CN112852965A

CN112852965A - lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN112852965A
Application number: CN202110307786.1A
Authority: CN
Inventors: 王国华; 孙祥琳; 周佳敏; 张馨予; 吴昊; 杨欢; 姜正林
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2021-03-23
Filing date: 2021-03-23
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2041-03-23
Also published as: CN112852965B

Abstract

本发明公开了lnc‑ZNF100‑5功能性表达抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用，属于生物医药技术领域。所述lnc‑ZNF100‑5功能性表达抑制剂为RNAi、shRNA慢病毒、sgRNA、ZFN、TALEN元件或同源重组载体。本发明通过lnc‑ZNF100‑5在乳腺癌细胞中的表达明显升高，可以用于乳腺癌的检测，建立了体外lnc‑ZNF100‑5敲除乳腺癌细胞模型、体内lnc‑ZNF100‑5敲乳腺癌除原位移植瘤模型系列实验研究，阐述了lnc‑ZNF100‑5可明显抑制乳腺癌细胞的增殖能力，并且明显促进乳腺癌细胞的调亡，敲除lnc‑ZNF100‑5可用于预防或治疗乳腺癌，从而可制备lnc‑ZNF100‑5功能性表达抑制剂治疗乳腺癌。

Description

lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

背景技术

世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布了2020年全球最新癌症负担数据：2020年全球新发癌症病例1929万例。其中一个最明显的变化是乳腺癌新发病例数的快速增长达226万，首次正式取代肺癌(220万)成为全球第一大癌症，占所有新增癌症患者的11.7%。乳腺癌是严重威胁全世界女性健康的第一大恶性肿瘤。在每年新发乳腺癌病例中，约3%-10%的妇女在确诊时即有远处转移。早期患者中，30%可发展为晚期乳腺癌，晚期乳腺癌患者5年生存率仅为 20%。而乳腺癌细胞在化疗过程中产生的耐药会导致很多患者在化疗后仍会出现在短期内复发或转移。

最近的研究表明在哺乳动物基因组中只有不到2%的基因能够编码蛋白，其它大约98%的基因都编码成非编码RNA。非编码RNA根据其长度，一般分为两类，一类为非编码小RNA(sncRNA，Small non-coding RNA)，其转录长度少于200个核苷酸，另一类为长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)，被广泛的定义为转录长度超过200个核苷酸并且没有表观编码能力的RNA。LncRNA具有复杂的二级结构、三级结构，能够与蛋白质、RNA、DNA结合，因此lncRNA为miRNA、mRNA、蛋白质或者其复合物进行复杂的相互作用提供了平台。目前越来越多的证据显示，lncRNA在基因转录、转录后调控、RNA剪切、翻译、表观遗传调控等过程中都发挥着重要作用，并与乳腺癌的生物学行为关系密切。大量的研究所示，肿瘤细胞中某些特定lncRNA的表达水平发生异常改变，这种异常表达的lncRNA能够作为肿瘤诊断的分子标记物和潜在的药物靶点。但是目前lncRNA还处于起步阶段，且只有少数与癌症相关的lncRNA被报道出来。研究与乳腺癌相关的lncRNA，对于实现有效预防和治疗乳腺癌，以及精准医疗具有重要的意义。

发明内容

本发明通过荧光定量PCR 检测到lnc-ZNF100-5在乳腺癌细胞中的表达明显升高，故检测lnc-ZNF100-5的表达水平可用于诊断乳腺癌。本发明通过体外慢病毒稳定转染实验敲除lnc-ZNF100-5可明显抑制乳腺癌细胞的增殖能力，并且明显促进乳腺癌细胞的调亡。同时建立体内lnc-ZNF100-5敲乳腺癌除原位移植瘤模型，结果与体外试验一致。因此，敲除lnc-ZNF100-5可用于预防或治疗乳腺癌，为乳腺癌的治疗提供新的思路和方案。

为此，本发明的目的在于研究lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂用于制备预防或治疗乳腺癌的药物组合物，lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂为针对lnc-ZNF100-5的RNAi、针对lnc-ZNF100-5的shRNA慢病毒、针对lnc-ZNF100-5的sgRNA（配合CRRSPR/Cas9使用）、针对lnc-ZNF100-5的ZFN（配合ZFN技术使用）、针对lnc-ZNF100-5的TALEN元件（配合TALEN技术使用）、或者针对lnc-ZNF100-5的同源重组载体（利用Cre/LoxP系统或来自酵母的FLP-frt系统），以及包括与抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体，包括：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

本发明通过lnc-ZNF100-5在乳腺癌细胞中的表达明显升高，可以用于乳腺癌的检测，建立了体外lnc-ZNF100-5敲除乳腺癌细胞模型、体内lnc-ZNF100-5敲乳腺癌除原位移植瘤模型系列实验研究，阐述了lnc-ZNF100-5可明显抑制乳腺癌细胞的增殖能力，并且明显促进乳腺癌细胞的调亡，敲除lnc-ZNF100-5可用于预防或治疗乳腺癌，从而可制备lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂治疗乳腺癌。

附图说明

图1为实施例1中荧光定量PCR检测lnc-ZNF100-5在正乳腺癌细胞MCF-7，MDA-MB-231中的表达情况。

图2 为实施例2中肿瘤图及肿瘤体积统计图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

本发明主要解决的技术问题是提供了lnc-ZNF100-5功能性表达的抑制剂用于制备预防或治疗乳腺癌的药物组合物的用途，并为乳腺癌的治疗提供指导方案。所述抑制剂是针对lnc-ZNF100-5的 RNAi。

所述lnc-ZNF100-5的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

lnc-ZNF100-5的RNAi序列（正义链，反义链，5'→3）为：

UGUUCUUUGUGCACUUUACAC（SEQ ID NO .4）；

GUAAAGUGCACAAAGAACAUG（SEQ ID NO .5）。

建立了体外乳腺癌细胞培养体系模拟人体内环境。通过临床相关数据库分析各基因的相关性，最终发现lnc-ZNF100-5在乳腺癌细胞中高表达，故选定进入下一步的实验。在之后建立了体外lnc-ZNF100-5敲除乳腺癌细胞模型、体内lnc-ZNF100-5敲乳腺癌除原位移植瘤模型系列实验研究，从而研究制备lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂。

其中乳腺癌细胞选用的是MCF-7 / MDA-MB-231细胞。

之前的多篇文献表明，现有技术中实现乳腺癌早发现早治疗仍是提高乳腺癌患者预后效果的重要途径，并且目前对乳腺癌精准治疗药物研究较少。因此，本发明提供了lnc-ZNF100-5在乳腺癌细胞中的表达明显上调，可用于检测乳腺癌。

实施例1

本发明设计了针对lnc-ZNF100-5在乳腺癌细胞中的表达实验，旨在发现lnc-ZNF100-5是否在乳腺癌细胞中为高表达。通过荧光定量PCR检测乳腺癌细胞MCF-7，MDA-MB-231中lnc-ZNF100-5的表达情况。具体实验步骤如下：

荧光定量PCR实验步骤：

1、应用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，USA)从细胞和组织样品中取总RNA。

吸尽6孔板中乳腺癌细胞MCF-7，MDA-MB-231细胞的培养液，每孔加入1ml Trizol，使其覆盖细胞，再用吸管或加样器吹打3次，细胞应完全裂解，然后转移至离心管中。

在装有裂解物的离心管中加入0.2mL的氯仿(1mL Trizol加入0.2mL氯仿)，振荡器上充分振荡混匀20 秒，室温放置5分钟。12000 rpm 4℃离心10分钟，然后吸取含总RNA的上层水相至一新的离心管中，每毫升Trizol约可吸取0.6mL上层水相。有机相和中间层含有DNA和蛋白质，应避免触及。

加入和上层水相等体积的异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀5分钟。12000 rpm 4℃ 离心15分钟，在管底可见RNA沉淀。弃上清，按每毫升Trizol加入1mL 75%乙醇，轻轻颠倒混匀，以清洗RNA沉淀。12000 rpm 4℃离心2分钟，弃去液体，小心勿丢弃RNA沉淀。室温倒置晾干 5-10分钟。

溶解：加入适量DEPC处理水使RNA沉淀溶解。存放于-80℃。

2、应用M-MLV逆转录酶合成第一链cDNA。

3、在总体积为 20μL的SYBR Green PCR Master Mix(Roche，Germany)中进行实时定量 PCR(qPCR)。所有反应均一式两份进行。使用2–△△CT法方法计算lnc-ZNF100-5的相对表达量。用于磷酸化AKT的PCR引物在Invitrogen 合成。GAPDH作为内参照。lnc-ZNF100-5引物序列如下表所示。

表1 lnc-ZNF100-5引物序列

结果如图1所示，lnc-ZNF100-5 在乳腺癌细胞中的表达明显上调，而且在高侵袭性细胞MDA-MB-231中的表达量相对较高，在低侵袭性细胞MCF-7中的表达量相对较低。

实施例2

据文献报道，除shRNA慢病毒外，还有多中技术手段可以同样实现制lnc-ZNF100-5的功能性表达，或抑制涉及lnc-ZNF100-5的下游的物质功能性表达，进而起到抑制lnc-ZNF100-5用于预防或治疗乳腺癌的功能。这些技术手段包括但不限于其他RNAi技术(通过其他siRNA抑制lnc-ZNF100-5的功能性表达)、成簇规律间隔短回文重复(CRRSPR)技术(使用一段序列特异性向导RNA分子(sequence-specific guide RNA，sgRNA)引导核酸内切酶到靶点处，从而完成基因组的编辑，特别的以CRISPR/Cas9技术为代表)、锌指核酸酶(ZFN)技术(通过加工改造ZFN的锌指DNA结合域，靶向定位于不同的DNA序列)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)技术(通过DNA识别模块将TALEN元件靶向特异性的DNA位点并结合，然后在FokI核酸酶的作用下完成特定位点的剪切，并借助于细胞内固有的同源定向修复(HDR)或非同源末端连接途径(NHEJ)修复过程完成特定序列的插入(或倒置)、删失及基因融合、利用同源重组载体敲除基因的技术(如 Cre/LoxP系统或来自酵母的FLP-frt系统，利用基因同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的) 。

因此，本发明的目的在于研究lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂用于制备预防或治疗乳腺癌的药物组合物，lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂为针对lnc-ZNF100-5的RNAi、针对lnc-ZNF100-5的shRNA慢病毒、针对lnc-ZNF100-5的sgRNA（配合CRRSPR/Cas9使用）、针对lnc-ZNF100-5的ZFN（配合ZFN技术使用）、针对lnc-ZNF100-5的TALEN元件（配合TALEN技术使用）、或者针对lnc-ZNF100-5的同源重组载体（利用Cre/LoxP系统或来自酵母的FLP-frt系统），以及包括与抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体，包括：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。

本发明通过shRNA慢病毒转染乳腺癌细胞，成功敲除lnc-ZNF100-5并构建为表达能力高的稳转细胞株进行体外实验，同时建立体内lnc-ZNF100-5敲乳腺癌除原位移植瘤模型，结果均显示可明显抑制乳腺癌细胞的增殖能力，增殖能力明显减弱，且明显促进乳腺癌细胞的调亡，细胞凋亡量增加。表明敲除lnc-ZNF100-5可有效用于预防或治疗乳腺癌。

具体实验步骤如下：

为了进一步研究lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂用于制备预防或治疗乳腺癌的药物组合物，我们建立了体外lnc-ZNF100-5敲除乳腺癌细胞模型、体内lnc-ZNF100-5敲乳腺癌除原位移植瘤模型系列实验研究，从而去验证敲除lnc-ZNF100-5是否能够抑制乳腺肿瘤的生长，且同时促进乳腺癌细胞凋亡。为此，将三组雌性BALB/C裸鼠予以成功敲除lnc-ZNF100-5并构建为表达能力高的稳转MDA-MB-231细胞株行背部皮下注射法。三组裸鼠均成瘤，通过游标卡尺定期测量裸鼠原位移植瘤的长径及短径，成瘤时间平均为10天，根据瘤体体积绘制生长曲线。待小鼠自然死亡或成瘤后20天断颈处理小鼠，取瘤称重。

结果如图2所示，敲除lnc-ZNF100-5的转染病毒组（siRNA-nc-ZNF100-5组）肿瘤体积显著低于空载组（siRNA-NC）和空白对照组（Control组）（p<0.01），提示敲除lnc-ZNF100-5后对乳腺癌治疗作用意义。因此，敲除lnc-ZNF100-5可明显抑制乳腺癌细胞的增殖能力，增殖能力明显减弱，且明显促进乳腺癌细胞的调亡，细胞凋亡量增加。表明敲除lnc-ZNF100-5可有效用于预防或治疗乳腺癌。同时，为研究lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂用于制备预防或治疗乳腺癌的药物组合物提供重要依据。

本发明的研究结果将为乳腺癌的药物研究及其精准治疗提供新的思路，将在促进人类的健康事业方面发挥重要的作用。

序列表

<110> 南通大学

<120> lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用

<130> 20210322

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 565

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatgtaaaaa aaaatctagt tttgacaaat gtattggaaa taggtcttgg cttgccactg 60

cacttcttta gagattgaac aactgatcat gggatatgat gtaacaagac ctgaaatatc 120

cattatgaat tgcatgttat gagatctact ggaaaatagc atggtataca cagttgctgt 180

agacaagtaa ggaacactgg tctataggcc atcaagctga agcacgtgct atgggcacaa 240

aaaggttgca tgtagaggtg actcagacct ccatggcacc tacctccatg cattgccacc 300

tttcaaccca caactgaggc cctattggtg tttcttatta acagatggta aggctccagc 360

agaaagacat tggcaagtgt tagaggaaaa gaggaaagtt tatccaaaag ttttatggaa 420

atccccagaa gaaggacaat ggaaagatcc agtggattta ctgatgagaa gacaaggtta 480

tactcgtgtt tttacaggag atggacaaac cgtgtggatg ccctcaaggt gcatgagacc 540

atggaatggg agactggagg aaccc 565

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggcacaa aaaggttgca t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtgggttga aaggtggcaa 20

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uguucuuugu gcacuuuaca c 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

guaaagugca caaagaacau g 21

Claims

1.检测非编码LncRNA分子lnc-ZNF100-5的试剂在制备乳腺检测试剂中的应用，所述lnc-ZNF100-5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测非编码LncRNA分子lnc-ZNF100-5的试剂包括引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

3.lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂为RNAi、shRNA慢病毒、sgRNA、ZFN、TALEN元件或同源重组载体。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述治疗乳腺癌的药物还包括与抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体。