CN112843235B - 抑制肝细胞中Kindlin-2蛋白表达量的试剂在制备治疗脂肪肝产品中的应用 - Google Patents

抑制肝细胞中Kindlin-2蛋白表达量的试剂在制备治疗脂肪肝产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了抑制肝细胞中Kindlin‑2蛋白表达量的试剂在制备治疗脂肪肝产品中的应用。第一方面，抑制肝细胞中Kindlin‑2蛋白的表达量和/或活性的试剂在制备具有以下至少一种功用的产品中的应用：(1)预防和/或治疗脂肪肝；(2)预防和/或治疗肝细胞脂肪变性；(3)预防和/或治疗高血糖症；(4)降低肝细胞脂肪含量；(5)降低肝脏总胆固醇含量；(6)降低肝脏甘油三酯含量。通过表达载体靶向敲低或敲除小鼠肝细胞的Kindlin‑2蛋白、使Kindlin‑2蛋白的表达量下降后，可以有效缓解上述脂肪肝动物模型的肝细胞脂肪变性，其肝细胞的脂肪含量、总胆固醇、甘油三酯的含量都有明显下降。

Description

抑制肝细胞中Kindlin-2蛋白表达量的试剂在制备治疗脂肪 肝产品中的应用
技术领域
本申请涉及细胞治疗技术领域，尤其是涉及抑制肝细胞中Kindlin-2蛋白表达量的试剂在制备治疗脂肪肝产品中的应用。
背景技术
脂肪性肝病(fatty liver)是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，是一种常见的肝脏病理改变，而非一种独立的疾病。当人体肝内脂肪蓄积太多，超过肝重量的5％或在组织学上肝细胞50％以上有脂肪变性时，就可称为脂肪性肝病(脂肪肝)。脂肪肝正严重威胁国人的健康，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，发病率在不断升高，且发病年龄日趋年轻化。
脂肪肝一般分为酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝两大类。非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是最常见的一种脂肪肝，是指除酒精和其他明确的肝脏损伤因素外，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变以及脂质代谢紊乱为主要特征的临床病理综合征。脂肪肝的病理进程主要分为：单纯性脂肪肝(Non-alcoholic fattyliver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)、肝纤维化以及其相关肝硬化。普通成人NAFLD患病率10％～30％，其中10％～20％为NASH，后者10年内肝硬化发生率高达25％。
目前，包括NASH在内的脂肪肝的治疗方法以生活方式干预为主，包括调节饮食、增加运动来减轻体重，尚无防治脂肪肝的特效药物。因此研发用于治疗脂肪肝的药物有重大临床和经济效益。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种抑制肝细胞中Kindlin-2蛋白表达量的试剂在制备治疗脂肪肝产品中的应用。
本申请的第一方面，提供抑制肝细胞中Kindlin-2蛋白的表达量和/或活性的试剂在制备具有以下至少一种功用的产品中的应用：
(1)预防和/或治疗脂肪肝；
(2)预防和/或治疗肝细胞脂肪变性；
(3)预防和/或治疗高血糖症；
(4)降低肝细胞脂肪含量；
(5)降低肝脏总胆固醇含量；
(6)降低肝脏甘油三酯含量。
根据本申请实施例的应用，至少具有如下有益效果：
脂肪肝的主要发病机制是各类原因导致肝脏内脂肪(甘油三酯)堆积过多，因此通过高脂饮食诱发脂肪肝得到的脂肪肝动物模型与脂肪肝患者具有良好的一致性。而申请人在实验过程中发现，靶向敲低或敲除小鼠肝细胞的Kindlin-2蛋白、使Kindlin-2蛋白的表达量下降后，可以有效缓解上述脂肪肝动物模型的肝细胞脂肪变性，其肝细胞的脂肪含量、总胆固醇、甘油三酯的含量都有明显下降。
根据本申请的一些实施例，试剂选自以下至少一种：
(a)抗体；
(b)miRNA；
(c)干扰RNA，或所述干扰RNA的表达载体；
(d)反义寡核苷酸；
(e)阻断剂；
(f)基因编辑系统；
(g)小分子化合物。
根据本申请的一些实施例，表达载体为质粒载体、病毒载体中的任一种。
根据本申请的一些实施例，表达载体为腺相关病毒载体。采用腺相关病毒载体进行干扰RNA的转导具有较高的安全性。
根据本申请的一些实施例，腺相关病毒载体为AAV8。AAV8的亲和力高，能在肝细胞内高效表达特定的干扰RNA。
根据本申请的一些实施例，干扰RNA为siRNA、shRNA中的任一种。siRNA在肝细胞中瞬时表达，而采用shRNA可以通过病毒等表达载体整合到宿主的肝细胞中实现较长时间的稳定表达，从而使抑制作用更稳定。
根据本申请的一些实施例，基因编辑系统选自CRISPR(规律间隔成簇短回文重复序列)、ZFN(锌指核酸酶)、TALENs(转录激活因子样效应物核酸酶)等基因编辑系统。
根据本申请的一些实施例，脂肪肝为非酒精性脂肪性肝病。
根据本申请的一些实施例，高血糖症为非酒精性脂肪性肝病引发的高血糖症。
根据本申请的一些实施例，脂肪肝为肝细胞甘油三酯堆积引起的脂肪肝。
根据本申请的一些实施例，高血糖症为肝细胞甘油三酯堆积引发的高血糖症。
本申请的第二方面，提供Kindlin-2蛋白或Kindlin-2蛋白的编码基因作为靶点在筛选预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。申请人在实验过程中发现，靶向敲低或敲除小鼠肝细胞的Kindlin-2蛋白、使Kindlin-2蛋白的表达量下降后，可以有效缓解上述脂肪肝动物模型的肝细胞脂肪变性，其肝细胞的脂肪含量、总胆固醇、甘油三酯的含量都有明显下降。因此，可以将Kindlin-2蛋白或Kindlin-2蛋白的编码基因作为靶点进行预防和/或治疗脂肪肝的药物筛选。
本申请的第三方面，提供预防和/或治疗脂肪肝的药物的筛选方法，该筛选方法包括以下步骤：检测受试对象在药物施用前后的Kindlin-2蛋白的表达量和/或活性的变化。申请人在实验过程中发现，靶向敲低或敲除小鼠肝细胞的Kindlin-2蛋白、使Kindlin-2蛋白的表达量下降后，可以有效缓解上述脂肪肝动物模型的肝细胞脂肪变性，其肝细胞的脂肪含量、总胆固醇、甘油三酯的含量都有明显下降。因此，可以从待筛选药物对Kindlin-2蛋白的表达量和/或活性是否存在抑制作用以及抑制作用的强弱的角度出发，进行药物筛选。
根据本申请的一些实施例，该筛选方法包括以下步骤：检测受试对象在药物施用前后肝细胞中的Kindlin-2蛋白的表达量和/或活性的变化。
本申请的第四方面，提供检测Kindlin-2蛋白的表达量和/或活性的试剂在制备脂肪肝的诊断和/或预后的试剂中的应用。
根据本申请的一些实施例，提供检测肝细胞中Kindlin-2蛋白的表达量和/或活性的试剂在制备脂肪肝的诊断和/或预后的试剂中的应用。
本申请的第五方面，提供检测Kindlin-2蛋白的编码基因的表达和/或含量的试剂在制备脂肪肝的诊断和/或预后的试剂中的应用。
根据本申请的一些实施例，提供检测肝细胞中Kindlin-2蛋白的编码基因的表达和/或含量的试剂在制备脂肪肝的诊断和/或预后的试剂中的应用。
申请人在实验过程中发现，靶向敲低或敲除小鼠肝细胞的Kindlin-2蛋白、使Kindlin-2蛋白的表达量下降后，可以有效缓解上述脂肪肝动物模型的肝细胞脂肪变性，其肝细胞的脂肪含量、总胆固醇、甘油三酯的含量都有明显下降。因此，Kindlin-2蛋白的表达量和/或活性、Kindlin-2蛋白的编码基因的表达和/或含量与脂肪肝存在一定的关联性，从而可以通过对Kindlin-2蛋白的表达量和/或活性、Kindlin-2蛋白的编码基因的表达和/或含量的检测来实现脂肪肝的诊断和/或预后。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是本申请一个实施例的高脂饮食处理过程中对照组和实验组小鼠的体重变化情况。
图2是图1所示实施例中两组小鼠的肝重比较结果。
图3是图1所示实施例中两组小鼠的肝脏甘油三酯含量比较结果。
图4是图1所示实施例中两组小鼠的切片染色结果。
图5是本申请另一个实施例中第0min测得的两组小鼠的空腹血糖水平比较结果。
图6是图5所示实施例中糖耐量试验结果。
图7是图5所示实施例中第180min采血测得的餐后血糖水平比较结果。
图8是图5所示实施例中胰岛素耐受实验结果。
图9中A～H分别是AAV-shk2组和AAV-shnc组小鼠的肝脏照片以及肝重、体重、血糖、肝脏甘油三酯含量、肝脏总胆固醇含量、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的检测结果。
图10是图9所示两组小鼠肝细胞的苏木素-伊红染色染色结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以下实施例中WT表示对照组小鼠，KO表示敲除肝细胞Kindin-2后的实验组小鼠。实验用小鼠由美国拉什大学提供，均为雄性鼠。
采用基因敲除技术特异性敲除小鼠肝细胞的Kindlin-2后，提取相应组织的总RNA，实时qPCR定量分析测定相应组织中总RNA与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的比值。结果显示，KO组小鼠的Kindlin-2的敲除仅限于肝细胞，其他组织与对照组无明显差异。
实施例1
敲除小鼠肝细胞Kindlin-2对高脂饮食引起的脂肪变性的影响
分别取实验组小鼠和对照组小鼠各12只，进行高脂饮食处理12周，每周称重一次。12周后处死小鼠，取出肝脏，称重。部分肝脏进行石蜡包埋切片，对切片进行苏木素-伊红染色及油红O染色。另取部分肝脏匀浆处理后取上清液测定甘油三酯含量。
结果如图1～4所示。图1为高脂饮食处理过程中对照组和实验组小鼠的体重变化情况，图2为两组小鼠的肝重比较，图3为两组小鼠的肝脏甘油三酯含量比较，图4为两组小鼠切片染色结果。从图1～4中可以看出，高脂饮食处理后，对照组小鼠体重增加较为明显，肝脏甘油三酯含量较高，同时肝细胞中出现大量的脂肪堆积，表明高脂饮食处理使小鼠出现明显的脂肪变性症状。而相比较而言，实验组小鼠肝细胞敲除单倍剂量的Kindlin-2，体重增加、肝重、肝脏甘油三酯含量显著低于对照组，肝细胞中的脂肪堆积情况也有明显改善。上述结果表明，肝细胞敲除单倍剂量的Kindlin-2有效缓解肝细胞由于高脂饮食造成的脂肪变性。
实施例2
敲除小鼠肝细胞Kindlin-2对高脂饮食引起的高血糖症的影响
糖耐量试验(GTT)：分别取实验组小鼠和对照组小鼠各10只饥饿过夜，随后进行葡萄糖腹腔注射，剂量为2g/kg体重，在第0min、15min、30min、60min、120min尾巴采血，用血糖试纸测量血糖浓度。
胰岛素耐受实验(ITT)：分别取实验组小鼠和对照组小鼠各10只饥饿过夜，随后进行胰岛素腹腔注射，剂量为1unit/kg体重，在第0min、15min、30min、60min、120min尾巴采血，用血糖试纸测量血糖浓度。
结果如图5～8所示。图5为第0min测得的两组小鼠的空腹血糖水平比较结果，图6为糖耐量试验结果，图7为第180min采血测得的餐后血糖水平比较结果，图8为胰岛素耐受实验结果。从图5可以看出，实验组小鼠的空腹血糖水平明显低于对照组，从图6可以看出，实验组小鼠对于血糖的处理能力显著增强。而图7的结果显示，两组小鼠的餐后血糖水平则没有明显差别。从图8可以看出，实验组小鼠外周组织对于胰岛素的敏感性增强，对血糖的处理能力显著提升。上述结果表明，肝细胞敲除单倍剂量的Kindlin-2有效缓解肝细胞由于高脂饮食造成的高血糖症。
实施例3
AAV8表达载体敲低小鼠肝脏Kindlin-2实验
根据小鼠Kindlin-2基因序列和RNAi原理，构建shRNA并插入到AAV8腺相关病毒表达载体中，转导小鼠肝细胞，得到AAV8介导的肝脏Kindlin-2敲低小鼠(AAV-shk2组)，同时设置相应的空载体对照组(AAV-shnc组)。采用实施例1和2中的实验方法分别对AAV-shk2组和AAV-shnc组进行高脂饮食处理，并测量相应的参数。另外，采血后测量血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平。
其中，shRNA的序列如下所示：
CCGGGCGGACAGTTCTTACAACTTACTCGAGTAAGTTGTAAGAACTGTCCGCTTTTTG(SEQ IDNo.1)；
CCGGGCCTTACCAGACCAGTTAATACTCGAGTATTAACTGGTCTGGTAAGGCTTTTTG(SEQ IDNo.2)。
结果如图9～10所示。图9中A～H分别是两组小鼠的肝脏照片以及肝重、体重、血糖、肝脏甘油三酯含量、肝脏总胆固醇含量、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶的检测结果，图10是两组小鼠肝细胞的苏木素-伊红染色染色结果。从图9和图10可以看出，与AAV-shnc组比较，AAV-shk2组在敲低肝细胞的Kindlin-2后，体重和肝脏的重量显著降低，空腹血糖水平显著降低，肝脏的甘油三酯和总胆固醇含量都降低，同时，丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶这两个酶活性也显著下降。另外，AAV-shk2组在敲低肝细胞的Kindlin-2后，肝细胞因高脂饮食出现的大量脂肪堆积的症状有了明显改善，上述结果表明，AAV8介导的肝脏Kindlin-2敲低可以缓解高脂诱导造成的脂肪肝。
综合上述结果可以看到，小鼠肝细胞敲除单倍剂量的Kindlin-2蛋白，可以有效缓解肝细胞由于高脂饮食造成的脂肪变性和高血糖症。而以AAV8作为载体携载Kindlin-2的shRNA敲低小鼠肝细胞的Kindlin-2蛋白，同样能够缓解高脂诱导造成的脂肪肝。上述结果表明，可以通过特定的制剂抑制肝细胞Kindlin-2蛋白的表达量和/或活性来达到预防和/或治疗脂肪肝的目的。其中，这些制剂可以是上述实施例中能够将Kindlin-2的shRNA转导进入宿主肝细胞的腺相关病毒载体或其它表达载体，同样可以是其它如能够与Kindlin-2发生特异性结合并使其失去特定活性的抗体；通过抑制转录、沉默Kindlin-2编码基因而导致Kindlin-2表达下降的miRNA；抑制Kindlin-2编码基因表达的反义寡核苷酸；降低Kindlin-2活性的阻断剂；能够特定敲除Kindlin-2编码基因的CRISPR编辑系统等。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方科技大学
<120> 抑制肝细胞中Kindlin-2蛋白表达量的试剂在制备治疗脂肪肝产品中的应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccgggcggac agttcttaca acttactcga gtaagttgta agaactgtcc gctttttg 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgggcctta ccagaccagt taatactcga gtattaactg gtctggtaag gctttttg 58

Claims (1)

1.抑制肝细胞中Kindlin-2蛋白的表达量和/或活性的试剂在制备具有以下至少一种功用的产品中的应用：
（1）治疗脂肪肝；
（2）治疗高血糖症；
所述试剂为干扰RNA，所述干扰RNA为shRNA，所述shRNA的序列如SEQ ID No.1~2中任一种所示。
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