CN112891547A - 激动gstp1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因药物领域，具体涉及激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用。首先验证了GSTP1过表达质粒可以显著增强人正常肺上皮细胞中的GSTP1蛋白。进一步，使用MTT实验发现过表达GSTP1对细胞自身增殖无影响，在辐射压力下，过表达组细胞增殖活性高于空载质粒转染组。最后，利用Westernblot实验，得出增强GSTP1基因表达，抑制了辐射造成细胞EMT过程的发生，减弱了辐射造成的细胞损伤。本发明提供了GSTP1基因和增强GSTP1基因表达的试剂新应用，通过增强GSTP1基因表达，可以减弱放射治疗对正常肺组织的损伤，从而能够有效提高防护电离辐射导致的放射性肺损伤。
Description
技术领域
本发明涉及基因药物领域，具体涉及激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用。
背景技术
近年来研究表明，肺癌是我国发病率和致死率最高的恶性肿瘤。随着放疗技术及仪器的发展，放射治疗已经是治疗肺癌不可或缺的关键手段。放射治疗的基本原理是通过高能射线对病灶部位进行充分照射，从而直接损伤DNA或介导细胞内水分子等产生大量活性氧损伤DNA，造成细胞自身无法修复的DNA断裂，促进肿瘤细胞死亡。然而研究显示，由于照射技术等相关限制，多数患者进行肺部放射治疗后均会出现不同程度的正常肺组织损伤，该副反应不仅严重限制了照射剂量的选择，同时也严重影响了放疗病人的生活质量。目前临床针对放射性肺损伤的防治，主要是使用糖皮质激素对症治疗。而关于放射性肺损伤形成的病因，学术界尚未有明确的结论。目前主要的研究方向包括炎性反应、免疫失衡等，因而临床上暂无有效的防护药物。综上，寻找一种放射性损伤防护药物是解决目前临床放疗副反应的重中之重。
谷胱甘肽S转移酶(GST)是在从单细胞动物到哺乳动物细胞内都普遍存在的一类二期同工酶蛋白，该类蛋白广泛存在于人体的肝脏、肺、肾等器官中，具有催化谷胱甘肽(GSH)与各种亲电、疏水物质结合，形成水溶性化合物，从体内排出，减轻细胞内生物大分子损伤的作用。谷胱甘肽S-转移酶P1(glutathione S-transferase P1，GSTP1)是GSTs蛋白家族重要成员，其功能包括调节细胞氧化应激状态、调节细胞凋亡、促进细胞毒物代谢，并与肿瘤发生和预后相关。我们通过大量临床肺癌放疗病人进行基因检测发现，GSTP1单核苷酸多态性与放疗后二级及更严重的放射性肺炎发生率相关。
然而增强GSTP1基因表达的试剂在制备电离辐射致放射性肺损伤防治药物中的应用国内外至今无人报道。
发明内容
本发明的目的在于提供增强GSTP1基因表达的试剂的新用途，即增强GSTP1基因表达的试剂在制备电离辐射致放射性肺损伤防治药物中的应用。
激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用，所述的防护放射性肺损伤药物为减弱放射治疗对正常肺组织的损伤的药物。
进一步的，所述激动GSTP1基因降低电离辐射引起的肺组织细胞的损伤。
进一步的，所述激动GSTP1基因减少细胞内活性氧含量。
进一步的，所述GSTP1基因催化谷胱甘肽(GSH)与细胞内各种亲电、疏水物质结合成水溶性化合物从体内排出，减轻细胞内生物大分子损伤。
进一步的，所述的激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用的技术方案为：增强GSTP1基因表达的试剂在制备电离辐射致放射性肺损伤防治药物中的应用。
进一步的，所述的激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用的技术方案具体为：通过GSTP1过表达质粒增强GSTP1基因表达在制备电离辐射致放射性肺损伤防治药物中的应用。
将GSTP1过表达质粒及阴性对照质粒通过脂质体2000(lipofectamine2000)转入人正常肺上皮细胞BEAS-2B中，48h应用Western blot技术对含flag标签的GSTP1蛋白表达进行检测。结果发现：GSTP1过表达质粒可以显著增强人正常肺上皮细胞中的GSTP1蛋白。
进一步，对正常BEAS-2B细胞、转染GSTP1过表达质粒及阴性对照质粒的BEAS-2B细胞给予6Gy的60Coγ射线照射，使用MTT实验检测增强GSTP1表达对辐照后人正常肺上皮细胞增殖活性的影响。结果显示过表达GSTP1对细胞自身增殖无影响，在辐射压力下，过表达组细胞增殖活性高于空载质粒转染组。(P<0.05)。
最后，对正常BEAS-2B细胞、转染GSTP1过表达质粒及阴性对照质粒的BEAS-2B细胞进行6Gy的60Coγ射线照射，然后利用Western blot对EMT相关蛋白上皮标志物上皮钙黏素(E-cadherin)和间质标志物神经钙黏素(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)进行检测，结果发现与阴性对照组相比，GSTP1过表达组照射后间质标志物N-cadherin、Vimentin表达低于空载质粒对照组，间质标志E-cadherin表达高于空载质粒对照组。表明该蛋白表达增加，抑制了照射造成细胞EMT过程的发生。
因此，本发明要求保护增强GSTP1基因表达的试剂在制备电离辐射致放射性肺损伤防治药物中的应用。通过增强GSTP1基因表达，可以减弱放射治疗对正常肺组织的损伤，从而达到防护放射性肺损伤的效果。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明提供了GSTP1基因和增强GSTP1基因表达的试剂新应用，通过增强GSTP1基因表达，可以减弱放射治疗对正常肺组织的损伤，从而能够有效提高防护电离辐射导致的放射性肺损伤。
附图说明：
图1为转染GSTP1过表达质粒、阴性对照质粒的BEAS-2B细胞和阳性对照质粒中GSTP1蛋白的表达情况；
图2为正常BEAS-2B细胞、转染GSTP1过表达质粒及阴性对照质粒的BEAS-2B细胞照后生长和增殖的改变；
图3为正常BEAS-2B细胞、转染GSTP1过表达质粒及阴性对照质粒的BEAS-2B细胞照后的EMT标志物蛋白表达情况。
具体实施方式:
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
材料：细胞株和细胞培养：将人正常上皮细胞BEAS-2B(军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所保藏)在LHC-8培养基于37℃、5％CO 2培养箱中培养，为防止细菌污染，培养基中均加有终浓度为100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素(双抗)。药物与主要试剂：LHC-8培养基、胰酶购自Gibco公司；MTT检测试剂盒购自Invitrogen公司；Western blot相关实验试剂购自美国Amerseco公司；Anti-GSTP1购自美国GeneTex公司；Anti-N-cadherin、Anti-Vimentin购自美国abcam公司；Anti-E-cadherin购自美国Cell signaling公司。
实施例1：
GSTP1过表达质粒可以显著增强人正常肺上皮细胞中的GSTP1蛋白：
实验过程：
(1)细胞培养：将BEAS-2B细胞培养于LHC-8培养基并加入终浓度为100U/mL的青霉素及100μg/mL的链霉素(双抗)；将其细胞置于37℃、5％CO 2培养箱中培养，每2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。
(2)细胞转染：将BEAS-2B接种于直径35mm培养皿中，每个培养皿接种3×105个细胞，培养24小时。铺板和转染期间避免使用抗生素。转染溶液配制：按照质粒：Lipofectamine2000用量比为4μg/孔∶10μl/孔。将配置好的转染液加入待转染的BEAS-2B细胞培养皿中，将培养皿置于孵箱中孵育。6h后于超净台弃去含转染试剂的培养液，更换为新鲜的完全培养基，继续培养。
(3)转染48小时后提取蛋白，进行Western blot电泳。结果如图1所示，GSTP1过表达质粒可以显著增强人正常肺上皮细胞BEAS-2B中的GSTP1蛋白。
实验结果：
通过对图1中转染GSTP1过表达质粒、阴性对照质粒的BEAS-2B细胞和阳性对照质粒中GSTP1蛋白的表达情况进行对比，可以发现GSTP1过表达质粒可以显著增强人正常肺上皮细胞中的GSTP1蛋白。
实施例2：
表达GSTP1对细胞自身增殖无影响，在辐射压力下，过表达组细胞增殖活性高于空载质粒转染组(P<0.05)：
实验过程：
(1)细胞培养及细胞转染同实施例一；
(2)MTT实验方法：将对数生长期BEAS-2B细胞消化并计数，重悬细胞后使细胞浓度为6x104个/ml，吸取200μl细胞重悬液，将细胞接种到96孔板中，37℃孵箱孵育。向96孔板中每个孔加入20μl工作浓度的MTT溶液(0.5mg/ml)，孵箱中孵育4h后取出。弃去培养液，每孔加入150μl DMSO，10min后使用酶标仪(490nm波长)进行检测。
实验结果：
通过对图2中正常BEAS-2B细胞、转染GSTP1过表达质粒及阴性对照质粒的BEAS-2B细胞照后生长和增殖的改变情况进行对比，可以发现结果显示过表达GSTP1对细胞自身增殖无影响，在辐射压力下，过表达组细胞增殖活性高于空载质粒转染组。(P<0.05)。
实施例3：
增强GSTP1基因表达，抑制了照射造成细胞EMT过程的发生减弱了辐射造成的细胞损伤：
实验过程：
(1)细胞培养及细胞转染同实施例一；
(2)取对数生长期转染GSTP1过表达质粒及阴性对照质粒48h的BEAS-2B细胞，提取蛋白，进行Western blot电泳。使用曝光仪对GSTP1、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin及β-ACTIN条带进行曝光。
其中，照射条件：军事科学院的60Coγ射线照射。以6Gy的γ射线照射剂量率1Gy/min处理细胞。
实验结果：
统计学处理：上述实施例的所有实验均重复3次以上，采用SAS统计软件对相关数据进行t检验，以P<0.05为有显著性差异。
通过对图3正常BEAS-2B细胞、转染GSTP1过表达质粒及阴性对照质粒的BEAS-2B细胞照后的EMT标志物蛋白表达情况进行对比，发现与阴性对照组相比，GSTP1过表达组照射后间质标志物N-cadherin、Vimentin表达低于空载质粒对照组，间质标志E-cadherin表达高于空载质粒对照组。表明该蛋白表达增加，抑制了照射造成细胞EMT过程的发生。
Claims (7)
1.激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用，其特征在于：所述的防护放射性肺损伤药物为减弱放射治疗对正常肺组织的损伤的药物。
3.根据权利要求1所述的激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用，其特征在于：所述激动GSTP1基因降低电离辐射引起的肺组织细胞的损伤。
4.根据权利要求3所述的激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用，其特征在于：所述激动GSTP1基因减少细胞内活性氧含量。
5.根据权利要求4所述的激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用，其特征在于：其中，所述GSTP1基因催化谷胱甘肽(GSH)与细胞内各种亲电、疏水物质结合成水溶性化合物从体内排出，减轻细胞内生物大分子损伤。
6.根据权利要求1所述的激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用，其特征在于：所述的激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用的技术方案为：增强GSTP1基因表达的试剂在制备电离辐射致放射性肺损伤防治药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用，其特征在于：所述的激动GSTP1基因在防护放射性肺损伤药物中的应用的技术方案具体为：通过GSTP1过表达质粒增强GSTP1基因表达在制备电离辐射致放射性肺损伤防治药物中的应用。
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Non-Patent Citations (1)
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| 贺琦多: "人谷胱甘肽S转移酶P1对辐射诱导肺细胞损伤的影响", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士） 医药卫生科技辑》 * |
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