CN112844259B - 一种基于双水相的双液核水凝胶微囊制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于双水相的双液核水凝胶微囊制备方法。该方法包括微流控芯片的制备、体系的构建、微囊的制备与条件优化等。本发明利用可自发相分离的双水相成分，通过调节体系成分的浓度和流速可稳定形成尺寸可调、大小均一、形貌可控的双液核水凝胶微囊。该技术有望在响应性材料制备、单细胞配对、细胞共培养、药物共负载等化学生物学应用中发挥作用。

Description

一种基于双水相的双液核水凝胶微囊制备方法
技术领域
本发明属于微流控技术、生物材料、药物化学等领域，尤其涉及一种基于双水相的多液核水凝胶微囊制备方法。
背景技术
微流控技术涵盖的一个重要分支是微流控液滴操控技术，利用流体间不同性质(浓度、界面能等)来获得尺寸均一可控的液滴，竟而灵活实现液滴的捕获、融合、分选等操作。该技术已经在生物材料、组织工程、细胞分析与检测等领域得到了广泛的应用。
水凝胶微囊由于其固有的微孔性,生物相容性,相似天然细胞外基质，目前已经在生物学、再生医学、材料化学等领域引起了广泛关注。目前水凝胶微囊使用最多的是核壳状的水凝胶微囊，充分利用了微囊特有的性质已作为3D微载体，广泛用于药物的可控释放与合成、细胞负载、物质萃取等方面。但由于单核的水凝胶微囊只能实现物质在核内的单一负载，很难实现多种物质在不同核内的分区负载，目前，也有文献报道利用微流控技术采用油-水-油(O/W/O)双乳化体系甚至是多级乳化的方式制备的含多个液核的水凝胶微囊，但其共性是液核为油负载，对于液核是水溶液的水凝胶微囊的制备仍是一个挑战。
近年来，双水相体系是广大科研工作者关注的一个热点。双水相体系，是由一个全水体系，它是由两种不同性质的水溶液组成的，当两种水溶液相互混合时，体系的界面能高于混合的吉布斯自由能，从而产生发生相分离的现象。本发明提供了一种基于双水相的多液核水凝胶微囊制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于双水相的多液核水凝胶微囊制备方法。
本发明多液核水凝胶微囊的核均为水溶液，壳为水凝胶。
本发明提供了一种基于双水相的双液核水凝胶微囊制备方法，采用微流控芯片，利用可自发相分离的双水相体系，改变核流速、壳流速和连续相流速来调节双液核水凝胶微囊的尺寸大小，包括液核腔的大小和微囊整体大小；稳定形成尺寸可调、大小均一、形貌可控的双液核水凝胶微囊，所形成双液核水凝胶微囊的核均为水溶液，壳为水凝胶。
所述微流控芯片具体如下：
该芯片利用常规软光刻的方法制成，由芯片上层、芯片中间层和芯片下层键合而成的三层PDMS芯片,芯片中间层为功能芯片，芯片下层是没有结构的芯片；
芯片上层主要由核流体入口3，壳流体入口2，连续相入口1，核流体分流口4，壳流体分流口5组成；
芯片中间层主要由连续相入口6，连续相通道11，核流体入口9，壳流体入口7，核通道10，壳通道8，层流通道12，主通道13和反应通道14，流体出口15组成；
所述芯片上层的核流体分流口4与芯片中间层的核流体入口9相通；
所述芯片上层的壳流体分流口5与芯片中间层的壳流体入口7相通；
所述芯片上层的连续相入口1与芯片中间层的连续相入口6相通。
通道10的个数为2、壳通道8的个数为3，行成双液核。
核流体从核流体入口3分别通过核流体分流口4进入核流体入口9，经过核通道10流入层流通道12；壳流体从壳流体入口2分别通过壳流体分流口5，经过芯片中间层的壳流体入口7，进入壳通道8，最终流入层流通道12；连续流从连续相入口1通过中间层连续相入口6经连续相通道11流入主通道13；核流体，壳流体，连续流体最终均通过通道13和反应通道14，制备的双液核水凝胶微囊从流体出口15流出并收集。
所述双水相体系的构建如下：
基于双水相聚乙二醇(PEG)-葡聚糖(Dex)体系，为了产生双液核水凝胶微囊，核流体成分为Dex；
壳流体为PEG、海藻素钠(NaA)和乙二胺四乙酸钙二钠(Ca-EDTA)组成的混合物；
连续相为矿物油、醋酸(HAc)和司班80(Span 80)的混合物。
所述芯片层流通道12宽度为100-600μm，高为100-500cm；主通道13宽度为100-500μm，高为50-500cm；核通道10与壳通道8宽度为20-200μm，高为20-200μm；连续相通道11宽度为100-400μm，高为50-300cm。
本发明一种基于双水相的双液核水凝胶微囊制备方法，包括以下步骤：
(1)微流控芯片的制备:该芯片利用常规软光刻的方法而成的三层PDMS芯片(上层、中间层、下层)键合而成的，上层采用了分流的设计，由简避繁，避免了多个泵装置同时使用的局限,中间层为功能芯片，下层是没有结构的芯片。该芯片上层主要由核流体入口，壳流体入口，连续相入口，核流体分流口，壳流体分流口，中间层主要由连续相入口，连续相通道，核流体入口，壳流体入口，核通道，壳通道，层流通道，主通道和反应通道，流体出口组成；核流体从核流体入口分别通过核流体分流口进入核流体入口，经过核通道流入层流通道；壳流体从壳流体入口分别通过壳流体分流口，经过壳通道流入层流通道；连续流从连续相入口通过中间层连续相入口经连续相通道流入主通道；核流体，壳流体，连续流体最终均通过通道和反应通道，制备的双液核水凝胶微囊从流体出口流出并收集。
(2)体系的构建:基于双水相聚乙二醇(PEG)-葡聚糖(Dex)体系，具备极好的生物相容性。为了产生双液核水凝胶微囊，核流体成分为Dex,壳流体成分为PEG、海藻素钠(NaA)和乙二胺四乙酸钙二钠(Ca-EDTA)，连续相成分为矿物油、醋酸(HAc)和Span 80，采用油作为连续相是为了将双水截断形成稳定的液滴，HAc的加入是为了采用内固化的方式，与壳流体中的Ca-EDTA反应充分释放钙离子，钙离子与海藻酸钠反应形成海藻酸钙水凝胶，最终形成含有2个液核的水凝胶微囊。
所述PEG分子量范围：8-20kDa、浓度范围：10-50％；Dex分子量范围：70k-500kDa、浓度范围：10-35％；所述NaA浓度范围：0.1-2％，Ca-EDTA使用的浓度范围：0.5-2.5％，HAc的浓度范围0.05-0.25％，Span 80浓度范围为1％-5％。
(3)微囊的制备与条件优化:将核、壳、连续相流体分别从核、壳、连续相流体入口通入微流控芯片，通过改变核流速、壳流速和连续相流速来调节双液核水凝胶微囊的尺寸大小，包括液核腔的大小和微囊整体大小；核流速范围：0.01-2.0μL/min,壳流速范围：1-10μL/min，连续相流速范围：10-60μL/min。
本发明可以可控形成多液核水凝胶微囊，通过调节核流体、壳流体、连续流的流速等得到稳定均一的多液核水凝胶微囊。微囊尺寸均一、形貌可控，有望在蛋白质分离、细胞分区化培养、药物共装载等生物学应用中发挥作用。
附图说明
图1是制备双液核水凝胶微囊芯片示意图，其中：a芯片整理结构示意图；b上层芯片示意图，c中间层芯片示意图，d下层芯片示意图。
其中1为上层连续相入口，2壳流体入口，3核流体入口，4核流体分流口，5壳流体分流口，6中间层连续相入口，7中间层壳流体入口，8壳通道，9中间层核流体入口，10核通道，11连续相通道，12层流通道，13主通道，14反应通道，15流体出口。
图2是实施例1中制备双液核水凝胶微囊的明场图片(Scale bar:200μm)。
图3是实施例2中制备双液核水凝胶微囊的扫面电镜图，其中：a双液核水凝胶微囊的整体图，b双液核水凝胶微囊的局部图(Scale bar:50μm)。具体实施方式
结合实际需要，设计加工出双液核的水凝胶微囊芯片；选择合适的体系，包括试剂的成分、浓度、分子量等；调节核流速、壳流速、连续相流速等参数，制备出所需要的双液核的水凝胶微囊。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种基于双水相的双液核水凝胶微囊制备方法。双液核水凝胶微囊的核均为水溶液，壳为水凝胶。
一种基于双水相的双液核水凝胶微囊制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)微流控芯片的制备:该芯片利用常规软光刻的方法而成的三层PDMS芯片(上层、中间层、下层)键合而成的，上层采用了分流的设计，由简避繁，避免了多个泵装置同时使用的局限,中间层为功能芯片，下层是没有结构的芯片。芯片结构示意图如图1所示。
该芯片主要由上层连续相入口1，壳流体入口2，核流体入口3，核流体分流口4，壳流体分流口5；中间层连续相入口6，中间层壳流体入口7，壳通道8，中间层核流体入口9，核通道10，连续相通道11，层流通道12，主通道13，反应通道14，流体出口15组成；
核流体从核流体入口3分别通过核流体分流口4进入核流体入口9，经过核通道10流入层流通道12；壳流体从壳流体入口2分别通过壳流体分流口5，经过壳通道8流入层流通道12；连续流从连续相入口1通过中间层连续相入口6经连续相通道11流入主通道13；核流体，壳流体，连续流体最终均通过通道13和反应通道14，制备的双液核水凝胶微囊从流体出口15流出并收集。
(2)体系的构建:基于双水相聚乙二醇(PEG)-葡聚糖(Dex)体系，具备极好的生物相容性。为了产生双液核水凝胶微囊，核流体成分为Dex,壳流体成分为PEG、海藻素钠(NaA)和乙二胺四乙酸钙二钠(Ca-EDTA)，连续相成分为矿物油、醋酸(HAc)和Span 80，采用油作为连续相是为了将双水截断形成稳定的液滴，HAc的加入是为了采用内固化的方式，与壳流体中的Ca-EDTA反应充分释放钙离子，钙离子与海藻酸钠反应形成海藻酸钙水凝胶，最终形成含有2个液核的水凝胶微囊。
所述PEG分子量：20kDa、浓度：17％；Dex分子量：50kDa、浓度：15％；NaA浓度：1％，Ca-EDTA的浓度：1％，HAc的浓度0.2％，Span 80浓度2％。
(3)微囊的制备与条件优化:将核、壳、连续相流体分别从核、壳、连续相流体入口通入微流控芯片，通过改变核流速、壳流速和连续相流速来调节双液核水凝胶微囊的尺寸大小，包括液核腔的大小和微囊整体大小；核流速：1μL/min,壳流速：9μL/min，连续相流速：30μL/min。
所述芯片层流通道宽度400μm，高360cm；主通道宽度400μm，高360cm，核、壳通道宽度50μm，高300μm，连续相通道宽度320μm，高360cm。
基于以上条件制备的双液核水凝胶微囊明场图如图2所示。
实施例2
一种基于双水相的双液核水凝胶微囊制备方法。双液核水凝胶微囊的核均为水溶液，壳为水凝胶。
一种基于双水相的双液核水凝胶微囊制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)微流控芯片的制备:该芯片利用常规软光刻的方法而成的三层PDMS芯片(上层、中间层、下层)键合而成的，上层采用了分流的设计，由简避繁，避免了多个泵装置同时使用的局限,中间层为功能芯片，下层是没有结构的芯片。芯片结构示意图如图1所示。
该芯片上层主要由核流体入口，壳流体入口，连续相入口，核流体分流口，壳流体分流口，中间层主要由连续相入口，连续相通道，核流体入口，壳流体入口，核通道，壳通道，层流通道，主通道和反应通道，流体出口组成；核流体从核流体入口分别通过核流体分流口进入核流体入口，经过核通道流入层流通道；壳流体从壳流体入口分别通过壳流体分流口，经过壳通道流入层流通道；连续流从连续相入口通过中间层连续相入口经连续相通道流入主通道；核流体，壳流体，连续流体最终均通过通道和反应通道，制备的双液核水凝胶微囊从流体出口流出并收集。
(2)体系的构建:基于双水相聚乙二醇(PEG)-葡聚糖(Dex)体系，具备极好的生物相容性。为了产生双液核水凝胶微囊，核流体成分为Dex,壳流体成分为PEG、海藻素钠(NaA)和乙二胺四乙酸钙二钠(Ca-EDTA)，连续相成分为矿物油、醋酸(HAc)和Span 80，采用油作为连续相是为了将双水截断形成稳定的液滴，HAc的加入是为了采用内固化的方式，与壳流体中的Ca-EDTA反应充分释放钙离子，钙离子与海藻酸钠反应形成海藻酸钙水凝胶，最终形成含有2个液核的水凝胶微囊。
所述PEG分子量：20kDa、浓度：17％；Dex分子量：50kDa、浓度：15％；NaA浓度：1％，Ca-EDTA的浓度：1％，HAc的浓度0.15％，Span 80浓度2％。
(3)微囊的制备与条件优化:将核、壳、连续相流体分别从核、壳、连续相流体入口通入微流控芯片，通过改变核流速、壳流速和连续相流速来调节双液核水凝胶微囊的尺寸大小，包括液核腔的大小和微囊整体大小；核流速：0.5μL/min,壳流速：4μL/min，连续相流速：30μL/min。
所述芯片层流通道宽度400μm，高360cm；主通道宽度400μm，高360cm，核、壳通道宽度50μm，高300μm，连续相通道宽度320μm，高360cm。
基于以上条件制备的双液核水凝胶微囊，先用去离子水冲洗3次，离心后去掉上层液体，放于负80度冰箱3小时，然后过夜冻干，之后对样品进行扫面电镜表征，整体表征结果如图3-a,局部表征结果如图3-b所示,从图3-a可知，制备的微囊有两处涡旋应该是双腔富含水溶液冻干后导致坍塌的原因，从图3-b局部表征结果进一步可知，微囊由2个液腔和固化的壳构成。

Claims (3)

1.一种基于双水相的双液核水凝胶微囊制备方法，其特征在于：采用微流控芯片，利用可自发相分离的双水相体系，改变核流速、壳流速和连续相流速来调节双液核水凝胶微囊的尺寸大小，包括液核腔的大小和微囊整体大小；稳定形成尺寸可调、大小均一、形貌可控的双液核水凝胶微囊，所形成双液核水凝胶微囊的核均为水溶液，壳为水凝胶；
所述微流控芯片具体如下：
该芯片利用常规软光刻的方法制成，由芯片上层、芯片中间层和芯片下层键合而成的三层PDMS芯片,芯片中间层为功能芯片，芯片下层是没有结构的芯片；
芯片上层主要由核流体入口(3)，壳流体入口(2)，连续相入口(1)，核流体分流口(4)，壳流体分流口(5)组成；
芯片中间层主要由连续相入口(6)，连续相通道(11)，核流体入口(9)，壳流体入口(7)，核通道(10)，壳通道(8)，层流通道(12)，主通道(13)和反应通道(14)，流体出口(15)组成；
所述芯片上层的核流体分流口(4)与芯片中间层的核流体入口(9)相通；
所述芯片上层的壳流体分流口(5)与芯片中间层的壳流体入口(7)相通；
所述芯片上层的连续相入口(1)与芯片中间层的连续相入口(6)相通；
核通道(10)的个数为2、壳通道(8)的个数为3，形成双液核；
核流体从核流体入口(3)分别通过核流体分流口(4)进入核流体入口(9)，经过核通道(10)流入层流通道(12)；壳流体从壳流体入口(2)分别通过壳流体分流口(5)，经过芯片中间层的壳流体入口(7)，进入壳通道(8)，最终流入层流通道(12)；连续流从连续相入口(1)通过中间层连续相入口(6)经连续相通道(11)流入主通道(13)；核流体，壳流体，连续流体最终均通 过主通道(13)和反应通道(14)，制备的双液核水凝胶微囊从流体出口(15)流出并收集；
所述双水相体系的构建如下：
基于双水相聚乙二醇(PEG)-葡聚糖(Dex)体系，为了产生双液核水凝胶微囊，核流体成分为Dex；
壳流体为PEG、海藻素钠(NaA)和乙二胺四乙酸钙二钠(Ca-EDTA)组成的混合物；
连续相为矿物油、醋酸(HAc)和司班80(Span 80)的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种基于双水相的双液核水凝胶微囊制备方法，其特征在于：所述PEG分子量范围：8-20kDa、浓度范围：10-50％；Dex分子量范围：70k-500kDa、浓度范围：10-35％；所述NaA浓度范围：0.1-2％，Ca-EDTA使用的浓度范围：0.5-2.5％，HAc的浓度范围0.05-0.25％，Span 80浓度范围为1％-5％。
3.根据权利要求1所述的一种基于双水相的双液核水凝胶微囊制备方法，其特征在于：核流速范围：0.01-2.0μL/min,壳流速范围：1-10μL/min，连续相流速范围：10-60μL/min。
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