CN112843247A - 一种具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法 - Google Patents

一种具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl‑xL拮抗剂纳米药物的制备方法，涉及超分子纳米药物技术领域，以具有线粒体靶向性和肿瘤微环境pH响应性形貌转变的多肽序列为基础，将源自促凋亡蛋白的BH3结构域和具有抗癌、抗炎、抗菌类药物分别通过共价键连接在多肽上，通过将三者按照不同组分比例进行共组装得到一种超分子Bcl‑xL拮抗剂纳米药物。本发明的优点是：该多肽超分子Bcl‑xL拮抗剂纳米药物具有优越的线粒体靶向性，以及肿瘤微环境pH响应性形貌转变，具有良好的肿瘤靶向富集能力和优异的抗肿瘤治疗效果。制备方法简单，易于工业化生产，应用领域范围广阔。

Description

一种具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物 的制备方法
技术领域
本发明涉及超分子纳米药物技术领域，具体涉及一种具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法及应用。
技术背景
癌症仍然是最紧迫的公共卫生问题之一。为了能够实现有效的特异性治疗，并且最大程度地减少不良副作用，具有更精准主动靶向功能的亚细胞器靶向性癌症治疗策略吸引了巨大的研究兴趣，并在癌症治疗和精密医学领域具有广阔的前景。线粒体是维持许多基本生理过程的关键细胞器之一。当线粒体功能障碍引起的细胞凋亡受到抑制时，线粒体在调节细胞存亡中的关键作用将有助于不同癌症的癌变。因此，线粒体成为纳米药物中最有趣的亚细胞靶标之一。尽管在过去几十年中以线粒体为靶标的纳米药物取得了成就，但是具有独特靶向位点和针对线粒体的治疗策略的纳米药物的开发仍然具有挑战性。
与此同时，多肽在非共价相互作用下能够组装形成各种纳米结构以及水凝胶。由于具有广泛的生物学功能，多肽组装体已被广泛应用于各个领域。迄今为止，已经开发出许多多肽配体与蛋白激动剂或拮抗剂结合，用来促进或抑制生理过程，从而介导细胞命运。其中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白组成的Bcl-2蛋白家族，在调节细胞凋亡或程序性细胞死亡方面具有很好的功效。促凋亡蛋白能够改变线粒体外膜的通透性，从而导致线粒体中的凋亡因子释放，激活caspase进而导致细胞凋亡。但是另一方面，抗凋亡蛋白则可能在前述的机制中通过异源二聚体缔合过程截断细胞凋亡的诱导和执行，从而诱发癌症。因此，通过合理设计构筑多肽组装体系，结合Bcl-2蛋白家族调控细胞凋亡的特点，制备具有线粒体靶向性且生物功能丰富的多肽超分子纳米药物具有重要意义和应用前景。
发明内容
本发明目的是克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法。线粒体靶向性多肽配体能够与蛋白拮抗剂进行选择性结合，使其能够选择性地与抗凋亡蛋白结合并阻止异二聚体缔合，从而潜在地通过Bcl-2途径产生靶向线粒体的纳米治疗药物。同时通过化疗药物调节膜电位来增强线粒体的膜通透性，从而有效释放细胞色素c并诱导细胞凋亡。两种过程的结合促进了细胞色素c并的有效释放和细胞凋亡，提高其在宫颈癌治疗中的功效。该制备方法简单，反应条件温和，操作简便。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
S1：设计合成具有吡啶盐的线粒体靶向性五肽分子，氮端为甲基吡啶盐修饰的多肽序列。该类多肽序列在中性条件下可经过自组装形成具有β-折叠结构的组装体，而在酸性条件下可经过自组装形成具有无规则卷曲结构的组装体。多肽合成由固相合成法实现，以哌啶作为脱保护剂，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)作为缩合剂；
S2：在步骤S1所述的线粒体靶向性五肽的基础上，将源自促凋亡蛋白的BH3结构域共价连接至线粒体靶向性五肽，该BH3结构域能够和抗凋亡蛋白Bcl-xL紧密结合，从而防止其与促凋亡蛋白异源二聚体结合，并通过释放细胞色素c促进细胞凋亡。
S3：在步骤S1所述的线粒体靶向性五肽的基础上，将传统化疗药物通过具有谷胱甘肽响应性的二硫键共价连接至五肽，对其进行功能化，化疗药物的释放可以改变线粒体膜电位，从而促进线粒体功能障碍。
S4：将步骤S1，S2和S3所述的三种多肽在缓冲液中按照不同的组分比例进行共组装，退火后得到一系列具有特定组装结构的多肽超分子纳米药物；
S5：将步骤S4得到的超分子纳米药物进一步进行细胞实验以及动物实验，证明具有优异的线粒体靶向性以及肿瘤富集和治疗能力。
在本发明的进一步实施方式中，步骤S1中，所述超分子多肽自组装基元包括氮端为不同吡啶盐修饰的多肽序列，例如：苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸、苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-乙基吡啶丙氨酸等；
在本发明的进一步实施方式中，步骤S2中：所述促凋亡蛋白的BH3肽序列包括：源自促凋亡蛋白Bak的BH3肽(甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-精氨酸)、源自促凋亡蛋白Bax的BH3肽(丝氨酸-苏氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-丝氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-亮氨酸-赖氨酸-精氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-甲硫氨酸)、源自促凋亡蛋白Bad的BH3肽(天冬酰胺-亮氨酸-色氨酸-丙氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酸-亮氨酸-精氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-天冬氨酸)、源自促凋亡蛋白BIM的BH3肽(异亮氨酸-色氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-亮氨酸-精氨酸-精氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-酪氨酸-酪氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸)等；
在本发明的进一步实施方式中，步骤S3中：具有药物治疗功能的多肽主要是：羟基喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、柔红霉素等功能化五肽。
在本发明的进一步实施方式中，步骤S4中：具有BH3肽功能化的多肽占线粒体靶向五肽自组装基元的摩尔数的比在0.1％到10％之间；具有药物治疗功能的功能化的多肽占线粒体靶向五肽自组装基元的摩尔数的比在0.1％到5％之间；所述自组装溶液的物质的量浓度在0.1微摩尔每升到10毫摩尔每升；所述自组装溶液的退火温度在10-100℃之间，所述的退火时间为1-48小时，所述的溶剂为PBS缓冲溶液或水，所述水为超纯水，去离子水和Milli-Q水。
在本发明的进一步实施方式中，步骤S5中：细胞实验中所用的正常细胞为小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)、人正常肝细胞(LO2)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人肾上皮细胞(293t)；细胞实验中所用的癌细胞为人宫颈癌细胞(HeLa)、小鼠乳腺癌细胞(4T1)、人前列腺癌细胞(PC3)、人非小细胞肺癌细胞(A549)等；
第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物。
第三方面，本发明提供了上述方法制备得到的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物在肿瘤细胞的细胞摄取途径中暴露于pH梯度时会在纳米纤维和纳米颗粒之间发生可逆的形态学转变。
第四方面，本发明提供的上述方法制备得到的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物具有良好的肿瘤富集能力，能与抗凋亡蛋白进行结合，从而防止其与促凋亡蛋白异源二聚体结合，并通过释放细胞色素c促进细胞凋亡。
第五方面，本发明提供的上述具有线粒体靶向性的多肽超分子组装材料在抗炎、抗肿瘤等领域具有应用价值。
本发明的优点和有益效果：
(1)本发明采用的多肽序列具有良好的生物相容性和生物活性，多肽作为生物体内重要的生物活性物质，可以通过调控组装序列的分子结构以及组装环境因素，实现对自组装过程的热力学和动力学控制。(2)本发明通过在氮端引入吡啶盐阳离子，设计得到一类具有线粒体靶向性的多肽。具有生物降解性、低免疫原性和低毒性等优点。(3)本发明通过将源自促凋亡蛋白的BH3结构域以及传统化疗药物共价连接到线粒体靶向性多肽进行共组装得到一种多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物。该纳米药物能够调节线粒体膜电位来增强线粒体的膜通透性，从而有效释放细胞色素c并诱导细胞凋亡。(4)本发明提供的超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物能够在肿瘤部位积累和保留，拮抗剂中的BH3结构域和化疗药物在抑制肿瘤生长方面具有协同治疗作用。(5)本发明提供的超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物制备方法简单，反应条件温和，操作简便，易于工业化。通过一种新型有效的组合机制诱导肿瘤细胞凋亡，在将来有可能作为一种靶向细胞器的新型纳米药物，可以应用于抗炎、抗癌、抗菌等方面的药物治疗以及示踪。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例中的部分多肽序列以及药物功能化多肽的分子结构式图(1：苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸，2：甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-精氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸，3：喜树碱-苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸)；
图2为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物在pH 7.4条件下组装得到的原子力显微镜图和透射电子显微镜图；
图3为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物在pH 6.5条件下组装得到的原子力显微镜图和透射电子显微镜图；
图4为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物细胞摄取的激光共聚焦图；
图5为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物细胞摄取的流式细胞仪分析；
图6为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物线粒体靶向的激光共聚焦图；
图7为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物的细胞毒性分析；
图8为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物的细胞凋亡检测；
图9为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物与抗凋亡蛋白的结合能力的评估；
图10为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物线粒体膜电位测试的激光共聚焦图；
图11为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物线粒体膜电位测试的流式细胞仪分析；
图12为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物胱天蛋白酶9活性的研究；
图13为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物体内生物分布成像；
图14为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物体外肿瘤富集的研究；
图15为本发明实施例中的多肽超分子纳米药物体内抗肿瘤功效的研究；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
下面结合具体实施例对本发明提供的一种具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法作进一步说明。
实施例1
本实施例提供的是一种具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法，制备过程包括：
S1：通过固相合成的方法合成：苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸、甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-精氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸、喜树碱-苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸三种多肽序列，投料均为0.25毫摩尔，产率90％，通过高效液相色谱分离提纯，产物纯度≥99％。
S2：将苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸、甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-精氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸、喜树碱-苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸三种多肽基元以摩尔比为85:10:5的配方下，在PBS缓冲液中(pH值7.4)进行退火自组装，退火温度80℃，组装时间48小时，将得到的纳米组装结构在原子力显微镜以及场发射透射电子显微镜下观察可见纳米纤维结构，如图2所示。
实施例2
本实施例提供的是一种具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法，制备过程包括：
S1：通过固相合成的方法合成：苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸、甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-精氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸、喜树碱-苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸三种多肽序列，投料均为0.25毫摩尔，产率90％，通过高效液相色谱分离提纯，产物纯度≥99％。
S2：将苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸、甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-精氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸、喜树碱-苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸三种多肽基元以摩尔比为85:10:5的配方下，在PBS缓冲液中(pH值6.5)进行退火自组装，退火温度80℃，组装时间48小时，将得到的纳米组装结构在原子力显微镜以及场发射透射电子显微镜下观察可见纳米颗粒结构，如图3所示。
实施例3
将本发明实施例2制备得到的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物，通过流式细胞仪检测细胞摄取情况。
以HeLa细胞为例，在共聚焦玻璃皿中在DMEM培养基中以1.2×105的密度培养HeLa细胞24小时。用PBS洗涤细胞三次，并加入含FAM标记的多肽超分子纳米药物的新鲜无血清培养基，继续培养2、4、8或10小时。用PBS洗涤细胞两次后，将细胞用4％多聚甲醛固定20分钟，再用DAPI染色20分钟。通过共聚焦激光扫描显微镜进行观察，如图4所示。我们还通过流式细胞术对多肽超分子纳米药物的细胞摄取进行评估。将接种在6孔板上的HeLa细胞(每孔1.5×105细胞)在CO2气氛下于37℃培养24小时。用PBS洗涤细胞，并加入含FAM标记的多肽超分子纳米药物的新鲜无血清培养基，继续培养2、4、8或10小时。将细胞用胰蛋白酶消化，并用PBS洗涤。将细胞重悬于PBS中进行流式细胞仪分析，如图5所示。
实验结果：用多肽超分子纳米药物处理的HeLa细胞的共聚焦图像显示出更强的荧光信号，证实了纳米药物的细胞摄取。特别是，将细胞孵育4或10小时后，纳米药物与内体/溶酶体之间的皮尔森相关系数分别为0.84和0.45，这表明多肽超分子纳米药物的细胞摄取是通过内体/溶酶体-介导的内吞途径以及内体/溶酶体逃逸进入细胞质。流式细胞术的结果也显示出随着孵育时间的延长，荧光强度逐渐提高，表明多肽超分子纳米药物成功被HeLa细胞摄取。同时我们还观察到与对照组相比，多肽超分子纳米药物处理的HeLa细胞具有更强的荧光强度，表明细胞摄取效率的提高。
实施例4
将本发明实施例2制备得到的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物，通过激光共聚焦显微镜观察线粒体靶向共定位性质。
以HeLa细胞为例，在共聚焦玻璃皿中以1.2×105的密度培养HeLa细胞24小时。之后将细胞在FAM标记的多肽超分子纳米药物中孵育10小时。用PBS洗涤3次后，将细胞用红色线粒体荧光探针在37℃培养箱中孵育30分钟，并用4％多聚甲醛固定20分钟，再用DAPI染色20分钟。将染色的细胞用PBS洗涤3次，并通过共焦激光扫描显微镜进行观察，并对皮尔森相关系数进行统计。
实验结果：具体结果如图6所示。用多肽超分子纳米药物处理的HeLa细胞中的红色线粒体荧光探针和FAM信号之间存在明显的重叠，证实多肽超分子纳米药物和线粒体的优异的共定位，表明纳米药物的线粒体积累。这些结果有力地证明多肽超分子纳米药物的线粒体靶向能力。
实施例5
将本发明实施例2制备得到的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物，通过细胞毒性和细胞凋亡的检测实验来系统评价。
通过MTT的方法对多肽超分子纳米药物的细胞毒性进行检测：在96孔板中接种HeLa细胞悬液(5000细胞/孔)，放在细胞培养箱中培养(37℃，5％CO2)24小时。向96孔板中加入多肽超分子纳米药物继续培养48小时，向每孔加入10微升MTT溶液。将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪测定在495nm处的吸光度。
通过流式细胞仪对多肽超分子纳米药物诱导细胞凋亡进行检测：将HeLa细胞以每孔1×105个细胞的密度接种到12孔板中过夜。用多肽超分子纳米药物孵育12小时后，收集细胞并在结合缓冲液中用膜联蛋白V-FITC和PI溶液在黑暗中染色15分钟。用PBS缓冲液洗涤细胞3次，并在流式细胞仪下检测。
实验结果：具体结果如图7和图8所示。该线粒体靶向性五肽的细胞毒性很低，与游离CPT和游离BH3肽相比，多肽超分子纳米材料的肿瘤细胞毒性得到改善，表现出强大的诱导细胞死亡的能力，这可能是由于化学药物和BH3结构域的协同作用所致。同样流式细胞术研究也证实了多肽超分子纳米材料诱导的细胞死亡。
实施例6
将本发明实施例2制备得到的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物，通过微量热泳(MST)分析进行与抗凋亡蛋白的结合能力的评估。
遵循供应商提供的标准实验步骤，用Monolith NTTM蛋白质标记试剂盒对质Bcl-xL蛋白进行标记。将标记好的蛋白样品用PBS缓冲液进行稀释至208纳摩尔，并向其中添加多肽超分子纳米材料，浓度范围为0.01525至125微摩尔。在室温下孵育30分钟后，将上述混合溶液用Monolith TM标准处理的毛细管进行上样。在MonolithNT.115仪器上于25℃进行MST测量。激光功率和LED功率分别设置为20％和100％。使用NTAnalysis软件获得Bcl-xL蛋白与多肽超分子纳米材料之间的解离常数(Kd)值。
实验结果：具体结果如图9所示。多肽超分子纳米药物与Bcl-xL蛋白之间的结合常数(Kd)为10.1微摩尔。结果表明多肽超分子纳米药物能够与Bcl-xL蛋白以高亲和力进行缔合。从而可以防止Bcl-xL和Bax蛋白之间的异源二聚化，从而促进线粒体膜通透性的改变和细胞色素c的释放，并最终诱导细胞细胞凋亡。
实施例7
将本发明实施例2制备得到的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物，进行线粒体膜电位的测试。
在共聚焦玻璃皿中以1.2×105的密度培养HeLa细胞24小时。将细胞用多肽超分子纳米药物培养4小时。除去培养液后，将细胞用PBS洗涤两次，并加入1毫升JC-1染液。在细胞培养箱中于37℃孵育30分钟。将细胞用PBS洗涤3次，在荧光显微镜下成像观察。对于流式细胞术实验，将HeLa细胞在6孔板中以每孔1×106个细胞的密度培养24小时，将细胞在多肽超分子纳米药物的存在下孵育4小时，然后将细胞用胰蛋白酶消化并收集。用PBS彻底洗涤并重悬于JC-1染液，在37℃下再孵育30分钟，离心除去上清液并用PBS洗涤两次，将细胞样品重悬于PBS中。通过流式细胞仪进行测试。
实验结果：具体结果如图10和图11所示。通过JC-1实验研究多肽超分子纳米药物的线粒体膜电位。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，发出强烈的红色荧光，不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在，产生绿色荧光。多肽超分子纳米药物处理的HeLa细胞的荧光图像显示出强烈的绿色荧光信号。相反，对照组处理的细胞表现出明显的红色信号。结果表明多肽超分子纳米药物能够改变线粒体膜电位，从而促进细胞凋亡。流式细胞术结果显示多肽超分子纳米药物处理的HeLa细胞在J单体和J聚集信号之间的比例最高，表明其促进线粒体功能障碍的能力增强。
实施例8
将本发明实施例2制备得到的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物，进行细胞凋亡相关胱天蛋白酶9活性的研究。
将HeLa细胞在DMEM培养基中以5×103的密度在96孔板中培养并孵育过夜。将培养基替换为含有多肽超分子纳米药物的新鲜培养基继续孵育12小时，收集细胞并用PBS洗涤。离心并在冰上的裂解缓冲液中重悬15分钟后，在4℃下离心15分钟收集细胞。最终，将40微升的上清液添加到96孔板中，并与10微升的Ac-DEVD-pNA(2毫摩尔)缓冲溶液在37℃下孵育1小时。通过记录酶标仪在405nm处的吸收强度来确定胱天蛋白酶9的活性。
实验结果：具体结果如图12所示。经多肽超分子纳米药物处理的HeLa细胞内的胱天蛋白酶9的活性是对照组的4.21倍，证明多肽超分子纳米药物提高细胞内胱天蛋白酶9的活性，从而进一步促进HeLa细胞的凋亡过程。
实施例9
将本发明实施例2制备得到的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物，进行体内生物分布和体外肿瘤富集的研究。
将HeLa细胞(1×106)皮下注射到雌性BALB/c裸鼠中来建立肿瘤模型。当肿瘤生长到100mm3，称重荷瘤小鼠体重，并随意分组(n＝3)。然后将相应FAM标记的多肽超分子纳米药物静脉注射到小鼠体内。在不同时间点观察荧光强度。在36小时处死动物，并收集主要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾)和肿瘤用于离体成像。
实验结果：具体结果如图13和图14所示。利用FAM标记的多肽超分子纳米药物作为荧光追踪剂，我们能够监测小鼠体内治疗的体内定位。多肽超分子纳米药物给药的小鼠的肿瘤组织显示出明显的荧光信号，表明其在肿瘤组织中的有效富集。荧光信号在36小时得以保留，这意味着在肿瘤部位的保留时间更长。肿瘤和主要正常器官(肝，肺，脾，肾和心脏)的离体荧光成像检测表明多肽超分子纳米药物治疗组中肿瘤的荧光强度明显强于正常器官，并且相比于对照组，其平均荧光强度明显增加，表明在肿瘤部位的富集增强。
实施例10
将本发明实施例2制备得到的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物，进行体内抗肿瘤功效的研究。
以Balb/c裸鼠的宫颈癌为例，将HeLa细胞(1×106)皮下注射中来建立肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3时，通过尾静脉注射多肽超分子纳米药物作为实验组，PBS作为对照组。每两天注射一次，即在实验开始的第1天、第3天和第5天分别进行尾静脉注射，一共注射3次，每隔一天监测每只小鼠的体重和肿瘤大小。
实验结果：具体结果如图15所示。多肽超分子纳米药物实验组小鼠和对照组小鼠的体重相差不大且体重恒定，意味着纳米药物的全身毒性可忽略不计。从肿瘤体积和重量来看，注射多肽超分子纳米药物的小鼠的肿瘤体积增长受到更显着的抑制，且肿瘤的大小和重量明显小于对照组，表明多肽超分子纳米药物的治疗功效增强，能够显著抑制肿瘤生长。
结合纳米药物在克服传递障碍方面的优势以及优化由其pH适应形态引起的药物药代动力学，以及在靶向细胞器的癌症治疗中的巨大潜力，激发了我们研究体内治疗功效的灵感。
需要说明的是，除了上述实施例1至实施例10列举的情况，选用其他的原料配比和制备方法参数也是可行的。

Claims (10)

1.一种具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
S1：设计合成具有线粒体靶向性的吡啶盐修饰的多肽序列，该类多肽序列在中性条件下可经过自组装形成具有β-折叠结构的组装体，而在酸性条件下经过自组装形成具有无规则卷曲结构的组装体，其中包括具有线粒体靶向性的五肽自组装基元、共价键连接的BH3肽修饰的多肽自组装基元和具有药物治疗功能的多肽自组装基元，多肽合成方法由固相合成的方法实现，以哌啶作为脱保护剂，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)为缩合剂；
S2：将步骤S1所述的三种多肽自组装基元在PBS缓冲液中进行共组装，退火后得到多肽超分子纳米药物；
S3：将步骤S2得到的多肽超分子纳米药物进一步进行细胞实验以及动物实验，证明具有线粒体靶向性以及肿瘤治疗能力。
2.根据权利要求1所述的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法，其特征在于：
步骤S1中，超分子多肽自组装基元包括氮端为不同吡啶盐修饰的多肽序列，包括但不限于苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-甲基吡啶丙氨酸、苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-氨基脯氨酸-苯丙氨酸-乙基吡啶丙氨酸。
3.根据权利要求1所述的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法，其特征在于：
促凋亡蛋白的BH3结构域序列包括：源自促凋亡蛋白Bak的BH3结构域，包括甘氨酸-谷氨酰胺-缬氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-精氨酸；源自促凋亡蛋白Bax的BH3结构域，包括丝氨酸-苏氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-丝氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-亮氨酸-赖氨酸-精氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-甲硫氨酸；源自促凋亡蛋白Bad的BH3结构域，包括天冬酰胺-亮氨酸-色氨酸-丙氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-谷氨酸-亮氨酸-精氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-天冬氨酸；源自促凋亡蛋白BIM的BH3结构域，包括异亮氨酸-色氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-亮氨酸-精氨酸-精氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-酪氨酸-酪氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸。
4.根据权利要求1所述的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法，其特征在于
具有药物治疗功能的多肽包括但不限于羟基喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、柔红霉素中的一种功能化五肽。
5.根据权利要求1所述的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法，其特征在于：
具有BH3肽修饰的多肽自组装基元占多肽共组装体系总的摩尔数的比例在0.1％到10％之间；具有药物治疗功能的多肽自组装基元占多肽共组装体系总的摩尔数的比例在0.1％到10％之间；共组装溶液的物质的量浓度在0.1微摩尔每升到10毫摩尔每升；自组装溶液的退火温度在10-100℃之间，退火时间为0.1-100小时，溶剂为缓冲液或水，其中水为超纯水、去离子水或Milli-Q水。
6.根据权利要求1所述的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物的制备方法，其特征在于：
步骤S3细胞实验中所用的正常细胞为小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)、人正常肝细胞(LO2)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、人肾上皮细胞(293t)；细胞实验中所用的癌细胞为人宫颈癌细胞(HeLa)、小鼠乳腺癌细胞(4T1)、人前列腺癌细胞(PC3)、人非小细胞肺癌细胞(A549)。
7.一种具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物，其特征在于：通过权利要求1-6任一项方法制备得到。
8.根据权利要求1-6任一项方法制备得到的具有线粒体靶向性的多肽超分子Bcl-xL拮抗剂纳米药物在抗炎、抗肿瘤领域的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：该药物在肿瘤细胞的细胞摄取途径中暴露于pH梯度时会在纳米纤维和纳米颗粒之间发生可逆的形态学转变。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：该药物具有良好的肿瘤富集能力，能与抗凋亡蛋白进行结合，从而防止其与促凋亡蛋白异源二聚体结合，并通过释放细胞色素c促进细胞凋亡。
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