CN112899124A - 一种厌氧微生物培养与实时观测装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种厌氧微生物培养与实时观测装置。该装置包括：底座、上盖、微流控芯片和培养液储存室；底座与上盖相互密封扣合，第一凹槽用于容置培养液储存室，第二凹槽用于提供厌氧微生物的培养空间；第三凹槽用于容置微流控芯片，且第三凹槽的水平槽面上开设有第一视窗；第四凹槽相对第二凹槽设置，第五凹槽相对第一凹槽设置；第四凹槽的水平槽面上开设有第二视窗；第一视窗和第二视窗相对设置；培养液储存室上开设有出液孔，上盖的侧壁上开设有气体入口、气体出口和出液口。该装置具有优秀的气密性，能够为厌氧微生物长期稳定的液体培养提供稳定的厌氧气体氛围，气体氛围可控；满足了高通量、大范围多位点采样，高放大倍数拍摄等实验需求。

Description

一种厌氧微生物培养与实时观测装置

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种厌氧微生物培养与实时观测装置。

背景技术

对大量单个细菌细胞进行长时间的跟踪观测已经成为微生物生理研究的重要手段。由于微流控技术具有设计灵活、方便可控、自动化集成、实时分析、单细胞操纵、节约样本与试剂等方面的优点，被应用于多种微生物生理学研究，研究者往往根据自己的科研应用需求，设计相关微流控芯片。而无论芯片设计方式如何，其微尺度的特点使研究者使用一种特制的固定装置(CN112113901A)，即可将其固定，与延时显微成像系统相结合，实现长期间自动对焦拍摄与数据采集。

关于延时成像技术，除了自己设计并搭建一套自动对焦的光学成像系统之外，目前一些高端的科研级商用显微镜在提供高倍油镜的同时，已经集成了延时拍摄系统、高精度电动位移平台、自动对焦系统等(如Nikon ECLIPSE Ti2系列)。此外，一些商用的温控装置可以集成到特定型号的显微镜上，以控制细胞样品周围的温度到设定值。

目前的应用原技术所培养的微生物基本上对气体氛围无特殊要求。然而在自然界中，存在多种对培养气体氛围有严格要求的微生物，特别是许多跟人类健康息息相关的厌氧微生物，但是缺乏针对它们的相关微流控培养与延时成像系统相结合的实验技术。目前尚无同时满足培养气体氛围控制、单细胞微流控技术、延时显微成像技术结合的相关报道。

微流控芯片主要是由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的芯片整体封接在载玻片上，芯片结构主要由一个主通道沟通众多与其垂直相通的子通道，培养基从主通道入口流入，出口流出，通过扩散作用为生长在子通道内的微生物细胞提供营养成分。而由聚二甲基硅氧烷制成的芯片本身有着良好的透气性，这样可以保证一般微生物生长所需氧气。采用此种微流控芯片是直接暴露在空气氛围中进行延时显微成像，无法控制严格的气体氛围，此方法广泛用于一般微生物培养，但是无法满足对气体氛围有特殊要求的微生物，特别是严格厌氧微生物长时间的培养要求。

Finevest,A.等人采用琼脂糖板的固体培养方法针对厌氧微生物培养，具体为：微生物细胞处于载玻片和琼脂糖凝固所形成的平板之间，加上最上方透明盖子通过垫圈密封，装置还包括厌氧混合气的入口和出口。由于此方法使用固体培养基，只可以保证厌氧微生物进行短暂生长，且微生物细胞的生理状态并不稳定，无法像持续灌流的液体培养一样进行长期培养，并保证微生物细胞处于稳定生长状态。然而，液态培养这对于微生物生理学研究是一项很重要的前提指标。尽管该研究所成功培养的脱硫弧菌是一种厌氧菌，但实际上多种厌氧菌仍能在一定氧气浓度(2％～8％)下存活，但是实验表明长期培养下就很难保证厌氧菌的稳态生长(对数生长)，死亡率会大大提高；对于兼性厌氧菌，在低氧时，它们在不同的氧气浓度(比如<0.1％、0.1％～15％、2-10％)下，生理状态有很大不同；其装置设计上的局限性无法达到严格的厌氧程度，且无法实现进一步实现液体培养。

发明内容

基于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种厌氧微生物培养与实时观测装置；本发明的目的还在于提供采用该厌氧微生物培养与实时观测装置进行厌氧微生物实时观测的培养方法。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一方面，本发明一种厌氧微生物培养与实时观测装置，包括：

底座、上盖、微流控芯片和培养液储存室；

所述底座与所述上盖相互密封扣合，所述底座上开设有第一凹槽和第二凹槽；所述第一凹槽用于容置所述培养液储存室，所述第二凹槽用于提供厌氧微生物的培养空间；所述第二凹槽的水平槽面上开设有第三凹槽，所述第三凹槽用于容置所述微流控芯片，且所述第三凹槽的水平槽面上开设有可供采集成像的第一视窗；

所述上盖开设有第四凹槽和第五凹槽；所述第四凹槽相对第二凹槽设置，用于提供厌氧微生物的培养空间；所述第五凹槽相对第一凹槽设置，用于卡合容置所述培养液储存室；所述第四凹槽的水平槽面上开设有可供光源入射的第二视窗；所述第一视窗和所述第二视窗相对设置；

所述培养液储存室上开设有出液孔，其用于通过管道与所述微流控芯片的入口端相连通；所述上盖的侧壁上开设有气体入口、气体出口和出液口，所述出液口用于通过管道与所述微流控芯片的出口端相连通。

本发明的厌氧微生物培养与实时观测装置具有优秀的气密性，其中，培养液储存室和微流控芯片处于严格密封的环境中，通过气体入口和气体出口能够实现该装置中源源不断的特定气体氛围流(例如氮气、二氧化碳等气体)，以实现装置中严格的厌氧环境，保证微流控芯片和培养液储液室中的液体培养基均处于稳定的厌氧气体氛围中；此外该装置还设置的用于光源入射和采集成像的视窗，整合了微流控芯片和延时显微拍摄技术，配合本发明较佳的厌氧气体氛围，能够实现厌氧微生物的长时间(大于200h)的液体培养，并维持细胞生长的稳定状态。本发明的厌氧微生物培养与实时观测装置的气体入口可以设计至少一个以上的气体入口，例如：设计两个气体入口，以备正压通入培养基等的需求；一般使用时，只需一个气体入口，备用的气体入口可以通过密封旋塞或光敏胶予以密封。

本发明的厌氧微生物培养与实时观测装置中的微流控芯片为本领域常规的微流控芯片，其是由载玻片和封接在载玻片上的芯片结构组成，所述芯片结构是由主通道沟通众多与其垂直的子通道，入口端与出口端与其主通道连通。该微流控芯片在组装于本发明的装置中前，已经内置了厌氧微生物的种子液。该微流控芯片能够容置于第三凹槽中，其载玻片的尺寸与第三凹槽的水平槽面尺寸相匹配。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，该装置还包括芯片固定板；

所述芯片固定板用于将所述微流控芯片固定于所述第三凹槽中，且所述芯片固定板上开设有镂空窗口；所述镂空窗口分别与所述第一视窗、所述第二视窗相对设置。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，围绕所述镂空窗口四周的所述芯片固定板上开设有多个第一螺孔，所述第一螺孔的下端设置有第一弹性件，所述第一弹性件的一端与所述第一螺孔边缘的所述芯片固定板相抵接，并通过粘结剂固定；另外一端与所述第三凹槽中的所述微流控芯片相抵接；所述芯片固定板的四周与所述第二凹槽的水平槽面固定。

本发明通过芯片固定板和第一弹性件将微流控芯片的下部的载玻片压紧在第三凹槽底部的第一视窗上面，实现芯片固定板与微流控芯片之间的稳固组装。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述第一螺孔的数目至少为4个，其均匀布设于所述镂空窗口四周的所述芯片固定板上；对应所述第一弹性件的数目至少为4个。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述第一弹性件包括针筒以及可移动地设置在所述针筒内的针头，所述针筒内设有弹簧，所述针头通过所述弹簧能弹性地移动，所述针筒通过所述第一螺孔与所述芯片固定板相抵接，所述针头能弹性地抵接在所述微流控芯片上。

本发明的弹性件为弹簧针组设计，该设计提供了一种均匀且柔和的压紧固定方式，能够有效避免0.1mm以上厚度玻璃片在被压紧固定时发生碎裂。此外，采取此种设计的固定方式能够结合显微镜进行实时培养观察与数据采集，200h内对厌氧微生物单细胞延时显微成像不发生丢失焦距和超过2μm的水平位置偏移。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述芯片固定板的四周开设有多个第二螺孔，围绕所述第三凹槽四周的所述第二凹槽的水平槽面上开设有多个第三螺孔，所述第二螺孔与所述第三螺孔的孔心对应，通过螺钉实现所述芯片固定板与所述第二凹槽的水平槽面的固定连接。所述第三螺孔不贯穿底板。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述第二螺孔的数目至少为4个，均匀布设于所述芯片固定板的四周；对应所述第三螺孔的数目至少为4个。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述第三凹槽的水平槽面四周边缘布设有第一支撑梁，所述第一视窗的四周边缘通过粘结剂与所述第一支撑梁密封固定连接。以保证装置在具有优良的光透性的前提下，同时具有优良的气密性。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述第四凹槽的水平槽面四周边缘布设有第二支撑梁，所述第二视窗的四周边缘通过粘结剂与所述第二支撑梁密封固定连接。以保证装置在具有优良的光透性的前提下，同时具有优良的气密性。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述粘结剂包括光敏胶。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述第一视窗和所述第二视窗包括光透性好的玻璃板或亚力克板。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述第一视窗和所述第二视窗的形状包括矩形、圆形或椭圆形；所述第二视窗的面积大于所述第一视窗的面积。

本发明通过设计透明材质的第一视窗和第二视窗，且第二视窗的面积大于第一视窗的面积，以便于倒置显微镜观察，能够实现明场/相差落射光、激光激发荧光等多种成像模式，满足了落射光照明的需求和高至100倍放大浸油物镜至少100个位点的采样拍摄的需求。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述培养液储存室由储存室本体和储存室上盖构成，所述出液口开设于所述储存室上盖上，连通至所述微流控芯片的入口端的管道经由所述出液口深入至所述培养液储存室的底部。本发明的培养液储存室能够为微流控芯片中的厌氧微生物长期培养提供足够的液体培养基。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述储存室本体和所述储存室上盖分别设置有多个均匀分布且相互对应的螺孔，并通过螺钉实现所述储存室本体与所述储存室上盖的固定连接。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述储存室上盖上还开设至少一个气孔。

本发明气孔的设置能够保证培养液储存室中的液体培养基上部气压与装置中内部的气压相同，便于出液口的负压顺利抽出培养液储存室中的液体培养基，以提供稳定的流速。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述底座与所述上盖相互扣合的接触面边缘分别开设有多个均匀分布且相互对应的螺孔，并通过螺钉实现所述底座与所述上盖的密封扣合。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述底座的接触面的边缘开设有一圈环形凹槽，所述环形凹槽用于容置橡胶圈以实现所述底座与所述上盖的进一步密封。保证装置具有优良的气密性。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述第二凹槽的侧边缘开设有多个第四螺孔，并于所述第二凹槽的外侧边缘布设有多个对应所述第四螺孔的第二弹性件；通过粘结剂实现所述第二弹性件与所述第四螺孔的固定；所述第二弹性件用于与显微镜标准载物台适配并固定。本发明的第二弹性件也可以选自与第一弹性件相同的弹性针组件。

此外，通过改变上盖和底座的外部轮廓尺寸和形状，能够实现与不同种类和型号的电动位移台适配器的匹配，也能实现与不同型号和品牌的显微镜相匹配。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述底座的材质包括铝合金；所述上盖的材质包括树脂；所述培养液储存室的材质包括聚醚醚酮。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述芯片固定板的材质包括铝合金。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述气体入口和所述气体出口均通过螺塞和接头刃环接入外部气体管道(防止漏气)，且所述气体管道上布设有止流阀。设置止流阀能够防止未通入气体时装置漏气。

上述的厌氧微生物培养与实时观测装置中，优选地，所述出液口外接薄膜泵，所述薄膜泵用于提供负压。通过设置薄膜泵能够使培养液储存室中的液体培养基在装置内气压与出液口负压之间压差作用下，能够顺利流经微流控芯片后再流出。

另一方面，本发明还提供一种厌氧微生物实时观测的培养方法，其采用上述的厌氧微生物培养与实时观测装置进行操作，包括以下步骤：

准备内置了厌氧微生物种子液的微流控芯片，所述微流控芯片由载玻片和封接在载玻片上的芯片结构组成，所述芯片结构是由主通道沟通众多与其垂直的子通道，入口端与出口端与其主通道连通；将微控流芯片放置于第三凹槽中，其入口端通过管道与培养液储存室的出液孔相连通；其出口端与上盖侧壁上的出液口相连通；连接好管路后，将上盖与底板扣合并密封固定，完成装置的组装；

将装置架设于显微镜上，并与显微镜载物台适配器固定；通过上盖侧壁上的气体入口通入厌氧微生物特定的气体氛围流，进行厌氧环境下的厌氧微生物的连续培养，调整显微镜光源和物镜位置，进行实时培养成像观察。

本发明的有益效果：

本发明的厌氧微生物培养与实时观测装置具有优秀的气密性，能够为厌氧微生物长期稳定的液体培养提供稳定的厌氧气体氛围，气体氛围可控，实现厌氧微生物的长达200h以上的液体培养，并维持细胞生长的稳定状态；此外，配合本发明的芯片固定板及设计的视窗结构，能够保证长时间延时拍摄不发生丢失焦距和超过2μm的水平位置偏移，同时满足了高通量多位点采样、大范围多位点采样、高放大倍数拍摄等一些列实验需求，提高了实验通量的同时保证了数据质量。

附图说明

在此描述的附图仅用于解释目的，而不意图以任何方式来限制本发明公开的范围。另外，图中的各部件的形状和比例尺寸等仅为示意性的，用于帮助对本发明的理解，并不是具体限定本发明各部件的形状和比例尺寸。本领域的技术人员在本发明的教导下，可以根据具体情况选择各种可能的形状和比例尺寸来实施本发明。

图1为本发明实施例1中的厌氧微生物培养与实时观测装置部分拆解结构示意图(未含有微流控芯片、连接管路、固定螺钉、第二弹性件、橡胶圈等部件)；

图2为本发明实施例1中的厌氧微生物培养与实时观测装置中的底座结构示意图；

图3为本发明实施例1中的厌氧微生物培养与实时观测装置中的上盖结构示意图；

图4为本发明实施例1中的厌氧微生物培养与实时观测装置中的芯片固定板结构示意图；

图5为本发明实施例1中的厌氧微生物培养与实时观测装置中的第一弹性件的组件结构示意图；

图6为本发明实施例1中的厌氧微生物培养与实时观测装置中的培养液储存室的储存室本体结构示意图；

图7为本发明实施例1中的厌氧微生物培养与实时观测装置中的培养液储存室的储存室上盖结构示意图；

图8为本发明实施例1中厌氧微生物培养与实时观测装置中微流控芯片的结构示意图；

图9为本发明实施例2中培养过程显微实际拍摄的明场相差图(A)、有氧培养荧光场图(B)和厌氧培养荧光场图(C)；

图10为本发明实施例3中的进行密封性检测实验的氧气指示剂检测的结果图。

附图符号说明：

1、底座；11、第一凹槽；12、第二凹槽；13、第三凹槽；14、第一视窗；15、环形凹槽；16、第四螺孔；17、螺孔；18、第三螺孔；19、第一支撑梁；2、上盖；21、第五凹槽；22、第四凹槽；23、第二视窗；24、气体入口；25、第二支撑梁；26、螺孔；27、气体出口；28、出液口；3、芯片固定板；31、镂空窗口；32、第二螺孔；33、第一螺孔；34、第一弹性件；341、针头；342、针筒；4、储存室本体；41、螺孔；5、储存室上盖；51、螺孔；52、气孔；53、出液口；61、载玻片；62、主通道；63、子通道；64、入口端；65、出口端。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。在本发明的教导下，技术人员可以构想基于本发明的任意可能的变形，这些都应被视为属于本发明的范围。需要说明的是，当元件被称为“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“上”、“下”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1：

本实施例提供一种厌氧微生物培养与实时观测装置，如图1所示，其包括：

底座1(如图2所示)、上盖2(如图3所示)、微流控芯片、芯片固定板3(如图4所示)和培养液储存室(储存室本体4和储存室上盖5构成，如图6和图7所示)。

底座1与上盖2相互扣合的接触面边缘分别开设有8均匀分布且相互对应的螺孔17和螺孔26，并通过螺钉实现底座1与上盖2的密封扣合；底座1的接触面的边缘开设有一圈环形凹槽15，环形凹槽15用于容置橡胶圈以实现底座1与上盖2的进一步密封，保证装置的气密性。

底座1上开设有第一凹槽11和第二凹槽12；第一凹槽11用于容置培养液储存室，第二凹槽12用于提供厌氧微生物的培养空间；第二凹槽12的水平槽面上开设有第三凹槽13，第三凹槽13用于容置微流控芯片，且第三凹槽13的水平槽面上开设有可供采集成像的第一视窗14。底座1的材质为铝合金，其通过数控机床机械加工而成。

上盖2开设有第四凹槽22和第五凹槽21；第四凹槽22相对第二凹槽12设置，用于提供厌氧微生物的培养空间；第五凹槽21相对第一凹槽11设置，用于卡合容置培养液储存室；第四凹槽22的水平槽面上开设有可供光源入射的第二视窗23；第一视窗14和第二视窗23相对设置。上盖2的材质为树脂，其通过3D树脂打印加工获得。

微流控芯片为本领域常规的微流控芯片，如图8所示，其是由载玻片61和封接在载玻片61上的芯片结构，所述芯片结构是由主通道62沟通众多与其垂直的子通道63，入口端64与出口端65与其主通道62连通；其在组装于本发明的装置中前，已经内置了厌氧微生物的种子液。

芯片固定板3用于将微流控芯片固定于第三凹槽13中，且芯片固定板3开设有镂空窗口31；镂空窗口31分别与第一视窗14、第二视窗23相对设置。芯片固定板3的材质为铝合金，其通过数控机床机械加工而成。

围绕镂空窗口31四周的芯片固定板3上开设有均匀分布的20个第一螺孔33，第一螺孔33的下端设置有20个第一弹性件34的组件(如图5所示)，第一弹性件34包括针筒342以及可移动地设置在针筒342内的针头341，针筒342内设有弹簧，针头341通过弹簧能弹性地移动，针筒342通过第一螺孔33与芯片固定板3相抵接，并通过光敏胶粘结固定，针头341能弹性地抵接在微流控芯片的载玻片61上。

芯片固定板3的四周开设有均匀分布的4个第二螺孔32，围绕第三凹槽13四周的第二凹槽12的水平槽面上开设有与第二螺孔32孔心一一对应的4个第三螺孔18，通过螺钉实现芯片固定板3与第二凹槽12的水平槽面的固定连接。

本发明的弹性件为弹簧针组设计，该设计提供了一种均匀且柔和的压紧固定方式，能够有效避免0.1mm以上厚度玻璃片在被压紧固定时发生碎裂。此外，采取此种设计的固定方式能够结合显微镜进行实时培养观察与数据采集，200h内对厌氧微生物单细胞延时显微成像不发生丢失焦距和超过2μm的水平位置偏移。

第三凹槽13的水平槽面四周边缘布设有第一支撑梁19，第一视窗14的四周边缘通过光敏胶与第一支撑梁19密封固定连接。第四凹槽22的水平槽面四周边缘布设有第二支撑梁25，第二视窗23的四周边缘通过光敏胶与第二支撑梁25密封固定连接。第一视窗14和第二视窗23的材质为光透性好的玻璃板(或亚力克板)，第一视窗14和第二视窗23的形状为矩形，第二视窗23的面积大于所述第一视窗的面积。

本发明通过设计透明材质的第一视窗和第二视窗，且第二视窗的面积大于第一视窗的面积，以便于倒置显微镜观察，能够实现明场/相差落射光、激光激发荧光等多种成像模式，满足了落射光照明的需求和高至100倍放大浸油物镜至少100个位点的采样拍摄的需求。

培养液储存室由储存室本体4和储存室上盖5构成，出液口53开设于储存室上盖5上，连通至微流控芯片的入口端64的管道经由出液口53深入至培养液储存室的底部。储存室本体4和储存室上盖5分别设置有4个均匀分布且相互一一对应的螺孔41和螺孔51，并通过螺钉实现储存室本体4与储存室上盖5的固定连接。储存室上盖5上还开设有4个均匀分布的气孔52。

本发明气孔的设置能够保证培养液储存室中的液体培养基上部气压与装置中内部的气压相同，便于出液口的负压顺利抽出培养液储存室中的液体培养基，以提供稳定的流速。培养液储存室的材质为聚醚醚酮(PEEK)，其是由3D打印机打印制备而成，能够为微流控芯片中的厌氧微生物长期培养提供足够的液体培养基。

上盖2的侧壁上开设有2个气体入口24(其中一个气体入口为备用气体入口，不使用时通过光敏胶密封)、1个气体出口27和1个出液口28，出液口28用于通过管道与微流控芯片的出口端65相连通。气体入口24和气体出口27均通过螺塞和接头刃环接入外部气体细管道，且气体细管道上布设有止流阀。设置止流阀能够防止未通入气体时装置漏气。出液口28外接薄膜泵，薄膜泵用于提供负压，使培养液储存室中的液体培养基在装置内气压与出液口负压之间压差作用下，能够顺利流经微流控芯片后再流出。

第二凹槽12的侧边缘开设有16个第四螺孔16，并于第二凹槽12的外侧边缘布设有16个一一对应第四螺孔16的弹性件(同第一弹性件)；通过光敏胶实现弹性件与第四螺孔16的固定。在第二凹槽侧边缘设置弹性件，能够用于与显微镜标准载物台适配并固定，便于多点延时拍摄。

实施例2：

本实施例提供一种厌氧微生物实时观测培养方法，其采用实施例1的厌氧微生物培养与实时观测装置进行操作，包括以下步骤：

准备内置了厌氧微生物(本实施例采用的为兼性厌氧菌大肠杆菌)种子液的微流控芯片，所述微流控芯片由载玻片和封接在载玻片上的芯片结构组成，所述芯片结构是由主通道沟通众多与其垂直的子通道，入口端与出口端与其主通道连通；将微控流芯片放置于第三凹槽中，其入口端通过管道与培养液储存室的出液孔相连通；其出口端与上盖侧壁上的出液口相连通；连接好管路后，将上盖与底板扣合并密封固定，完成装置的组装；其中，微控流芯片通过芯片固定板及其第一弹性件实现固定。

将装置架设于显微镜上，并与显微镜载物台适配器固定；通过上盖侧壁上的气体入口通入厌氧微生物特定的气体氛围流(95％N₂和5％CO₂)，进行厌氧环境下的厌氧微生物的连续培养，调整显微镜光源和物镜位置，进行实时成像观察。实验结果如图9所示。

由图9可以看出：由于荧光蛋白在0.00005％的氧气浓度下即可受激发产生荧光，而在此装置中培养的微生物所表达的荧光蛋白受激发并无明显荧光(参见图9中的C)，说明微生物细胞周围的氧气浓度极低，达到严格厌氧程度。

实施例3：

本实施针对实施例1的厌氧微生物培养与实时观测装置进行气密性的验证试验，在持续通入气体时，将装置整体置于水中无可见气体泄漏，说明其气密性优秀。

针对厌氧氛围的验证，采用三菱MGC氧气指示剂，实验结果如图10所示。由图10可以直观上看出培养的气体环境中氧气浓度小于0.1％，低于最小检测限。

Claims (23)

1.一种厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于，包括：

底座、上盖、微流控芯片和培养液储存室；

所述底座与所述上盖相互密封扣合，所述底座上开设有第一凹槽和第二凹槽；所述第一凹槽用于容置所述培养液储存室，所述第二凹槽用于提供厌氧微生物的培养空间；所述第二凹槽的水平槽面上开设有第三凹槽，所述第三凹槽用于容置所述微流控芯片，且所述第三凹槽的水平槽面上开设有可供采集成像的第一视窗；

所述上盖开设有第四凹槽和第五凹槽；所述第四凹槽相对第二凹槽设置，用于提供厌氧微生物的培养空间；所述第五凹槽相对第一凹槽设置，用于卡合容置所述培养液储存室；所述第四凹槽的水平槽面上开设有可供光源入射的第二视窗；所述第一视窗和所述第二视窗相对设置；

所述培养液储存室上开设有出液孔，其用于通过管道与所述微流控芯片的入口端相连通；所述上盖的侧壁上开设有气体入口、气体出口和出液口，所述出液口用于通过管道与所述微流控芯片的出口端相连通。

2.根据权利要求1所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：该装置还包括芯片固定板；

所述芯片固定板用于将所述微流控芯片固定于所述第三凹槽中，且所述芯片固定板上开设有镂空窗口；所述镂空窗口分别与所述第一视窗、所述第二视窗相对设置。

3.根据权利要求2所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：围绕所述镂空窗口四周的所述芯片固定板上开设有多个第一螺孔，所述第一螺孔的下端设置有第一弹性件，所述第一弹性件的一端与所述第一螺孔边缘的所述芯片固定板相抵接，并通过粘结剂固定；另外一端与所述第三凹槽中的所述微流控芯片相抵接；所述芯片固定板的四周与所述第二凹槽的水平槽面固定。

4.根据权利要求3所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述第一螺孔的数目至少为4个，其均匀布设于所述镂空窗口四周的所述芯片固定板上；对应所述第一弹性件的数目至少为4个。

5.根据权利要求3或4所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述第一弹性件包括针筒以及可移动地设置在所述针筒内的针头，所述针筒内设有弹簧，所述针头通过所述弹簧能弹性地移动，所述针筒通过所述第一螺孔与所述芯片固定板相抵接，所述针头能弹性地抵接在所述微流控芯片上。

6.根据权利要求4所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述芯片固定板的四周开设有多个第二螺孔，围绕所述第三凹槽四周的所述第二凹槽的水平槽面上开设有多个第三螺孔，所述第二螺孔与所述第三螺孔的孔心对应，通过螺钉实现所述芯片固定板与所述第二凹槽的水平槽面的固定连接。

7.根据权利要求6所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述第二螺孔的数目至少为4个，均匀布设于所述芯片固定板的四周；对应所述第三螺孔的数目至少为4个。

8.根据权利要求1所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述第三凹槽的水平槽面四周边缘布设有第一支撑梁，所述第一视窗的四周边缘通过粘结剂与所述第一支撑梁密封固定连接。

9.根据权利要求1所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述第四凹槽的水平槽面四周边缘布设有第二支撑梁，所述第二视窗的四周边缘通过粘结剂与所述第二支撑梁密封固定连接。

10.根据权利要求3或8或9所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述粘结剂包括光敏胶。

11.根据权利要求1所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述第一视窗和所述第二视窗包括光透性好的玻璃板或亚力克板。

12.根据权利要求1或11所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述第一视窗和所述第二视窗的形状包括矩形、圆形或椭圆形；所述第二视窗的面积大于所述第一视窗的面积。

13.根据权利要求1所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述培养液储存室由储存室本体和储存室上盖构成，所述出液口开设于所述储存室上盖上，连通至所述微流控芯片的入口端的管道经由所述出液口深入至所述培养液储存室的底部。

14.根据权利要求13所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述储存室本体和所述储存室上盖分别设置有多个均匀分布且相互对应的螺孔，并通过螺钉实现所述储存室本体与所述储存室上盖的固定连接。

15.根据权利要求13所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述储存室上盖上还开设至少一个气孔。

16.根据权利要求1所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述底座与所述上盖相互扣合的接触面边缘分别开设有多个均匀分布且相互对应的螺孔，并通过螺钉实现所述底座与所述上盖的密封扣合。

17.根据权利要求16所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述底座的接触面的边缘开设有一圈环形凹槽，所述环形凹槽用于容置橡胶圈以实现所述底座与所述上盖的进一步密封。

18.根据权利要求5所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述第二凹槽的侧边缘开设有多个第四螺孔，并于所述第二凹槽的外侧边缘布设有多个对应所述第四螺孔的第二弹性件；通过粘结剂实现所述第二弹性件与所述第四螺孔的固定；所述第二弹性件用于与显微镜标准载物台适配并固定。

19.根据权利要求1所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述底座的材质包括铝合金；所述上盖的材质包括树脂；所述培养液储存室的材质包括聚醚醚酮。

20.根据权利要求2所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述芯片固定板的材质包括铝合金。

21.根据权利要求1所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述气体入口和所述气体出口均通过螺塞和接头刃环接入外部气体管道，且所述气体管道上布设有止流阀。

22.根据权利要求1所述的厌氧微生物培养与实时观测装置，其特征在于：所述出液口外接薄膜泵，所述薄膜泵用于提供负压。

23.一种厌氧微生物实时观测的培养方法，其采用权利要求1～22任一项所述的厌氧微生物培养与实时观测装置进行操作，包括以下步骤：

准备内置了厌氧微生物种子液的微流控芯片，所述微流控芯片由载玻片和封接在载玻片上的芯片结构组成，所述芯片结构是由主通道沟通众多与其垂直的子通道，入口端与出口端与其主通道连通；将微控流芯片放置于第三凹槽中，其入口端通过管道与培养液储存室的出液孔相连通；其出口端与上盖侧壁上的出液口相连通；连接好管路后，将上盖与底板扣合并密封固定，完成装置的组装；

将装置架设于显微镜上，并与显微镜载物台适配器固定；通过上盖侧壁上的气体入口通入厌氧微生物特定的气体氛围流，进行厌氧环境下的厌氧微生物的连续培养，调整显微镜光源和物镜位置，进行实时培养成像观察。

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