用Roche公司的水解探针法完成。
(1)使用Roche公司提供的在线工具Universal ProbeLibrary Assay DesignCenter设计qPCR的引物。
(2)对设计的引物进行特异性及qPCR扩增效率的验证。
(3)qPCR检测所需基因，根据Cp值计算转录基因的相对mRNA水平。
使用的引物：
Ctla4-F：CATCCCAGTCTTCTCTGAAGC；Ctla4-R：ATCAGTGTTGTGTGATGGTGAAT；
Gadph-F：AGCTTGTCATCAACGGGAAG；Gadph-R：TTTGATGTTAGTGGGGTCTCG。
5、CFSE标记
(1)用DMSO溶解CFSE，18μL每管，配称5mM浓度的储液，分装冻存于-20℃冰箱。使用时取出溶解，并用PBS稀释1000倍则可使用。
(2)用PBS重悬T细胞至2×107/ml。
(3)配制与需要标记的细胞悬液体积相等的CFSE工作液。
(4)将细胞悬液与配好的CFSE工作液混合均匀，室温下孵育5min。中间需要颠倒几次以防细胞下沉。
(5)加入与上一步总体积相等的FBS，混匀，室温孵育1min以终止反应。
(6)4℃，2000rpm离心2min，去除上清。
(7)加入2％FBS的DMEM洗涤细胞，离心去除上清。
(8)重复上一步。
(9)用少量PBS再次清洗细胞。
(10)标记好的细胞用1640重悬，则可用于活化增殖培养。
实施例1过表达T-bet对CTLA-4的影响
利用逆转录病毒表达系统在活化的CD4+T细胞中进行了T-bet，RORγt及RunX1的外源性表达，以观察这三种转录因子对CD4+T细胞中CTLA-4表达水平的影响。
结果显示外源性过表达T-bet显著降低了CD4+T细胞的CTLA-4的表达水平，而RORγt和RunX1则对其表达无影响(见图1A、B)。由于转录因子通过调控转录水平来调节基因表达，我们分别分选了外源性过表达这三种转录因子的T细胞，检测CTLA-4的mRNA水平，发现T-bet同样可以在转录水平下调CTLA-4(见图1C)。这些结果证实了致病性Th细胞中表达的Th1型转录因子T-bet具有调控CTLA-4表达水平的功能。
由于CD4+T细胞在活化过程中本身就会表达一定量的T-bet，为排除内源性T-bet的影响，我们在T-bet敲除的CD4+T细胞中进行了外源性T-bet表达实验，同样发现T-bet可以显著下调CTLA-4的表达水平(见图2)。
结果表明：过表达T-bet可在转录和表达水平上下调CTLA-4的表达。
实施例2 T-bet敲除CD4+T细胞的变化
由于CD4+T细胞在活化过程中本身就会表达一定量的T-bet，为排除内源性T-bet的影响，在体外CD3，CD28抗体活化的T-bet敲除CD4+辅助型T细胞中外源性表达转录因子T-bet，而后使用流式细胞术分析其对CTLA-4蛋白水平的影响。
使用CD45.1+的WT小鼠和CD45.2+T-bet敲除的小鼠的CD4+T细胞在体外1：1混合后活化培养72h，而后使用流式细胞术分析两群细胞CTLA-4蛋白水平。
由于CTLA-4的表达水平受TCR活化信号的调控，在同一个活化体系中可以保证两种T细胞接受同样强度的活化信号。T细胞活化过程中会诱导T-bet的表达，在此前提下，我们检测了两种细胞的CTLA-4表达水平。结果显示，T-bet敲除的CD4+T细胞的CTLA-4略高于野生型CD4+T细胞(见图3)。这一结果证实，T细胞内源性的T-bet表达也具备下调CTLA-4的能力。
实施例3 T-bet下调CTLA-4对T细胞的增殖能力影响
为探究CTLA-4水平的改变是否会影响CD4+辅助型T细胞的增殖能力，CD45.1+WTCD4+T细胞和APC细胞与CD45.2+WT或Tbx21-/-CD4+T细胞混合，CFSE标记后，用可溶的CD3抗体活化。
由于CTLA-4的负调控功能会影响T细胞的活化和增殖能力，我们判断T-bet下调CTLA-4很可能会提升T细胞的活化增殖。我们实验中也的确发现，在体外混合培养体系中，可以表达T-bet的WT CD4+Th细胞增殖要快于T-bet敲除细胞(见图4)。

Claims (4)

1.物质A在制备正调控CD45+ T细胞活化增殖的功能产品中的应用，其特征在于，所述物质A为Th1型转录因子T-bet。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述功能产品能过表达T-bet在CD45+ T细胞中的表达水平。
3.一种非治疗目的负调控辅助性T细胞CTLA-4表达水平的方法，其特征在于，在CD45+辅助性T细胞中过表达Th1型转录因子T-bet。
4.权利要求3所述方法在非治疗目的正调控CD45+T细胞增殖方面的应用。
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