CN112825813A - 一种动物模型制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物模型制备方法，包括在X线透视引导下，从腰部侧后入路通过椎间盘穿刺给予大鼠PBS冲液，构建盘源性腰痛动物模型，本发明通过多种腰疼痛行为学检测、椎间盘退变组织学和影像学方法对该模型进行评估，鉴定疾病动模型的性能。本发明采用X线透视引导的方式，一方面操作简便高效，定位准确，不需要添加细胞因子等诱导剂，除PBS外无其他诱导剂，价格经济，另一方面，采用精准细针穿刺，无需解剖腹部或背部手术后进行椎间盘破坏等复杂外科操作，手术难度低，简单易行，感染率和死亡率低，且对脊柱骨骼及腹背部肌肉创伤小，可更好的用于评估盘源性腰痛的发生发展过程。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型制备技术领域，尤其涉及一种动物模型制备方法。
背景技术
腰痛是一种常见的骨骼肌肉疼痛性疾病，全球人口患病率高达31％，其中终生患病高达60％-80％，因其致残率高，致病因素复杂，治疗效果差，医疗成本高，给社会和家庭带来巨大的负担。椎间盘退变是腰痛的主要原因，因而如何治疗盘源性腰痛一直是国内外的研究热点，目前，各种药物在应用临床前，必须现在动物模型上保证其有效性和安全性，外科手术或穿刺破坏动物椎间盘(开腹或背部机械创伤)是最常见的动物模型，而他们在实际应用中存在许多问题，因而寻找一种除椎间盘外骨骼肌肉结构损伤小，操作简便，科学合理的盘源性腰痛动物模型迫在眉睫。
如何微创但又精准损伤腰椎间盘是合理构建盘源性腰痛动物模型的主要问题，采用手术外科方式进行动物切开腹部和背部，并破坏脊柱骨质结构，虽然可保证椎间盘的精确损伤，但该类方式损伤过大，且破坏维持脊柱稳定性的其他解剖结构，如腹背部核心肌群、脊柱小关节、韧带及神经等，此外该方法手术具有操作难度大和模型不稳定等问题，而采用直接穿刺椎间盘方式，具有操作简便和经济实用的优势，但因其定位精准性差，易损伤神经及损伤程度不好掌控等原因往往很难获得稳定高效的盘源性腰痛动物模型，因此本发明提出了一种动物模型制备方法来解决上述问题。
发明内容
本发明目的在于克服现有外科手术构建盘源性腰痛造模的缺陷，而提供了一种动物模型制备方法，具体技术方案如下：
本发明提供了一种动物模型制备方法，包括：
(1)实验动物准备：准备230g-250g健康成年Sprague Dawley大鼠；
(2)在大鼠背部选取细针穿刺点；
(3)在X线透视引导下，细针进入椎间盘髓核中心部位；
(4)将PBS注入椎间盘髓核中心，即可得到盘源性腰痛动物模型；
(5)评估该盘源性腰痛动物模型。
上述技术方案中，大鼠具有和人类脊柱及椎间盘类似的解剖结构，价格低廉，对疼痛较为敏感，且被量化检测。
在本发明中，所述的穿刺点为大鼠背部侧后方，位于第5和第6腰椎横突和上关节突之间，进针角度为45°。
在本发明中，所述穿刺椎间盘选取第4-5和第5-6水平，细针大小为26G。
在本发明中，所述PBS的给药体积为每只大鼠每个椎间盘2.5μL。
本发明还提供了一种动物模型制备方法，在X线透视引导下穿刺后，按设定的时间点对大鼠进行腰痛行为学检测，对第4-5和第5-6椎间盘进行组织学和影像学表征。
上述技术方案中通过多角度检测手段评估疾病模型的性能，使得评估结果更为准确可靠。
本发明与现有技术相比具有的有益效果是：
1、本发明在X线透视引导下，从腰部侧后入路通过椎间盘穿刺给予大鼠PBS冲液，构建盘源性腰痛动物模型，减少腹部和背部外科手术造模对肌肉、脊柱小关节、神经和韧带的损伤，使得模型更加科学合理和符合疾病发展；
2、本发明细针穿刺并注入PBS诱导椎间盘退变，无需额外加昂贵的试剂；
3、本发明手术简单、经济、微创、精准、稳定及高效；
4、本发明通过多角度检测手段评估疾病模型的性能，使得评估结果更为准确可靠；
5、本发明采用X线透视引导的方式，操作简便高效，定位准确；
6、本发明采用精准细针穿刺，无需解剖腹部或背部手术后进行椎间盘破坏等复杂外科操作，手术难度低，简单易行，感染率和死亡率低。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明提出的一种动物模型制备方法中X线透视引导细针穿刺大鼠椎间盘的示意图；
图2为本发明提出的一种动物模型制备方法中造模后2周5种腰痛行为学障碍的对比示意图；
图3为本发明提出的一种动物模型制备方法中造模后2周腰椎间盘HE和番红固绿染色示意图；
图4为本发明提出的一种动物模型制备方法中造模后2周腰椎间盘磁共振T2WI成像结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一
参照图1-4，一种动物模型制备方法，包括以下步骤：
(1)实验动物准备：准备230g健康成年Sprague Dawley大鼠；
(2)在大鼠背部选取细针穿刺点；
(3)在X线透视引导下，细针进入椎间盘髓核中心部位；
(4)将PBS注入椎间盘髓核中心，即可得到盘源性腰痛动物模型；
(5)评估该盘源性腰痛动物模型。
步骤(2)中穿刺点大鼠背部侧后方，位于第5和第6腰椎横突和上关节突之间，进针角度为45°；步骤(3)中中穿刺点大鼠背鼠椎间盘选取第4-5和第5-6水平，细针直径26G，长25mm，步骤(4)中PBS体积为2.5μL；X线透视引导下穿刺后，按设定的时间点对大鼠进行腰痛行为学检测，对第4-5和第5-6椎间盘进行组织学和影像学表征。
具体为：
实验材料准备：26G注射器、75酒精、水合氯醛、10％多聚甲醛、2.5μL PBS、1.5T磁共振机、膝关节线圈、X线数字胃肠机、恒温热板、丙酮、包埋蜡块、包埋机、切片机、摊片机、盖玻片、防脱载玻片、H&E染色试剂盒和正置相差显微镜等。
(1)实验动物准备：选择230g-250gg健康SD大鼠作为本实施例的模型动物。
(2)大鼠背部选取细针穿刺点；
大鼠麻醉后，在X线数字胃肠机上铺无菌铺巾，大鼠侧卧位，酒精消毒大鼠背部侧后方，髂前上棘水平大致定位第5-6椎间盘水平作为第一个穿刺点。
(3)X线透视引导下，细针进入椎间盘髓核中心部位；
细针与检查床呈45°，于腰椎横突和上关节突部位穿刺，细针抵至腰椎椎体后，在X线胃肠机透视引导进入椎间盘髓核中心(图1A-B)，并进行大鼠正位和侧位X线腰椎成像，以确保穿刺针头位于髓核中心，并左右摆动捣碎髓核(图1C-F)。
(4)将2.5μL PBS注入椎间盘髓核中心，并擦拭大鼠背部酒精保暖。
(5)评估该盘源性腰痛动物模型。
1)腰痛行为学检测
1.步态分析：半定量评估大鼠步态异常程度，腰痛组步态分析评分降低(图2A,a)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 评分(分) | 4 | 4 | 2.5 |
2.丙酮试验：用于检测大鼠对冷刺激的敏感程度,将大鼠放置在常温硬塑桌面上，罩上透明有机玻璃罩，采用移液枪喷射50ul丙酮于大鼠后爪脚趾背部皮肤，并开始计时，以丙酮开始喷洒时为0时，记录1分钟内大鼠出现丙酮诱发行为(包括震动后爪、舔后爪、或抬离桌面)，发生僵直应激的时间长度，腰痛组大鼠僵直应激的时间延长(图2B,b)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 时间(s) | 4 | 6 | 35 |
3.热板试验：检测大鼠对热刺激的敏感程度，将大鼠放于56℃恒温的热板之上后，开始计时，当大鼠出现舔后爪、摆动后爪、或跳跃等行为时，计时停止，记录大鼠出现痛觉行为所需时间，腰疼痛组大鼠热刺激后出现痛觉反应的时间缩短(图2C,c)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 时间(s) | 17 | 16 | 9 |
4.握力试验：反映大鼠腰部肌肉力量。大鼠放于高50cm网格上倒挂，迫使肌肉处于紧张状态。悬挂15s为终点，记录15秒内大鼠在网格停留时间，腰痛组大鼠抓握时间缩短(图2D,d)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 时间(s) | 12 | 11 | 4 |
5.悬尾试验：反映大鼠腰部肌张力和机械疼痛刺激程度。大鼠尾部后1/3处用胶带固定和悬挂于支架上，头部距离地面15cm，使动物呈倒挂状，大鼠为克服不正常的体位而挣扎活动，记录5分钟内大鼠挣扎时间，腰痛组大鼠挣扎时间缩短(图2E,e)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 时间(s) | 220 | 200 | 100 |
2)影像学成像检测
穿刺后2周，进行大鼠腰椎MRI T2WI成像，观察L4-5和L5-6椎间盘T2信号和高度，1.5T磁共振机型，采用膝关节线圈，称重大鼠，泡沫塑料板固定大鼠位于线圈中心，毛巾包裹保温，仰卧位，头先进，自由呼吸。腰痛组较正常组和假手术组椎间盘T2信号强度明显降低，椎间盘高度降低(图3Aa-Cc)。
3)组织学检测
穿刺后2周，处死动物，椎间盘连着临近椎体取出，进行下一步固定、脱水、包埋、切片、HE染色和番红固绿染色，观察椎间盘纤维环及髓核病理形态改变，腰痛组较正常组和假手术组，胶原纤维增多扭曲；软骨内胶原增多；纤维环增粗，形态扭曲。髓核固缩，被增生软骨细胞替代(图4A-F)。
实施例二
参照图1、图3和图4，一种动物模型制备方法，包括以下步骤：
(1)实验动物准备：准备240g健康成年Sprague Dawley大鼠；
(2)在大鼠背部选取细针穿刺点；
(3)在X线透视引导下，细针进入椎间盘髓核中心部位；
(4)将PBS注入椎间盘髓核中心，即可得到盘源性腰痛动物模型；
(5)评估该盘源性腰痛动物模型。
步骤(2)中穿刺点大鼠背部侧后方，位于第5和第6腰椎横突和上关节突之间，进针角度为45°；步骤(3)中中穿刺点大鼠背鼠椎间盘选取第4-5和第5-6水平，细针直径26G，长25mm，步骤(4)中PBS体积为2.5μL；X线透视引导下穿刺后，按设定的时间点对大鼠进行腰痛行为学检测，对第4-5和第5-6椎间盘进行组织学和影像学表征。
具体为：
实验材料准备：26G注射器、75酒精、水合氯醛、10％多聚甲醛、2.5μL PBS、1.5T磁共振机、膝关节线圈、X线数字胃肠机、恒温热板、丙酮、包埋蜡块、包埋机、切片机、摊片机、盖玻片、防脱载玻片、H&E染色试剂盒和正置相差显微镜等。
(1)实验动物准备：选择230g-250g健康SD大鼠作为本实施例的模型动物。
(2)大鼠背部选取细针穿刺点；
大鼠麻醉后，在X线数字胃肠机上铺无菌铺巾，大鼠侧卧位，酒精消毒大鼠背部侧后方，髂前上棘水平大致定位第5-6椎间盘水平作为第一个穿刺点。
(3)X线透视引导下，细针进入椎间盘髓核中心部位；
细针与检查床呈45°，于腰椎横突和上关节突部位穿刺，细针抵至腰椎椎体后，在X线胃肠机透视引导进入椎间盘髓核中心(图1A-B)，并进行大鼠正位和侧位X线腰椎成像，以确保穿刺针头位于髓核中心，并左右摆动捣碎髓核(图1C-F)。
(4)将2.5μL PBS注入椎间盘髓核中心，并擦拭大鼠背部酒精保暖。
(5)评估该盘源性腰痛动物模型。
1)腰痛行为学检测
1.步态分析：半定量评估大鼠步态异常程度，腰痛组步态分析评分降低(图2A,a)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 评分(分) | 4.1 | 4.2 | 2.6 |
2.丙酮试验：用于检测大鼠对冷刺激的敏感程度,将大鼠放置在常温硬塑桌面上，罩上透明有机玻璃罩，采用移液枪喷射50ul丙酮于大鼠后爪脚趾背部皮肤，并开始计时，以丙酮开始喷洒时为0时，记录1分钟内大鼠出现丙酮诱发行为(包括震动后爪、舔后爪、或抬离桌面)，发生僵直应激的时间长度，腰痛组大鼠僵直应激的时间延长(图2B,b)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 时间(s) | 5 | 5 | 34 |
3.热板试验：检测大鼠对热刺激的敏感程度，将大鼠放于56℃恒温的热板之上后，开始计时，当大鼠出现舔后爪、摆动后爪、或跳跃等行为时，计时停止，记录大鼠出现痛觉行为所需时间。腰疼痛组大鼠热刺激后出现痛觉反应的时间缩短(图2C,c)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 时间(s) | 18 | 17 | 8 |
4.握力试验：反映大鼠腰部肌肉力量。大鼠放于高50cm网格上倒挂，迫使肌肉处于紧张状态。悬挂15s为终点，记录15秒内大鼠在网格停留时间，腰痛组大鼠抓握时间缩短(图2D,d)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 时间(s) | 11 | 10 | 4 |
5.悬尾试验：反映大鼠腰部肌张力和机械疼痛刺激程度。大鼠尾部后1/3处用胶带固定和悬挂于支架上，头部距离地面15cm，使动物呈倒挂状，大鼠为克服不正常的体位而挣扎活动，记录5分钟内大鼠挣扎时间，腰痛组大鼠挣扎时间缩短(图2E,e)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 时间(s) | 230 | 215 | 110 |
2)影像学成像检测
穿刺后2周，进行大鼠腰椎MRI T2WI成像，观察L4-5和L5-6椎间盘T2信号和高度，1.5T磁共振机型，采用膝关节线圈，称重大鼠，泡沫塑料板固定大鼠位于线圈中心，毛巾包裹保温，仰卧位，头先进，自由呼吸，腰痛组较正常组和假手术组椎间盘T2信号强度明显降低，椎间盘高度降低(图3Aa-Cc)。
3)组织学检测
穿刺后2周，处死动物，椎间盘连着临近椎体取出，进行下一步固定、脱水、包埋、切片、HE染色和番红固绿染色，观察椎间盘纤维环及髓核病理形态改变，腰痛组较正常组和假手术组，胶原纤维增多扭曲；软骨内胶原增多；纤维环增粗，形态扭曲。髓核固缩，被增生软骨细胞替代(图4A-F)。
实施例三
参照图1、图3和图4，一种动物模型制备方法，包括以下步骤：
(1)实验动物准备：准备230g-250g健康成年Sprague Dawley大鼠；
(2)在大鼠背部选取细针穿刺点；
(3)在X线透视引导下，细针进入椎间盘髓核中心部位；
(4)将PBS注入椎间盘髓核中心，即可得到盘源性腰痛动物模型；
(5)评估该盘源性腰痛动物模型。
步骤(2)中穿刺点大鼠背部侧后方，位于第5和第6腰椎横突和上关节突之间，进针角度为45°；步骤(3)中中穿刺点大鼠背鼠椎间盘选取第4-5和第5-6水平，细针直径26G，长25mm，步骤(4)中PBS体积为2.5μL；X线透视引导下穿刺后，按设定的时间点对大鼠进行腰痛行为学检测，对第4-5和第5-6椎间盘进行组织学和影像学表征。
具体为：
实验材料准备：26G注射器、75酒精、水合氯醛、10％多聚甲醛、2.5μL PBS、1.5T磁共振机、膝关节线圈、X线数字胃肠机、恒温热板、丙酮、包埋蜡块、包埋机、切片机、摊片机、盖玻片、防脱载玻片、H&E染色试剂盒和正置相差显微镜等。
(1)实验动物准备：选择230g-250g健康SD大鼠作为本实施例的模型动物。
(2)大鼠背部选取细针穿刺点；
大鼠麻醉后，在X线数字胃肠机上铺无菌铺巾，大鼠侧卧位，酒精消毒大鼠背部侧后方，髂前上棘水平大致定位第5-6椎间盘水平作为第一个穿刺点。
(3)X线透视引导下，细针进入椎间盘髓核中心部位；
细针与检查床呈45°，于腰椎横突和上关节突部位穿刺，细针抵至腰椎椎体后，在X线胃肠机透视引导进入椎间盘髓核中心(图1A-B)，并进行大鼠正位和侧位X线腰椎成像，以确保穿刺针头位于髓核中心，并左右摆动捣碎髓核(图1C-F)。
(4)将2.5μL PBS注入椎间盘髓核中心，并擦拭大鼠背部酒精保暖。
(5)评估该盘源性腰痛动物模型。
1)腰痛行为学检测
1.步态分析：半定量评估大鼠步态异常程度，腰痛组步态分析评分降低(图2A,a)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 评分(分) | 5 | 4 | 2.5 |
2.丙酮试验：用于检测大鼠对冷刺激的敏感程度,将大鼠放置在常温硬塑桌面上，罩上透明有机玻璃罩，采用移液枪喷射50ul丙酮于大鼠后爪脚趾背部皮肤，并开始计时，以丙酮开始喷洒时为0时，记录1分钟内大鼠出现丙酮诱发行为(包括震动后爪、舔后爪、或抬离桌面)，发生僵直应激的时间长度，腰痛组大鼠僵直应激的时间延长(图2B,b)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 时间(s) | 4 | 5 | 36 |
3.热板试验：检测大鼠对热刺激的敏感程度，将大鼠放于56℃恒温的热板之上后，开始计时，当大鼠出现舔后爪、摆动后爪、或跳跃等行为时，计时停止，记录大鼠出现痛觉行为所需时间。腰疼痛组大鼠热刺激后出现痛觉反应的时间缩短(图2C,c)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 时间(s) | 16 | 16 | 9 |
4.握力试验：反映大鼠腰部肌肉力量。大鼠放于高50cm网格上倒挂，迫使肌肉处于紧张状态。悬挂15s为终点，记录15秒内大鼠在网格停留时间，腰痛组大鼠抓握时间缩短(图2D,d)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 时间(s) | 12 | 13 | 4 |
5.悬尾试验：反映大鼠腰部肌张力和机械疼痛刺激程度。大鼠尾部后1/3处用胶带固定和悬挂于支架上，头部距离地面15cm，使动物呈倒挂状，大鼠为克服不正常的体位而挣扎活动，记录5分钟内大鼠挣扎时间，腰痛组大鼠挣扎时间缩短(图2E,e)。
| 类型 | 正常组 | 假手术组 | 盘源性腰痛组 |
| 时间(s) | 210 | 200 | 120 |
2)影像学成像检测
穿刺后2周，进行大鼠腰椎MRI T2WI成像，观察L4-5和L5-6椎间盘T2信号和高度，1.5T磁共振机型，采用膝关节线圈，称重大鼠，泡沫塑料板固定大鼠位于线圈中心，毛巾包裹保温，仰卧位，头先进，自由呼吸。腰痛组较正常组和假手术组椎间盘T2信号强度明显降低，椎间盘高度降低(图3Aa-Cc)。
3)组织学检测
穿刺后2周，处死动物，椎间盘连着临近椎体取出，进行下一步固定、脱水、包埋、切片、HE染色和番红固绿染色，观察椎间盘纤维环及髓核病理形态改变，腰痛组较正常组和假手术组，胶原纤维增多扭曲；软骨内胶原增多；纤维环增粗，形态扭曲。髓核固缩，被增生软骨细胞替代(图4A-F)。
由以上结果可知，本实施例中在X线透视引导下，从腰背侧后入路通过椎间盘穿刺给予大鼠PBS冲液，可以构建盘源性腰痛动物模型。本发明操作简便、经济实用、精准微创、无需额外昂贵试剂，且造模后动物疼痛行为反应、影像和组织学表现与临床盘源性腰痛患者相似，因此，本发明构建的盘源性腰痛动物模型是可行的。
本发明未详述之处，均为本领域技术人员的公知技术。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种动物模型制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)实验动物准备：准备230g-250g健康成年Sprague Dawley大鼠；
(2)在大鼠背部选取细针穿刺点；
(3)在X线透视引导下，细针进入椎间盘髓核中心部位；
(4)将PBS注入椎间盘髓核中心，即可得到盘源性腰痛动物模型；
(5)评估该盘源性腰痛动物模型。
2.根据权利要求1所述的一种动物模型制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中穿刺点大鼠背部侧后方，位于第5和第6腰椎横突和上关节突之间，进针角度为45°。
3.根据权利要求1所述的一种动物模型制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中中穿刺点大鼠背鼠椎间盘选取第4-5和第5-6水平，细针直径26G，长25mm。
4.根据权利要求1所述的一种动物模型制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中PBS体积为2.5μL。
5.根据权利要求1-4中任意一种所述的一种动物模型制备方法，其特征在于：X线透视引导下穿刺后，按设定的时间点对大鼠进行腰痛行为学检测，对第4-5和第5-6椎间盘进行组织学和影像学表征。
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|---|---|---|---|
| CN202011637571.8A CN112825813A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种动物模型制备方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202011637571.8A CN112825813A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种动物模型制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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|---|---|---|---|
| CN202011637571.8A Withdrawn CN112825813A (zh) | 2020-12-31 | 2020-12-31 | 一种动物模型制备方法 |
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Citations (6)
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| US20070286881A1 (en) * | 2005-07-14 | 2007-12-13 | Brian Burkinshsw | Method, composition and kit for treating degenerated disc disease and discogenic pain |
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-
2020
- 2020-12-31 CN CN202011637571.8A patent/CN112825813A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (6)
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