CN112867914A - 固定剂溶液及生物样本的制备方法 - Google Patents
固定剂溶液及生物样本的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112867914A CN112867914A CN201980066904.5A CN201980066904A CN112867914A CN 112867914 A CN112867914 A CN 112867914A CN 201980066904 A CN201980066904 A CN 201980066904A CN 112867914 A CN112867914 A CN 112867914A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- concentration
- fixative solution
- component
- fixative
- aqueous fixative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000000834 fixative Substances 0.000 title claims abstract description 101
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 15
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 107
- MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N thymol Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C=C1O MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 52
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 29
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims abstract description 29
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 29
- 239000005844 Thymol Substances 0.000 claims abstract description 26
- 229940041616 menthol Drugs 0.000 claims abstract description 26
- 229960000790 thymol Drugs 0.000 claims abstract description 26
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Natural products CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- -1 carboxylate salt Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 229910001622 calcium bromide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 19
- WGEFECGEFUFIQW-UHFFFAOYSA-L calcium dibromide Chemical compound [Ca+2].[Br-].[Br-] WGEFECGEFUFIQW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 19
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims abstract description 16
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N (+)-Neomenthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@@H]1O NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N 0.000 claims abstract 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 33
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 19
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 19
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 19
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 claims description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 7
- WRYLYDPHFGVWKC-UHFFFAOYSA-N 4-terpineol Chemical compound CC(C)C1(O)CCC(C)=CC1 WRYLYDPHFGVWKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KRCZYMFUWVJCLI-UHFFFAOYSA-N Dihydrocarveol Chemical compound CC1CCC(C(C)=C)CC1O KRCZYMFUWVJCLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NEHNMFOYXAPHSD-UHFFFAOYSA-N citronellal Chemical compound O=CCC(C)CCC=C(C)C NEHNMFOYXAPHSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RRAFCDWBNXTKKO-UHFFFAOYSA-N eugenol Chemical compound COC1=CC(CC=C)=CC=C1O RRAFCDWBNXTKKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- VBIRCRCPHNUJAS-AFHBHXEDSA-N 4-[(1S,3aR,4S,6aR)-4-(1,3-benzodioxol-5-yl)tetrahydrofuro[3,4-c]furan-1-yl]-2-methoxyphenol Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2[C@@H]3[C@@H]([C@H](OC3)C=3C=C4OCOC4=CC=3)CO2)=C1 VBIRCRCPHNUJAS-AFHBHXEDSA-N 0.000 claims description 3
- JDLKFOPOAOFWQN-VIFPVBQESA-N Allicin Natural products C=CCS[S@](=O)CC=C JDLKFOPOAOFWQN-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 3
- JDLKFOPOAOFWQN-UHFFFAOYSA-N allicin Chemical compound C=CCSS(=O)CC=C JDLKFOPOAOFWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000010081 allicin Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 3
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 3
- VPSRGTGHZKLTBU-UHFFFAOYSA-N piperitol Natural products COc1ccc(cc1OCC=C(C)C)C2OCC3C2COC3c4ccc5OCOc5c4 VPSRGTGHZKLTBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HPOHAUWWDDPHRS-UHFFFAOYSA-N trans-piperitol Natural products CC(C)C1CCC(C)=CC1O HPOHAUWWDDPHRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BURBOJZOZGMMQF-UHFFFAOYSA-N xanthoxylol Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1C(COC2C=3C=C4OCOC4=CC=3)C2CO1 BURBOJZOZGMMQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- NFLGAXVYCFJBMK-RKDXNWHRSA-N (+)-isomenthone Natural products CC(C)[C@H]1CC[C@@H](C)CC1=O NFLGAXVYCFJBMK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 2
- DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N (R)-camphor Chemical compound C1C[C@@]2(C)C(=O)C[C@@H]1C2(C)C DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N 0.000 claims description 2
- FAMJUFMHYAFYNU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-(propan-2-yl)cyclohex-1-ene Chemical compound CC(C)C1CCC(C)=CC1 FAMJUFMHYAFYNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WRYLYDPHFGVWKC-SNVBAGLBSA-N 4-Terpineol Natural products CC(C)[C@]1(O)CCC(C)=CC1 WRYLYDPHFGVWKC-SNVBAGLBSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 claims description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NPBVQXIMTZKSBA-UHFFFAOYSA-N Chavibetol Natural products COC1=CC=C(CC=C)C=C1O NPBVQXIMTZKSBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000723346 Cinnamomum camphora Species 0.000 claims description 2
- 239000005770 Eugenol Substances 0.000 claims description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 2
- NFLGAXVYCFJBMK-UHFFFAOYSA-N Menthone Chemical compound CC(C)C1CCC(C)CC1=O NFLGAXVYCFJBMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UVMRYBDEERADNV-UHFFFAOYSA-N Pseudoeugenol Natural products COC1=CC(C(C)=C)=CC=C1O UVMRYBDEERADNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000987 azo dye Substances 0.000 claims description 2
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000846 camphor Drugs 0.000 claims description 2
- 229930008380 camphor Natural products 0.000 claims description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 2
- RECUKUPTGUEGMW-UHFFFAOYSA-N carvacrol Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C(O)=C1 RECUKUPTGUEGMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HHTWOMMSBMNRKP-UHFFFAOYSA-N carvacrol Natural products CC(=C)C1=CC=C(C)C(O)=C1 HHTWOMMSBMNRKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000007746 carvacrol Nutrition 0.000 claims description 2
- 229930003633 citronellal Natural products 0.000 claims description 2
- 235000000983 citronellal Nutrition 0.000 claims description 2
- 229930007024 dihydrocarveol Natural products 0.000 claims description 2
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002217 eugenol Drugs 0.000 claims description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 2
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WYXXLXHHWYNKJF-UHFFFAOYSA-N isocarvacrol Natural products CC(C)C1=CC=C(O)C(C)=C1 WYXXLXHHWYNKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229930007503 menthone Natural products 0.000 claims description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 claims description 2
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 claims description 2
- HFPZCAJZSCWRBC-UHFFFAOYSA-N p-cymene Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C=C1 HFPZCAJZSCWRBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- WWRCMNKATXZARA-UHFFFAOYSA-N 1-Isopropyl-2-methylbenzene Chemical compound CC(C)C1=CC=CC=C1C WWRCMNKATXZARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000003250 oocyst Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004215 spore Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 38
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 25
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 abstract description 25
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 abstract description 25
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- 238000010186 staining Methods 0.000 abstract description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 52
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 37
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 37
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 28
- NOOLISFMXDJSKH-KXUCPTDWSA-N (-)-Menthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@H]1O NOOLISFMXDJSKH-KXUCPTDWSA-N 0.000 description 24
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 24
- NQMKEZBQFUTOQC-UHFFFAOYSA-L calcium;dibromide;hydrate Chemical compound O.[Ca+2].[Br-].[Br-] NQMKEZBQFUTOQC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 16
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 16
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 16
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 7
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 5
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 5
- DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N Iodine aqueous Chemical compound [K+].I[I-]I DKNPRRRKHAEUMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 4
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 4
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 4
- 241000224467 Giardia intestinalis Species 0.000 description 3
- 108010034145 Helminth Proteins Proteins 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 229940085435 giardia lamblia Drugs 0.000 description 3
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000224466 Giardia Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- FNYNNOQKHJMSHI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2-propan-2-ylbenzene Chemical compound CC(C)C1=CC=CC=C1C.CC(C)C1=CC=CC=C1C FNYNNOQKHJMSHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RLXAQIXESOWNGY-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-propan-2-ylbenzene Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C=C1.CC(C)C1=CC=C(C)C=C1 RLXAQIXESOWNGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGVWYJDASSSGEK-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-propan-2-ylidenecyclohexan-1-ol Chemical compound CC1CCC(=C(C)C)C(O)C1 JGVWYJDASSSGEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000960389 Trichuris suis Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009972 noncorrosive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000426 osmoregulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 244000000040 protozoan parasite Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002522 swelling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N2001/305—Fixative compositions
- G01N2001/307—Fixative compositions non-toxic, no Hg, no formaldehyde
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
本公开的各方面涉及用于寄生虫样本的含有羧酸(优选乙酸)的固定剂。在一些方面，本公开涉及用于寄生虫样本的水性固定剂溶液，其包含：a)浓度为0.5M或更大的C2至C6羧酸(优选乙酸)；和b)浓度为0.02M或更大、优选0.04M或更大的C2至C6羧酸盐或卤化物盐。任选的组合物包含1.3M乙酸、12mM苯甲酸钠、0.9％氯化钙、0.9％溴化钙、100pg/ml薄荷醇和350pg/ml麝香草酚。所述固定剂不含甲醛或其他有害化合物，并且当使用于寄生虫样本(如卵和蠕虫)时表现出良好的杀虫和染色性能。
Description
技术领域
本发明涉及用于生物样本的组织学固定的固定剂溶液，以及用于检查(例如通过显微镜检查)的生物样本的制备方法。
背景技术
本发明尤其但不排他地涉及适合于固定生物体(特别是寄生虫样本，例如蠕虫卵(helminth ova)或蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia))的固定剂溶液。
要求用于这类应用的固定剂溶液能够杀死生物体(可能是致病性的)并且保持其细胞结构以便随后可以用显微镜对它们进行检查，例如通常是在用染色剂(如台盼蓝(Trypan blue)、鲁戈氏碘液(Lugol’s iodine)或三色染色法(Trichrome stain))进行染色之后。在染色后样本的显微外观受到固定剂溶液的影响，但难以或者无法预测给定配方的固定剂对染色性能的影响。
甲醛已广泛地使用于固定剂溶液(例如，在水溶液中，如同福尔马林)但却具有毒性且致癌，并且通常对于环境是有害的。
还使用了其他固定剂，但在许多情况下也是有害的。
最近，已开发出了无害的固定剂，例如在GB 2528426A(Reardon)和WO 92/19951A(Streck Lab)中所公开的，但仍需要一种能可靠地杀死寄生生物(例如蠕虫)的固定剂溶液，蠕虫具有坚固的外层因而对于固定剂的穿透有高度的抗性。如果排除高毒性的化学品(例如甲醛)，则难以在短时间内实现细胞死亡。
因此，本发明的目的是提供尤其适合于寄生虫样本的组织学固定的相对无害的固定剂。
本发明的另一个目的是提供固定剂及带来良好染色性能的生物样本的制备方法。
发明内容
因此，本发明提供了用于生物样本的水性固定剂溶液，其包含：
a)浓度为0.5M或更大的C2至C6羧酸；
b)浓度为0.02M或更大、优选0.04M或更大的C2至C6羧酸盐或卤化物盐。
任选地，所述C2至C6羧酸是乙酸。
任选地，C2至C6羧酸的浓度为0.9M或更大，更优选1.3M或更大。任选地，C2至C6羧酸的浓度不大于3.5M。
已发现这种浓度的羧酸(尤其是乙酸)能快速杀死生物体(如蠕虫卵)，例如无需有毒的添加剂，例如甲醛。
在一个任选的优选实施方案中，乙酸的浓度低于10％w/v。低于此限值的浓度归类为无腐蚀性。
组分b)的羧酸盐或卤化物盐可以是例如赋予适当溶解性的碱或碱土金属或铵或其他阳离子的盐。
任选地，组分b)是卤化钙盐或卤化镁盐。
更优选地，组分b)包括浓度为至少0.06M、优选至少0.08M、更优选至少0.1M的氯化钙；和/或浓度为至少0.06M、优选至少0.08M、更优选至少0.1M的溴化钙。
已发现这类卤化物盐有助于保持细胞结构，这有可能是涉及到抵消羧酸的膨胀效应(turgor effect)的卤化物盐的渗透调节效应。
任选地，固定剂还包含：c)抑制细菌或抑制真菌浓度的苯甲酸或山梨酸或者其盐。
任选地，组分c)是浓度为至少5mM、更优选至少10mM的苯甲酸盐。
如上所定义的组分c)可有助于防止样本分解。
任选地，固定剂还包含：d)浓度为至少50μg/ml的生物杀灭精油组分。
生物杀灭精油可以是例如抑制细菌或杀细菌或者抑制真菌或杀真菌的。
任选地，所述生物杀灭精油组分d)是以下项中的一种或多种：薄荷醇、麝香草酚(thymol)、长叶薄荷醇(pulegol)、二氢香芹醇、胡椒醇(piperitol)、薄荷酮、薄荷烯、邻异丙基甲苯(o-cymene)、对异丙基甲苯(p-cymene)、香茅醛、香芹酚、丁香油酚(eugenol)、4-香芹-薄荷醇(萜品烯-4-醇)(4-carvo-menthol(termpinen-4-ol))、蒜素(allicin)或樟脑。任选地，精油组分是以其天然的立体异构或对映体形式而存在。
理想地，所述生物杀灭精油组分d)包含薄荷醇和麝香草酚。
已发现这类精油会加速细胞死亡并因此缩短固定所需的时间。
在优选的其他任选实施方案中：
i)所述羧酸组分a)是浓度为0.8M至1.75M的乙酸；
ii)所述卤化物盐组分b)是浓度为70至100mM的氯化钙加上浓度为30mM至50mM的溴化钙；并且
iii)所述苯甲酸盐组分c)是浓度为5mM至15mM的苯甲酸盐。
在尤其优选的其他任选实施方案中：
i)所述羧酸组分a)是浓度为1.2M至1.75M的乙酸；
ii)所述卤化物盐组分b)是浓度为70至100mM的氯化钙加上浓度为30mM至50mM的溴化钙；并且
iii)所述苯甲酸盐组分c)是浓度为5mM至15mM的苯甲酸盐。
以上的实施方案有利地可带来特别好的染色性能。
在进一步优选的实施方案中：
i)所述羧酸组分a)是浓度为0.8M至1.75M的乙酸；
ii)所述卤化物盐组分b)是总浓度为1.0至4.5M的氯化钙和/或溴化钙；并且
iii)所述苯甲酸盐组分c)是浓度为5mM至125mM的苯甲酸盐。
已发现在某些优选实施方案中，组分b)是浓度为0.3M至6M、优选1M至5M、最优选1M至4M的卤化物盐。
这类实施方案适合于用作浮选溶液，这些溶液的密度足够大，使得寄生虫孢子或卵或其他目标生物体漂浮从而便于对它们进行分离和鉴别。
在这类实施方案中，固定剂任选地包含非极性溶质，该溶质增加固定剂溶液的密度至1.1g/ml以上、优选至1.2g/ml以上、最优选为1.2g/ml至1.4g/ml。
优选地，非极性溶质是可溶性碳水化合物，优选糖，优选蔗糖或葡萄糖或果糖或麦芽糖或者其任意组合。
本发明寻求保护的额外的方面提供了用于检查的生物样本的制备方法，该方法包括用如上所定义的水性固定剂溶液将样本固定。
任选地，生物样本是活生物体。任选地，生物样本是寄生虫样本。
在一个优选实施方案中，在固定后将生物样本染色，例如用偶氮染料、或者用碘、或者用三色染色法。也可以使用其他染色剂。
在权利要求中限定了其他优选特征。
在本专利申请的范围内，明确地意图是在前面的段落中、在权利要求中和/或在下面的描述中所陈述的各种方面、实施方案、实施例和替代物以及尤其是其单独特征，可独立地或者以任意组合而采用。也就是说，可以以任何合适的方式和/或组合将所有实施方案和/或任何实施方案或实施例的特征加以组合，除非这种特征是不相容的。申请人保留更改任何最初提交的权利要求或者相应地提交任何新权利要求的权力，包括修改任何最初提交的权利要求并且/或者合并任何其他权利要求的任何特征的权力，尽管最初未以该方式请求专利保护。
具体实施方式
进行了研究以验证根据本发明的固定剂的若干配方的有效性，从而确定其使细胞变性的有效性(即，从传染性的角度看变得无效)并且保持细胞形态达延长。
为实现此目的，使用了三种类型的染色剂，即：
1.鲁戈氏碘染色：用以确定形态；
2.台盼蓝染色：用以确定存活率；
3.三色染色法：是常用的实验室程序。
最初使用蓝氏贾第鞭毛虫(其是在全世界常见的有鞭毛原生动物寄生虫)的活样本，对所有物质进行了测试。其数量上的丰度和精细的内部结构使其成为用于测试的合适候选。也用最可实行的配方(实施例8)对猪鞭虫(Trichuris suis)(鞭虫)的样本进行了测试，主要是用来看所述固定剂是否能够在可接受量的时间内使典型的蠕虫卵变性。
实施例1
用以下配方制备200ml的固定剂：
·185ml蒸馏水
·15ml的冰乙酸(7.5％溶液，1.3M)
·0.06g苯甲酸钠，2mM
·2.22g氯化钙，100mM
实施例2
用以下配方制备200ml的固定剂：
·181ml蒸馏水
·19ml的冰乙酸(9.5％溶液，1.65M)
·0.36g苯甲酸钠，12mM
·3.00g氯化钙，100mM
·4.72g溴化钙
实施例3
用以下配方制备200ml的固定剂：
·181ml蒸馏水
·19ml的冰乙酸(9.5％溶液，1.65M)
·0.36g苯甲酸钠，12mM
·1.8g氯化钙，0.9％
·1.8g溴化钙，0.9％
实施例4
用以下配方制备200ml的固定剂：
·190ml蒸馏水
·10ml的冰乙酸(5％溶液，0.87M)
·0.36g苯甲酸钠，12mM
·1.8g氯化钙，0.9％
·1.8g溴化钙，0.9％
实施例5
用以下配方制备200ml的固定剂：
·181ml蒸馏水
·19ml的冰乙酸(9.5％溶液，1.65M)
·0.36g苯甲酸钠，12mM
·1.8g氯化钙，0.9％
·1.8g溴化钙，0.9％
·0.04g薄荷醇晶体，200μg/ml(大约最大溶解度的一半)
·0.125g麝香草酚，625μg/ml(大约最大溶解度的70％)实施例6
用以下配方制备200ml的固定剂：
·181ml蒸馏水
·19ml的冰乙酸(9.5％溶液，1.65M)
·0.36g苯甲酸钠，12mM
·1.8g氯化钙，0.9％
·1.8g溴化钙，0.9％
·0.02g薄荷醇晶体，100μg/ml(大约最大溶解度的四分之一)
·0.07g麝香草酚，350μg/ml(大约最大溶解度的39％)
实施例7
用以下配方制备200ml的固定剂：
·190ml蒸馏水
·10ml的冰乙酸(5％溶液，0.87M)
·0.36g苯甲酸钠，12mM
·1.8g氯化钙，0.9％
·1.8g溴化钙，0.9％
·0.02g薄荷醇晶体，100μg/ml(大约最大溶解度的四分之一)
·0.07麝香草酚，350μg/ml(大约最大溶解度的39％)
实施例8
用以下配方制备200ml的固定剂：
·185ml蒸馏水
·15ml的冰乙酸(7.5％溶液，1.3M)
·0.36g苯甲酸钠，12mM
·1.8g氯化钙，0.9％
·1.8g溴化钙，0.9％
·0.02g薄荷醇晶体，100μg/ml(大约最大溶解度的四分之一)
·0.07g香草酚，350μg/ml(大约最大溶解度的39％)
实施例9
用以下配方制备200ml的固定剂：
·185ml蒸馏水
·15ml的冰乙酸(7.5％溶液，1.3M)
·0.36g苯甲酸钠，12mM
·1.8g氯化钙，0.9％
·1.8g溴化钙，0.9％
·0.04g薄荷醇晶体，200μg/ml(大约最大溶解度的四分之一)实施例10
用以下配方制备200ml的固定剂：
·185ml蒸馏水
·15ml的冰乙酸(7.5％溶液，1.3M)
·0.36g苯甲酸钠，12mM
·1.8g氯化钙，0.9％
·1.8g溴化钙，0.9％
·0.07麝香草酚，350μg/ml(大约最大溶解度的39％)
实施例11
用以下配方制备200ml的固定剂：
·185ml蒸馏水
·15ml的冰乙酸(7.5％溶液，1.3M)
·0.36g苯甲酸钠，12mM
·1.8g氯化钙，0.9％
·1.8g溴化钙，0.9％
·0.2mlTritonX-100，0.001％
(
表面活性剂的使用取消了ELISA的使用)。
实施例12
接收了活贾第鞭毛虫样本并对形态进行了检查以确保正确的细胞结构等。
将200μl的活贾第鞭毛虫灌输到在微型Parasep
粪便寄生虫浓缩装置内所容纳的每个测试液(3.3ml)中。
用以下执行，一式两份：
a.仅含有固定剂的一个样本(样本1)；和
b.含有与原始粪便的一致样本相混合的固定剂的一个样本(样本2)
紧接着以400g离心达2分钟。然后，从各沉降管的底部取出15μl样本，并放置在加入有15μl台盼蓝染色剂的显微镜载物片上。因为寄生虫孢子的存活率是此步骤的主要目的，所以在加入活贾第鞭毛虫立即将各样本离心，并且在离心后直接地放置。
将各样本放置达24小时，取出然后取出15μl用样本1的鲁戈氏碘和台盼蓝对形态进行检查。
将各样本放置达48小时，然后再一次取出15μl用样本1的鲁戈氏碘对形态进行检查。
将各样本放置达5天，然后再一次取出15μ1用两个样本的鲁戈氏碘对形态进行检查。
对于仍然显示良好形态的所有样本执行三色染色法，其中各样本是取自样本1。
在2个月后，对于经过此节点的所有样本执行进一步的形态测试。
将以上实施例的配方的结果示于下面的表1.0中，连同10％福尔马林、市售固定剂SAF(主要是甲醛，含有甲醇以及≤2％的乙酸)、Alcorfix(含有甲醇、乙醇、异丙醇、硫酸锌和4.8％的乙酸)、PVA(含有甲醇、乙醇和硫酸锌)和Safefix(含有1-(顺式-3-氯丙烯基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物)、以及蒸馏水(作为对照)的比较结果。
表1.0
实施例5至11的固定剂具有特别好的结果，其中实施例8的配方被认为是当前最好的。
本发明的优选水性固定剂溶液可以使用于例如粪便寄生虫浓缩装置。
这类装置是例如商品名为
或
的市售装置，或者是在例如采用本专利申请人的名义公开的WO2017/187165A中所示出的装置。
这类装置通常使用由过滤器隔开的混合室和接收室。
在使用中，将固定剂溶液和粪便样本导入混合室中并在接触的情况下摇动以使样本液化。然后将液化的样本过滤并将滤液(含有例如通过过滤器的卵和寄生虫孢子)收集于接收室中。
所述固定剂溶液确保滤液不是生物有害的。然后，可以在显微镜下对滤液进行检查以鉴定例如卵和寄生虫孢子。
例如，可以使用微型
装置，该装置通常在混合管中保持3.3ml的固定剂溶液。在将混合管用附接到沉降管的立式过滤器加以密封之前，将0.5-1.0g的粪便样本加入到混合管中。然后使样本产生涡旋，倒置并通常以400g离心达2分钟(取决于过滤器的型号)。然后，可以将过滤器和混合管移出并从在沉降管底部发现的球团中取出样本。然后将此样品放置在显微镜载物片上，其中可在检查样本中是否存在生物体之前加入染色剂。
在一些情况下，理想的是固定剂溶液使卵和寄生虫孢子漂浮，以便可以更容易地鉴别它们并从溶液中分离。这种溶液被称为浮选溶液。
这种浮选溶液可以例如使用于如下的微型
装置：
在将混合管用附接到沉降管立式过滤器加以密封之前，将0.5-1.0g粪便样本加入到混合管中。然后使样本产生涡旋，倒置并用手挤压以使容器增压，从而迫使样本进行过滤。在用接种环从液体的顶部取出一层(该液体将保持大部分的寄生卵和寄生虫孢子，如果存在)之前，将溶液静置3分钟。然后将其放置在显微镜载物片上，其中可在检查样本中是否存在寄生生物体之前加入染色剂。
以下的实施例涉及到浮选溶液的配方。固定剂的体积是近似值而各组分的质量和(在冰乙酸的情况下)体积的是准确的。比重值(与纯水相比的密度)也是准确的。
按如下方式制备了一系列的高比重固定剂溶液：
实施例13
用以下配方制备大约500ml的固定剂：
·231.25ml去离子水
·250g蔗糖
·18.75ml的冰乙酸(3.75v/v％溶液，0.66M)
·0.45g苯甲酸钠，0.09％(6.25mM)
·2.25g氯化钙，0.45％(0.041M)
·2.25g溴化钙水合物，0.41％(0.021M)
·0.025g薄荷醇，0.005％
·0.0875g麝香草酚，0.0175％
得到的固定剂的比重为1.265。
此配方是实施例13至28中的最有效的高密度配方中的一个。在此配方的一个变型(实施例28)中，使用较高比例的蔗糖从而将固定剂溶液的比重提高至约1.29。
实施例14
用以下配方制备大约500ml的固定剂：
·231.25ml去离子水
·250g蔗糖
·18.75ml的冰乙酸(3.75v/v％溶液，0.66M)
·1.8g苯甲酸钠，0.36％(25mM)
·40g氯化钙，8.0％(0.72M)
·2.25g溴化钙水合物，0.41％(0.021M)
·0.025g薄荷醇，0.005％
·0.0875g麝香草酚，0.0175％
得到的固定剂的比重为1.245。
实施例15
用以下配方制备大约500ml的固定剂：
·231.25ml去离子水
·230g蔗糖
·18.75ml的冰乙酸(3.75v/v％溶液，0.66M)
·0.5g苯甲酸钠，0.10％(6.9mM)
·60g氯化钙，12.0％(1.08M)
·2.25g溴化钙水合物，0.41％(0.021M)
·0.025g薄荷醇，0.005％
·0.0875g麝香草酚，0.0175％
得到的固定剂的比重为1.272。
实施例16
用以下配方制备大约500ml的固定剂：
·231.25ml去离子水
·200g蔗糖
·18.75ml的冰乙酸(3.75v/v％溶液，0.66M)
·0.5g苯甲酸钠，0.10％(6.9mM)
·60g氯化钙，12.0％(1.08M)
·2.25g溴化钙水合物，0.41％(0.021M)
·0.025g薄荷醇，0.005％
·0.0875g麝香草酚，0.0175％
得到的固定剂的比重为1.297。
实施例17
用以下配方制备大约500ml的固定剂：
·231.25ml去离子水
·180g蔗糖
·18.75ml的冰乙酸(3.75v/v％溶液，0.66M)
·0.25g苯甲酸钠，0.050％(3.5mM)
·80g氯化钙，16.0％(1.44M)
·2.25g溴化钙水合物，0.41％(0.021M)
·0.025g薄荷醇，0.005％
·0.0875g麝香草酚，0.0175％
得到的固定剂的比重为1.324。
实施例18
用以下配方制备大约850ml的固定剂：
·462.5ml去离子水
·200g蔗糖
·37.5ml的冰乙酸(4.4v/v％溶液，0.66M)
·0.50g苯甲酸钠，0.059％(3.5mM)
·390g氯化钙二水合物，34.7％(3.12M)
·4.5g溴化钙水合物，0.48％(0.024M)
·0.050g薄荷醇，0.0059％
·0.175g麝香草酚，0.021％
得到的固定剂的比重为1.310。
实施例19
用以下配方制备大约400ml的固定剂：
·231.25ml去离子水
·50g蔗糖
·18.75ml的冰乙酸(4.7v/v％溶液，0.82M)
·0.25g苯甲酸钠，0.063％(4.33mM)
·250g氯化钙二水合物，47.1％(4.25M)
·2.25g溴化钙水合物，0.52％(0.026M)
·0.025g薄荷醇，0.0063％
·0.0875g麝香草酚，0.022％
得到的固定剂的比重为1.360。
实施例20
用以下配方制备大约450ml的固定剂：
·231.25ml去离子水
·25g蔗糖
·21ml的冰乙酸(4.7v/v％溶液，0.82M)
·0.25g苯甲酸钠，0.055％(3.89mM)
·250g氯化钙二水合物，42.0％(3.78M)
·2.25g溴化钙水合物，0.46％(0.023M)
·0.025g薄荷醇，0.0056％
·0.0875g麝香草酚，0.019％
得到的固定剂的比重为1.330。
实施例21
用以下配方制备大约850ml的固定剂：
·462.5ml去离子水
·360g蔗糖
·37.5ml的冰乙酸(4.4v/v％溶液，0.77M)
·0.50g苯甲酸钠，0.059％(4.08mM)
·200g氯化钙二水合物，17.8％(1.60M)
·4.5g溴化钙水合物，0.49％(0.024M)
·0.050g薄荷醇，0.0059％
·0.175g麝香草酚，0.021％
得到的固定剂的比重为1.308。
实施例22
用以下配方制备大约950ml的固定剂：
·550ml去离子水
·360g蔗糖
·37.5ml的冰乙酸(3.9v/v％溶液，0.69M)
·200g氯化钙二水合物，15.9％(1.43M)
·4.5g溴化钙水合物，0.44％(0.022M)
·0.050g薄荷醇，0.0053％
·0.175g麝香草酚，0.018％
得到的固定剂的比重为1.280。
实施例23
用以下配方制备大约820ml的固定剂：
·500ml去离子水
·280g蔗糖
·37.5ml的冰乙酸(4.5v/v％溶液，0.80M)
·200g氯化钙二水合物，18.4％(1.66M)
·4.5g溴化钙水合物，0.51％(0.025M)
·0.050g薄荷醇，0.0061％
·0.175g麝香草酚，0.021％
得到的固定剂的比重为1.270。
实施例24
用以下配方制备大约800ml的固定剂：
·500ml去离子水
·200g蔗糖
·37.5ml的冰乙酸(4.9v/v％溶液，0.82M)
·240g氯化钙，30.9％(2.70M)
·4.5g溴化钙水合物，0.52％(0.027M)
·0.050g薄荷醇，0.0063％
·0.175g麝香草酚，0.022％
得到的固定剂的比重为1.330。
实施例25
用以下配方制备大约420ml的固定剂：
·231.25ml去离子水
·100g蔗糖
·18.75ml的冰乙酸(4.5v/v％溶液，0.78M)
·0.45g苯甲酸钠，0.11％(7.44mM)
·15g氯化钙，3.57％(0.32M)
·2.25g溴化钙水合物，0.49％(0.025M)
·0.025g薄荷醇，0.0059％
·0.0875g麝香草酚，0.021％
·30g柠檬酸，7.1％(0.037M)
得到的固定剂的比重为1.288。
实施例26
用以下配方制备大约400ml的固定剂：
·250ml去离子水
·100g蔗糖
·20.0ml的冰乙酸(5.0v/v％溶液，0.87M)
·0.45g苯甲酸钠，0.11％(7.44mM)
·90g氯化钙，22.5％(2.03M)
·2.25g溴化钙水合物，0.52％(0.026M)
·0.025g薄荷醇，0.0063％
·0.0875g麝香草酚，0.022％
·60g柠檬酸，15.0％(0.78M)
得到的固定剂的比重为1.296。
实施例27
用以下配方制备大约420ml的固定剂：
·250ml去离子水
·50g蔗糖
·20.0ml的冰乙酸(4.8v/v％溶液，0.83M)
·0.45g苯甲酸钠，0.11％(7.44mM)
·200g氯化钙二水合物，36.0％(3.24M)
·2.25g溴化钙水合物，0.49％(0.025M)
·0.025g薄荷醇，0.0059％
·0.0875g麝香草酚，0.021％
·60g柠檬酸，14.3％(0.74M)
得到的固定剂的比重为1.337。
实施例28
用以下配方制备大约5100ml的固定剂：
·2300ml去离子水
·3750g蔗糖
·375ml的冰乙酸(7.4v/v％溶液，1.3M)
·4.5g苯甲酸钠，0.88％(6.1mM)
·60g氯化钙，1.2％(0.11M)
·30g溴化钙水合物，0.59％(0.027M)
·0.25g薄荷醇，0.049％
·0.875g麝香草酚，0.017％
得到的固定剂的比重大约为1.29。
该SG(比重)配方是实施例14至28的最优选的。
卤化镁可代替各实施例中的卤化钙。
可以认为，如果改变各实施例中的乙酸浓度达约±0.3M或更多则将会获得相似的结果，并且在如权利要求中所限定的较宽范围内将会获得可接受的结果。可以认为，如果改变各实施例中剩余组分的浓度达到其陈述值的至少±10％、有可能±20％或更多则将会获得相似的结果，以及在较大范围的浓度中将会获得可接受的结果。
一般来说，卤化物盐浓度的上限是仅由各特定盐在固定剂溶液中的溶解度来设定。
Claims (23)
1.一种用于生物样本的水性固定剂溶液，其包含：
a)浓度为0.5M或更大的C2至C6羧酸；
b)浓度为0.02M或更大、优选0.04M或更大的C2至C6羧酸盐或卤化物盐。
2.根据权利要求1所述的水性固定剂溶液，其中所述C2至C6羧酸是乙酸。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的水性固定剂溶液，其中C2至C6羧酸的浓度为0.9M或更大。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的水性固定剂溶液，其中C2至C6羧酸的浓度为1.3M或更大。
5.根据权利要求2所述的水性固定剂溶液，其中乙酸的浓度低于10％w/v。
6.根据前述权利要求中任一项所述的水性固定剂溶液，其中组分b)是卤化钙盐或卤化镁盐。
7.根据权利要求6所述的水性固定剂溶液，其中组分b)包含浓度为至少0.06M、优选至少0.08M、更优选至少0.1M的氯化钙，和/或浓度为至少0.06M、优选至少0.08M、更优选至少0.1M的溴化钙。
8.根据前述权利要求中任一项所述的水性固定剂溶液，其中组分b)是浓度为0.3M至6M、优选1M至5M、最优选1M至4M的卤化物盐。
9.根据前述权利要求中任一项所述的水性固定剂溶液，还包含非极性溶质，所述非极性溶质增加固定剂溶液的密度至1.1g/ml以上、选选至1.2g/ml以上、最优选1.2g/ml至1.4g/ml。
10.根据权利要求9所述的水性固定剂溶液，其中所述非极性溶质是可溶性碳水化合物，优选糖，更优选蔗糖或葡萄糖或果糖或麦芽糖或它们的任意组合。
11.根据前述权利要求中任一项所述的水性固定剂溶液，还包含：抑制细菌或抑制真菌浓度的苯甲酸或山梨酸或者它们的盐。
12.根据前述权利要求中任一项所述的水性固定剂溶液，还包含：d)浓度为至少50μg/ml的生物杀灭精油组分。
13.根据权利要求12所述的水性固定剂溶液，其中所述生物杀灭精油组分d)是以下项中的一种或多种：薄荷醇、麝香草酚、长叶薄荷醇、二氢香芹醇、胡椒醇、薄荷酮、薄荷烯、邻异丙基甲苯、对异丙基甲苯、香茅醛、香芹酚、丁香油酚、4-香芹-薄荷醇(萜品烯-4-醇)、蒜素或樟脑。
14.根据权利要求12所述的水性固定剂溶液，其中所述生物杀灭精油组分d)包含薄荷醇和麝香草酚。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的水性固定剂溶液，其中：
i)所述羧酸组分a)是浓度为0.8M至1.75M的乙酸；
ii)所述卤化物盐组分b)是浓度为70至100mM的氯化钙加上浓度为30mM至50mM的溴化钙；并且
iii)所述苯甲酸盐组分c)是浓度为5mM至15mM的苯甲酸盐。
16.根据权利要求12至14中任一项所述的水性固定剂溶液，其中：
i)所述羧酸组分a)是浓度为1.2M至1.75M的乙酸；
ii)所述卤化物盐组分b)是浓度为70至100mM的氯化钙加上浓度为30mM至50mM的溴化钙；并且
iii)所述苯甲酸盐组分c)是浓度为5mM至15mM的苯甲酸盐。
17.根据权利要求12至14中任一项所述的水性固定剂溶液，其中：
iv)所述羧酸组分a)是浓度为0.8M至1.75M的乙酸；
v)所述卤化物盐组分b)是总浓度为1.0至4.5M的氯化钙和/或溴化钙，并且
vi)所述苯甲酸盐组分c)是浓度为5mM至125mM的苯甲酸盐。
18.一种制备用于检查的生物样本的方法，所述方法包括用如前述权利要求中任一项所要求保护的水性固定剂溶液将样本固定。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述生物样本是活生物体。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述生物样本是寄生虫样本。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述水性固定剂溶液的密度足以使卵或幼体或寄生虫孢子或卵囊漂浮于所述寄生虫样本中，并且优选在1.2g/ml至1.4g/ml、更优选1.25g/ml至1.35g/ml的范围内。
22.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中在固定后将所述生物样本染色。
23.根据权利要求22所述的方法，其中用偶氮染料、或者用碘、或者用三色染色法将所述生物样本染色。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1813255.5 | 2018-08-14 | ||
| GB1813255.5A GB2576331B8 (en) | 2018-08-14 | 2018-08-14 | Fixative solution and method of preparation of biological sample for examination |
| PCT/GB2019/052287 WO2020035688A1 (en) | 2018-08-14 | 2019-08-14 | Fixative solution and method of preparation of biological sample |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112867914A true CN112867914A (zh) | 2021-05-28 |
Family
ID=63667043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980066904.5A Withdrawn CN112867914A (zh) | 2018-08-14 | 2019-08-14 | 固定剂溶液及生物样本的制备方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210341361A1 (zh) |
| EP (1) | EP3821225B1 (zh) |
| CN (1) | CN112867914A (zh) |
| AU (1) | AU2019322103B2 (zh) |
| ES (1) | ES2954573T3 (zh) |
| GB (1) | GB2576331B8 (zh) |
| PL (1) | PL3821225T3 (zh) |
| WO (1) | WO2020035688A1 (zh) |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3997656A (en) * | 1973-06-25 | 1976-12-14 | Applied Bioscience | Tissue staining method and composition |
| US5260048A (en) | 1991-05-08 | 1993-11-09 | Streck Laboratories, Inc. | Tissue fixative solution and method |
| AU770643B2 (en) * | 1998-08-28 | 2004-02-26 | Uropath Pty Ltd | Method of diagnosis of prostate cancer |
| KR100436835B1 (ko) * | 2001-05-18 | 2004-06-26 | 대한민국 | 액침생물표본 체색조성물 및 상기 조성물을 이용한 액침생물표본 체색복원 및 보존방법 |
| FR2884144B1 (fr) * | 2005-04-07 | 2008-04-11 | Eric Peltier | Combinaison d'un fixateur histologique ou cytologique, et d'un ou plusieurs composes photoactivables de la famille des quinones, en particulier l'hypericine, l'hypocrelline a et l'hypocrelline b. |
| GB2528426A (en) | 2014-02-11 | 2016-01-27 | Apacor Ltd | Fixative solution for materials or samples of biological origin |
| JP6316935B2 (ja) * | 2014-02-28 | 2018-04-25 | シスメックス株式会社 | 尿試料分析方法及び尿試料分析用試薬キット |
| CN106596211A (zh) * | 2015-10-15 | 2017-04-26 | 深圳华大基因研究院 | 粪便样本保存液及其制备方法和应用 |
| GB2549732A (en) | 2016-04-26 | 2017-11-01 | Apacor Ltd | Filter apparatus and filter device for biological samples |
| CN106855475A (zh) * | 2017-03-18 | 2017-06-16 | 王瑞才 | 一种用于病理切片的快速组织处理试剂 |
-
2018
- 2018-08-14 GB GB1813255.5A patent/GB2576331B8/en active Active
-
2019
- 2019-08-14 CN CN201980066904.5A patent/CN112867914A/zh not_active Withdrawn
- 2019-08-14 AU AU2019322103A patent/AU2019322103B2/en active Active
- 2019-08-14 ES ES19758464T patent/ES2954573T3/es active Active
- 2019-08-14 EP EP19758464.2A patent/EP3821225B1/en active Active
- 2019-08-14 WO PCT/GB2019/052287 patent/WO2020035688A1/en unknown
- 2019-08-14 US US17/267,168 patent/US20210341361A1/en active Pending
- 2019-08-14 PL PL19758464.2T patent/PL3821225T3/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2019322103B2 (en) | 2023-03-30 |
| PL3821225T3 (pl) | 2023-11-27 |
| EP3821225A1 (en) | 2021-05-19 |
| GB2576331B8 (en) | 2021-04-07 |
| US20210341361A1 (en) | 2021-11-04 |
| WO2020035688A1 (en) | 2020-02-20 |
| GB2576331A (en) | 2020-02-19 |
| AU2019322103A1 (en) | 2021-04-08 |
| GB2576331A8 (en) | 2021-04-07 |
| EP3821225B1 (en) | 2023-07-05 |
| EP3821225C0 (en) | 2023-07-05 |
| GB201813255D0 (en) | 2018-09-26 |
| ES2954573T3 (es) | 2023-11-23 |
| GB2576331B (en) | 2021-03-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Weisse et al. | Niche separation in common prostome freshwater ciliates: the effect of food and temperature | |
| Amachree et al. | Comparison of intermittent and continuous exposures to cadmium in the blue mussel, Mytilus edulis: accumulation and sub-lethal physiological effects | |
| de Souza et al. | Effects of carvacrol on oocyte development in semi-engorged Rhipicephalus sanguineus sensu lato females ticks (Acari: Ixodidae) | |
| Szalaj et al. | The effects of ocean acidification and a carbon dioxide capture and storage leak on the early life stages of the marine mussel Perna perna (Linneaus, 1758) and metal bioavailability | |
| Garrote-Moreno et al. | Short-term impacts of salinity pulses on ionic ratios of the seagrasses Thalassia testudinum and Halodule wrightii | |
| Amachree et al. | Comparison of intermittent and continuous exposures to inorganic mercury in the mussel, Mytilus edulis: Accumulation and sub-lethal physiological effects | |
| KR101924401B1 (ko) | 구강상피세포 보존액과 이의 제조방법 | |
| Palhares et al. | Effect of melatonin supplementation to a cytoprotective medium on post-thawed Brycon orbignyanus sperm quality preserved during different freezing times | |
| CN102791124B (zh) | 用于生物细胞的固定溶液 | |
| Gomes et al. | Equilibrium reproductive strategy of the armored catfish Hypostomus auroguttatus (Siluriformes, Loricariidae) in a tropical river in Southeastern Brazil | |
| CN112867914A (zh) | 固定剂溶液及生物样本的制备方法 | |
| Al Malahi et al. | Ameliorative effect of L-carnitine on lambda-cyhalothrin-induced anatomical and reproductive aberrations in albino mice | |
| da Silva Santarossa et al. | Contamination of fee-fishing ponds with agrochemicals used in sugarcane crops | |
| El-Murr et al. | The β-1, 3-glucan alleviated the hepatotoxicity induced by combination of fipronil and lead in common carp (Cyprinus carpio) | |
| Badylak et al. | Akashiwo sanguinea (Dinophyceae) extruding mucous from pores on the cell surface | |
| RM et al. | Impact of engineered nano silver on plant parasitic nematode and measurement of DNA damage | |
| Vergilio et al. | Histopathological effects of mercury on male gonad and sperm of tropical fish Gymnotus carapo in vitro | |
| de Assis et al. | Aluminum at environmental concentrations affects the sperm quality of the freshwater teleost Astyanax altiparanae: An in vitro study | |
| Cannavacciuolo et al. | A cold bath for a formalin-free laboratory: alternative fixative methods in early developmental stages of the sea urchin Paracentrotus lividus (Lamarck, 1816) | |
| JP7168141B2 (ja) | 生体試料の透明化方法及び生体試料脱色剤 | |
| Hamed et al. | Protective effect of vitamin C against thiamethoxam-induced toxicity in male rats | |
| Akhter et al. | Effects of Fenitrothion on some histo-architecture of freshwater fish Channa punctatus | |
| Wijaya et al. | Study of the impact of heavy metal (Cd, Pb and Hg) contamination in Wedung waters, Demak on Anadara granosa (Linnaeus, 1758). | |
| Yasuda et al. | Optimization of blends of synthetic sex pheromone components for attraction of the sorghum plant bug Stenotus rubrovittatus (Matsumura)(Heteroptera: Miridae) | |
| Chen et al. | An Adjuvant that Increases the Adhesion and Persistence of Pesticides on Plant Surfaces and Improves the Efficiency of Pest Control: Polyethylene Glycol Sol-Gel Polymer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20210528 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |