CN112891438A - 一种用于动脉粥样硬化预防、治疗的中药组合物 - Google Patents

Abstract

一种动脉粥样硬化预防、治疗用中药组合物，制备中草药紫花地丁和食用白醋的药物浸膏，并稀释成不同浓度；工作流程为：（1）中药组合物100μmol/l Hcy干预内皮细胞建立内皮细胞凋亡模型，并且细胞活力染色及Western Blot检测该浓度Hcy可以致内皮细胞凋亡，为后续实验奠定基础；（2）稀释中药组合物为不同浓度梯度药液（0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、10mg/ml），干预细胞24h、48h后，验证药物对细胞保护作用最佳浓度范围及作用时间；（3）验证药物对内皮细胞损伤具有预防及治疗作用，所得中药组合物药液及Hcy以不同先后顺序感染内皮细胞，检测细胞存活率。本发明在内皮细胞损伤中具有重要作用，为以后在动脉粥样硬化的预防与治疗中提供了理论依据和用药指导。

Description

一种用于动脉粥样硬化预防、治疗的中药组合物

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种动脉粥样硬化预防、治疗用中药组合物。

背景技术

心脑血管病具有高发病率、高患病率及高死亡率的特征，给国家带来了严重经济负担，也是影响我国居民健康生活的重要因素。同时随着各种危险因素增加，心脑血管疾病的发病年龄也具有一个年轻化的趋势。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病中血管病变的病理基础，AS有较多的发病病因如：内膜损伤、脂质浸润、氧化应激、炎性反应、血管平滑肌细胞增生等，而内膜损伤被认为是AS发生的始动因素。血管内皮细胞(endothelial cell,ECs)不仅是一种细胞层，更可看作为一种具有多功能的器官，除了具有屏障保护功能之外，还可以分泌多种细胞因子，并且富含多种靶器官的各种受体，可以抵抗氧化应激，在血管的保护作用中，炎症因子等各种危险因素起到了极为重要的作用。较多的实验研究已经证实斑块形成周围可发现内皮细胞出现明显的凋亡、活化及损伤，为动脉粥样硬化发生发展奠定了病理基础，由此可见ECs的损伤为AS发生的重要因素。随着AS发生发展，最终会出现斑块破裂糜烂，形成栓塞，成为急性脑梗死及急性心梗较为重要的死亡因素。中国心血管疾病报告数据显示，总体上看，中国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段，其中冠心病患者大概1100万，同时心血管病死亡占居40％以上，高于其他疾病，居于首位。未来10年，心血管病患病人数仍将继续增加，心血管疾病负担也日趋严峻，因此寻找预防和治疗AS的有效方法至关重要。而目前经皮冠状动脉支架植入术(PCI)己成为我国冠心病患者接受治疗的主要方式。随着对PCI的深入研究，人们发现，支架植入尤其是药物涂层支架植入后，降低了再狭窄的发生率，但是随着血管内超声技术、光学相干断层成像技术的出现，支架后管腔再狭窄问题又再次直观地暴露在大家面前。目前尽管药物涂层支架可以一定程度上抑制血管平滑肌增殖和迁移，但仍然不能完全阻止血管平滑肌的增殖和迀移，而且抑制血管内皮细胞的再生与迁移会导致支架长期裸露于血管腔内，更容易出现支架内再狭窄及血栓形成，因此，寻找有效预防、治疗动脉粥样硬化的药物及技术成为了心血管领域亟待解决的难题之一。

中医药作为中国传统医药学的统称，距今已有3500年以上的发展历史，是在充分汲取了我国各族传统医药学理论及对疾病防治经验系统总结基础上发展起来的东方医药学体系，也是迄今为止世界传统医学理论最系统、内涵最丰富、应用最广泛、保留最完整的突出代表。经过几千年的医学实践证明，中医药学不仅能从整体方面把握疾病的发展进程，更对生命现象全过程有更深的科学认识。目前，中医药对于防治慢性病、老年病，及各种疑难杂症都显示出了中医药独特疗效和显著优势。中草药紫花地丁(Viola philippica)就是著名的药用植物，其出自《本草纲目》，为堇菜科堇菜属植物紫花地丁的全草，性味：苦、辛、寒，归经：归心、肝经。具有清热解毒、凉血消肿、消痈散结之功效。常用于疔疫痈疽，丹毒，乳痈，肠痈，瘰疬，湿热宵铜，黄疸，目赤肿毒，蛇毒咬伤。紫花地丁的药理活性主要有抗(抑)菌作用、抗炎作用、抗病毒作用、抗凝血作用、抗氧化作用、抗癌作用、止痒作用、退热和抗补体等作用。在动脉粥样硬化的中医病因病机中痰浊、血瘀、湿热是主要的致病机理，与中草药紫花地丁的治病机理吻合，因此，研究中草药紫花地丁对于动脉粥样硬化的治疗具有广阔前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种动脉粥样硬化预防、治疗用中药组合物，此中药组合物由中草药紫花地丁全草和食用白醋按一定比例水提所得。并验证所得中药组合物在Hcy致内皮细胞损伤过程中的预防及治疗作用，明确其发挥作用的合适浓度范围，为临床动脉粥样硬化的治疗提供理论依据，为临床用药提供指导。

本发明的技术方案为：

一种动脉粥样硬化预防、治疗用中药组合物，制备中草药紫花地丁和食用白醋的药物浸膏，并稀释成不同浓度。工作流程为：

(1)中药组合物100μmol/l Hcy干预内皮细胞建立内皮细胞凋亡模型，并且细胞活力染色及Western Blot检测该浓度Hcy可以致内皮细胞凋亡，为后续实验奠定基础。

(2)稀释中药组合物为不同浓度梯度药液(0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、10mg/ml)，干预细胞24h、48h后，验证药物对细胞保护作用的最佳浓度范围及作用时间。

(3)验证药物对内皮细胞损伤具有预防及治疗作用，所得中药组合物药液及Hcy以先后不同顺序感染内皮细胞，检测细胞存活率。

进一步，所述中草药紫花地丁采于湖南省，由湖南中医药大学教授王炜鉴定。

进一步，验证中草组合物对于内皮细胞损伤的预防和治疗作用，其步骤包括：①首先建立Hcy致内皮细胞凋亡的细胞模型；②筛选药物对细胞具有保护作用的浓度范围、时间范围；③验证中药组合物对细胞的预防作用，先加中药组合物干预细胞，后Hcy作用于内皮细胞，检测细胞存活率；④验证中药组合物对细胞的治疗作用，先Hcy作用于内皮细胞，后加中药组合物干预细胞，检测细胞存活率。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明提供了一种新的中药组合物，即中草药紫花地丁与食用白醋组合物。

(2)本发明验证了中草药紫花地丁与食用白醋所得组合物的新的药用价值。

(3)本发明明确了在Hcy致内皮细胞损伤模型中，中药组合物在适当浓度及适当干预时间上对内皮细胞有一定的预防及保护作用。

(4)本发明所涉及的中草药紫花地丁及食用白醋组合物在内皮细胞损伤中具有重要作用，为以后在动脉粥样硬化的预防与治疗中提供理论依据，并为临床对于动脉粥样硬化相关血管疾病提供用药指导。

(5)本发明所涉及的药物提取方法及验证方法均简单易行，操作方便，价格低廉，容易被广大群众所接受。

附图说明

图1为100μmol/l Hcy干预内皮细胞后，细胞活力染色检测0组(对照组)和Hcy组(实验组)红色(凋亡)细胞数改变情况。

图2为100μmol/l Hcy干预内皮细胞后，Western Blot检测0组、Hcy组Bax/Bcl-2比值改变，检测细胞凋亡情况。与0组相比，**P＜0.01

图3为不同药物浓度(0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、10mg/ml)作用于内皮细胞24h、48h，CCK-8检测细胞增殖率。

图4为检测中药组合物预防作用，先加中药组合物低、中、高剂量作用于内皮细胞24h后，加Hcy作用于细胞72h，CCK-8检测细胞增殖率。与Hcy组相比，先加中药组合物药液后，再Hcy干预细胞，各个药液组细胞存活率仍增高。表明中药组合物对细胞损伤有较强的预防作用，且最佳浓度为10μg/ml。

图5为检测中药组合物治疗作用，先加Hcy作用于内皮细胞72h后，加中药组合物低、中、高剂量作用于细胞24h，CCK-8检测细胞增值率。与Hcy组相比，低剂量(10μg/ml)治疗效果较差，中剂量(100μg/ml)治疗效果较好，但治疗效果会随着中药组合物药液的增加而下降。表明Hcy干预内皮细胞造成细胞损伤后，中剂量100μg/ml中药组合物药液能达到治疗效果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

一种动脉粥样硬化预防、治疗用中药组合物，制备中草药紫花地丁和食用白醋的药物浸膏，并稀释成不同浓度。工作流程为：

(1)中药组合物100μmol/l Hcy干预内皮细胞建立内皮细胞凋亡模型，并且细胞活力染色及Western Blot检测该浓度Hcy可以致内皮细胞凋亡，为后续实验奠定基础。

(2)稀释中药组合物为不同浓度梯度药液(0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、10mg/ml)，干预细胞24h、48h后，验证药物对细胞保护作用的最佳浓度范围及作用时间。

(3)验证药物对内皮细胞损伤具有预防及治疗作用，所得中药组合物药液及Hcy以不同先后顺序感染内皮细胞，检测细胞存活率。

本发明所述的中药紫花地丁及食用白醋的新的组合物对Hcy致内皮细胞损伤中的预防及治疗作用，进一步验证了新的组合物的药用价值。

1、实验对象

细胞株

人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，购自中国名劲生物科技有限公司。

2、仪器设备及实验试剂

2.1主要仪器

超净工作台(苏州，安泰)；CO₂培养箱(德国，Heraeus)；5415D型微量台式离心机(德国，Eppendorf)；Heratherm通用型烘箱(美国，Thermo Fisher)；蒸馏提纯旋转蒸发仪(中国，郑州市创瑞仪器有限公司)；超微量分光光度计(美国，SimpliNano)；垂直电泳仪、转膜仪、曝光仪(美国，Bio-Rad)；BS110S型精密天平(德国，Sartorius)；水平摇床(美国，Thermo Fisher)；激光共聚焦显微镜(德国；ZEISS)。

2.2主要试剂

白醋(中国，湖南长康实业有限责任公司)；同型半胱氨酸(美国，Sigma公司)；胎牛血清、DMEM培养基(澳大利亚，Gibco公司)；青链霉素、NP-40(中国，碧云天生物技术研究所)；细胞活力荧光测定试剂盒(瑞士，Roche公司)；PMSF(中国，北京索莱宝科技有限公司)；Bax抗体、Bcl-2抗体(英国，Abcam公司)、β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗(中国，北京金桥有限公司)；脱脂奶粉(美国，BD公司)；CCK-8细胞毒性/增殖检测试剂盒(美国，Ape×Bio公司)。

3方法

3.1中草药紫花地丁白醋浸膏制备

在紫花地丁采收期采集其全草，除去杂质，洗净，晾干，再于50℃烤箱中彻底烘干后，将其打成粗粉，加入药材重量10-12倍的水，搅拌15-30分钟，浸泡1小时，武火煎煮0.5h，文火煎煮1.5小时，过无菌纱布，收集煎液，后再加10-12倍的水，用同样的方法煎煮第二次，合并两次煎液，加入煎液一半量的白醋，搅拌均匀，静置沉淀，过夜，取上清液，放入旋蒸仪，浓缩至浸膏(1g浸膏相当于2-5g的草药)，4℃保存。

将浸膏稀释成初浓度为250mg/ml的药物溶液，即称取5g浸膏于50ml离心管，加入从高压蒸汽锅中拿出的热水，振荡，充分混匀药液，过100目的尼龙网，滤过的液体分装到15ml离心管中，再4000转，10分钟离心。取上清液与另一5ml离心管中，再将药液拿入细胞间，过0.22mm的无菌滤器，得到无菌纯药液，-4°保存，备用。

3.2细胞培养

用含10％胎牛血清DMEM培养基培养HUVECs，置于37℃、5％CO2培养箱中，待细胞密度达70％左右时，用终浓度0μmol/L Hcy(0组)、100μmol/L Hcy(Hcy组)干预细胞72h后，收集细胞用于后续实验。

3.3细胞活力染色检测细胞凋亡

取细胞，弃去上层培养基，将激光共聚焦皿中的细胞用PBS洗3次，避光，15ml离心管中加入5ml PBS、5μl Nuclei Dye、25μl Dead Dye、3μl Viable Dye，涡旋振荡将三种染料混合后，在每个培养皿中依次加入200μl混合染料，于37℃烤箱中孵育30min后拿出，在激光共聚焦显微镜下观察两组细胞凋亡情况(蓝色表示细胞核；红色表示死细胞；绿色表示活细胞)。

3.4 Western blot测定两组细胞中Bax、Bcl-2的蛋白表达

取细胞，弃上层培养基，预冷PBS洗3次，PMSF与NP-40裂解液按1:100配制蛋白裂解液，依据细胞量加入裂解液，置于4℃摇床30min，12000rpm、4℃离心20min后，将蛋白上清液转移至新的EP管中，按照蛋白与loading buffer缓冲液4:1的比例，加入上样缓冲液，混匀，并99℃煮沸变性5min。每孔300μg蛋白样品，SDS-PAGE电泳至所需蛋白分子量处，电转将胶转印至0.22μm PVDF膜上，5％脱脂牛奶室温封闭2h，PBST洗膜10min，共3次，加入β-actin抗体(1:10000)和Bax、Bcl-2抗体(1:1000)4℃过夜，再PBST室温洗膜10min，重复3次，用辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5000)室温孵育2h后，PBST室温洗膜10min，重复3次，曝光。以Bax、Bcl-2分别与β-actin的光密度值比值作为Bax、Bcl-2蛋白表达的相对量。

3.5 CCK-8检测细胞存活率

收集处于生长对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl细胞悬液，细胞密度约为8000每孔，5％CO₂，37℃孵育24小时，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)；取出96孔板，小心弃去孔内培养基，按分组加入Hcy或者不同浓度梯度的中草药药液，每孔100μl，5％CO₂，37℃孵育24～48小时，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养箱孵育2h。通过酶联免疫检测仪(450nm波长)检测各实验组细胞孔的吸光值；设置空白孔(无细胞、无培养液、无CCK-8溶液)，设置对照孔(细胞、相同药物的溶解介质、CCK-8溶液)，每组设3个复孔，保存结果进行计算：细胞存活率(％)＝[(加药孔OD值)-(空白孔OD值)]÷[(对照孔OD值)-(空白孔OD值)]×100％。实验重复三次，记录平均值。

4统计学方法

本研究实验结果均为计量资料，用Prism7.0统计软件进行统计学分析，结果以

表示，两组间比较采用t检验，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间两两比较用Student-Newman-Keuls检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

5结果

5.1细胞活力染色检测细胞凋亡

细胞活力染色检测Hcy对内皮细胞凋亡的影响，用激光共聚焦显微镜观察，结果显示：与0组相比，Hcy组凋亡细胞数(红色细胞数)显著增加，细胞活力显著降低。

5.2 Western Blot检测凋亡相关蛋白表达

Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达水平，结果显示：Hcy组相较于0组，Bax/Bcl-2比值增加。

5.3 CCK-8筛选药物合适浓度及时间

CCK-8筛选药物合适浓度及时间，结果显示：与0组相比，不同药物浓度(0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、10mg/ml)干预细胞24h，随浓度增加，细胞存活率增加，且增长幅度较大；同样浓度干预细胞48h，细胞随浓度增加，但增长幅度有所减缓。因此，中草药组合物干预细胞最适宜时间为24h。

5.4先加中药组合物药液干预细胞，CCK-8检测细胞存活率

为了验证中草药组合物药液对Hcy致内皮细胞损伤具有预防作用，低、中、高剂量(10μg/ml、100μg/ml、1mg/ml)药液先干预内皮细胞24h后，弃去含药培养基，再Hcy干预内皮细胞72h，CCK-8检测细胞存活率。结果显示：与单纯Hcy组相比，各个含药组随浓度增加，细胞存活率增加，且最适宜的浓度为10μg/ml。

5.5先加Hcy干预细胞再加药液，CCK-8检测细胞存活率

为了验证中草药组合物药液对Hcy致内皮细胞损伤具有治疗作用，先加Hcy干预内皮细胞72h，对细胞造成损伤后，弃去培养基，再低(10μg/ml)、中(100μg/ml、500μg/ml)、高剂量(1mg/ml)药液干预内皮细胞24h后，CCK-8检测细胞存活率。结果显示：与单纯Hcy组相比，低剂量、高剂量含药组细胞存活率较低，但中剂量含药组细胞存活率增加。表明中药组合物药液对Hcy致内皮细胞损伤的治疗浓度为100μg/ml。

6结论

Hcy干预内皮细胞，可造成内皮细胞凋亡，对内皮细胞有损伤作用，而制备的中草药紫花地丁与食用白醋药液通过不同方式干预细胞，对Hcy对内皮细胞的损伤起到预防及治疗作用，明确了中草药紫花地丁及食用白醋药液的新作用。

本发明通过中草药紫花地丁全草于食用白醋按一定比例混合，水提，旋蒸得到混合物浸膏，通过稀释不同浓度药液干预内皮细胞，观察到其可以预防并治疗Hcy诱导的内皮细胞的损伤，为对于动脉粥样硬化等心血管疾病提供新的理论基础，为临床预防与治疗提供新的方向。

以上所述，仅为本发明较佳的、较具体的实施方法，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，对技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种动脉粥样硬化预防、治疗用中药组合物，其特征在于，制备中草药紫花地丁和食用白醋的药物浸膏，并稀释成不同浓度；工作流程为：

（1）中药组合物100 μmol/l Hcy干预内皮细胞建立内皮细胞凋亡模型，并且细胞活力染色及Western Blot检测该浓度Hcy可以致内皮细胞凋亡，为后续实验奠定基础；

（2）稀释中药组合物为不同浓度梯度药液（0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、10mg/ml），干预细胞24h、48h后，验证药物对细胞保护作用的最佳浓度范围及作用时间；

（3）验证药物对内皮细胞损伤具有预防及治疗作用，所得中药组合物药液及Hcy以不同先后顺序感染内皮细胞，检测细胞存活率。

2.根据权利要求1所述的动脉粥样硬化预防、治疗用中药组合物，其特征在于，所述验证中草组合物对于内皮细胞损伤所致动脉粥样硬化的预防和治疗作用，其步骤包括：①首先建立Hcy致内皮细胞凋亡的细胞模型；②筛选药物对细胞具有保护作用的浓度范围、时间范围；③验证中药组合物对细胞的预防作用，先加中药组合物干预细胞，后Hcy作用于内皮细胞，检测细胞存活率；④验证中药组合物对细胞的治疗作用，先Hcy作用于内皮细胞，后加中药组合物干预细胞，检测细胞存活率。

3.根据权利要求1所述的动脉粥样硬化预防、治疗用中药组合物，其特征在于，所述中草药紫花地丁白醋浸膏制备流程为：

在紫花地丁采收期采集其全草，除去杂质，洗净，晾干，再于50℃烤箱中彻底烘干后，将其打成粗粉，加入药材重量10-12倍的水，搅拌15-30分钟，浸泡1小时，武火煎煮0.5h，文火煎煮1.5小时，过无菌纱布，收集煎液，后再加10-12倍的水，用同样的方法煎煮第二次，合并两次煎液，加入煎液一半量的白醋，搅拌均匀，静置沉淀，过夜，取上清液，放入旋蒸仪，浓缩至浸膏（1g浸膏相当于2-5g的草药），4℃保存；

将浸膏稀释成初浓度为250mg/ml的药物溶液，即称取5g浸膏于50ml离心管，加入从高压蒸汽锅中拿出的热水，振荡，充分混匀药液，过100目的尼龙网，滤过的液体分装到15ml离心管中，再4000转，10分钟离心；取上清液于另一15ml离心管中，再将药液拿入细胞间，过0.22mm的无菌滤器，得到无菌纯药液，-4°保存，备用。

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