CN112812056B - N-吡啶-4-基苯甲酰胺Cdc37抑制剂及其衍生物和用途 - Google Patents

N-吡啶-4-基苯甲酰胺Cdc37抑制剂及其衍生物和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了通式(I)所示结构的N‑吡啶‑4‑基苯甲酰胺Cdc37抑制剂及其衍生物和用途。本发明的化合物可在细胞水平抑制Cdc37蛋白及其下游客户蛋白，用于治疗或预防的疾病包括各类明确Cdc37高表达的恶性肿瘤如结肠癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、以及神经系统癌症、白血病等。
Figure DDA0002894197930000011

Description

N-吡啶-4-基苯甲酰胺Cdc37抑制剂及其衍生物和用途
技术领域
本发明涉及药物化学，特别涉及N-吡啶-4-基苯甲酰胺Cdc37抑制剂及其衍生物和用途。
背景技术
针对恶性肿瘤目前使用的一线疗法依旧为放疗、化疗及各种高度特异性易发耐药的激酶类抑制剂，在维护正常机体安全性和广谱高效抗肿瘤性之间往往不能兼顾。
热休克蛋白质90(90kDa heat shock protein，Hsp90)正常情况下机体借助Hsp90调控基因表达、细胞增殖和细胞周期等维持细胞功能的稳态，但肿瘤细胞内Hsp90的异常调控会引起细胞内稳态失衡并导致客户蛋白质的错误折叠组装进而造成致癌蛋白质过度表达，直接促进肿瘤的发生发展。Hsp90通过二聚化并水解ATP完成折叠客户蛋白质循环，协助各类蛋白质在细胞内完成跨膜、转运，参与空间构象的正确伸展、折叠和组装等，进而维持细胞内蛋白质稳定。其中，激酶类客户蛋白质的正确折叠高度特异性依赖辅分子伴侣Cdc37(Cell Division Cycle37)。Cdc37是一种50kDa的蛋白质，负责将尚未完成折叠的不稳定癌蛋白质激酶如Cdk4，Raf-1和src靶向募集至Hsp90。其他多种与肿瘤发展进程紧密相关的Hsp90激酶类客户蛋白质，如B-Raf，p38α，SGK3，PKC， KIT，IKKβ，Rho，Cdk4，Erk5，c-Src，IRE1α，Cdk2，TDP43，IRAK1，Tau，Akt，UIK1，LKB1 等的成熟也均被发现严格依赖于Hsp90-Cdc37复合物的相互作用。作为细胞信号通路中的关键部分，Hsp90-Cdc37-激酶伴侣循环在各类原核和真核细胞中普遍存在且高度保守，调控体内大理蛋白质、激酶的折叠和成熟，并借此参与肿瘤发生发展的多个过程。
设计开发高效Hsp90抑制剂长久以来是抗肿瘤研发的热点，然而由于潜在的毒性，截至目前十余个进入临床研究阶段的Hsp90小分子抑制剂无一成功上市，后续研究工作也陷入了瓶颈。鉴于Cdc37负责募集参与肿瘤增殖的各种激酶类蛋白质至Hsp90上形成复合物。因此，抑制Cdc37可以特异性阻断Hsp90-Cdc37-激酶循环，进而在尽量少影响其他机体蛋白质正常运转的情况下完成抑制肿瘤的目标。
实验统计表明，结肠癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、神经系统癌症、白血病等多种恶性肿瘤中都出现了Cdc37高表达的现象。2019年Nature将Cdc37列为628 个抗癌靶点中优先靶点。但迄今为止，尚无Cdc37小分子抑制剂的相关研究和报道。 Cdc37小分子抑制剂的设计与合成为安全高效广谱抗小分子抗肿瘤药物的开发提供了可能，具有极高的临床应用前景。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供具有良好活性的N-吡啶-4-基苯甲酰胺Cdc37抑制剂及其衍生物。
本发明另一目的是提供所述N-吡啶-4-基苯甲酰胺Cdc37抑制剂及其衍生物的用途。
技术方案：本发明提供一种N-吡啶-4-基苯甲酰胺Cdc37抑制剂及其衍生物，
Figure BDA0002894197910000021
X1代表羟基、硝基、氨基；
X2代表取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的C4-C10环烷基、取代或未取代的3至8元杂环烷基；上述取代的芳基、取代的杂芳基、取代的 C4-C10环烷基、取代的3至8元杂环烷基中的取代基为1至3个，并且各自独立地是C1-C6烷基、卤素、C1-C6烷氧基、腈基、C1-C6烷氧羰基、硝基、羧基、三氟甲基、氨基、烷胺基、酰胺基；
X3代表羟基、氨基、卤素、C1-C6烷基、卤素、C1-C6烷氧基、腈基、C1-C6烷氧羰基、硝基、羧基或三氟甲基；
X4代表羟基、氨基、卤素、C1-C6烷基、卤素、C1-C6烷氧基、腈基、C1-C6烷氧羰基、硝基、羧基或三氟甲基；
X5代表氮原子或碳原子；
X6代表氨基、酰胺基、磺酰基、羰基、酯基、氧原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧羰基、三氮唑基；
R代表带有羟基、氨基、卤素、C1-C6烷基、卤素、C1-C6烷氧基、腈基、C1-C6烷氧羰基、硝基、羧基或三氟甲基取代基的苯环。
进一步地，所述的通式(I)所示结构的N-吡啶-4-基苯甲酰胺Cdc37抑制剂及其衍生物，为如下任一种：
Figure BDA0002894197910000031
所述的N-吡啶-4-基苯甲酰胺Cdc37抑制剂及其衍生物在制备治疗Cdc37相关疾病药物中的用途。
进一步地，Cdc37相关疾病为结肠癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、神经系统癌症、白血病。
术语的定义
本文所用术语“烷基”包括1至6个碳的直链和支链饱和基团。烷基的实例为甲基、乙基、异丙基、正戊基。
本文所用术语“环烷基”表示3至8个碳的一价饱和非芳族环装烃基。环烷基的实例为环戊基、环己基。
本文所用术语“烷氧基”表示-OR取代基，其中R是C1-6烷基。烷氧基的实例为甲氧基。
本文所用术语“烷氧羰基”表示羰基取代的如本文所定义的烷氧基。烷氧羰基的实例为乙氧羰基。
本文所用术语“杂环烷基”表示在环阵列中具有3至8个原子的饱和非芳族基团，环阵列中包含1至2个杂原子，选自氮原子或氧原子，其他为碳原子。杂环烷基可以是未经取代的或被氨甲酰基或1-氨基二乙基取代。
本文所用术语“芳基”表示具有6个碳原子的不饱和芳香基团，芳基可以是未经取代的或被一个或两个独立选自下组的取代基取代：(1)C1-C6烷基；(2)卤素；(3) C1-C6烷氧基；(4)氨基；(5)硝基；(6)腈基；(7)三氟甲基。
本文所用术语“杂芳基”表示含有一个选自氮、氧和硫的杂原子的5-或6-元环。5元环具有2个双键，6元环具有三个双键。杂芳基的实例为噻吩基、呋喃基和吡啶基。
本文所用术语“卤素”表示选自氟(-F)、氯(-C1)和溴(-Br)的基团。
本文所用术语“氨基”表示-NH2基团。
本文所用术语“硝基”表示-NO2基团。
本文所用术语“腈基”表示-CN基团。
有益效果：本发明基于化合物直接针对Cdc37产生抑制作用，发现了结构新颖、具有较好理化性质的活性小分子，该小分子在各类实验中均表现出了良好的活性，有希望开发成为特异性抗肿瘤药物。
附图说明
图1为化合物8的BLI结合解离曲线，loading蛋白浓度1.19μM，拟合曲线由上至下依次为200μM，100μM，50μM，10μM，2μM，400nM；拟合KD为4.69μM；
图2化合物11的BLI结合解离曲线，loading蛋白浓度1.19μM，拟合曲线由上至下依次为200μM，100μM，50μM，10μM，2μM，400nM；拟合KD为10μM；
图3为化合物15的BLI结合解离曲线，loading蛋白浓度1.19μM，拟合曲线由上至下依次为200μM，100μM，50μM，10μM，2μM，400nM；拟合KD为6μM；
图4为化合物17的BLI结合解离曲线，loading蛋白浓度1.19μM，拟合曲线由上至下依次为200μM，100μM，50μM，10μM，2μM，400nM；拟合KD为13.3μM；
图5为化合物23的BLI结合解离曲线，loading蛋白浓度1.19μM，拟合曲线由上至下依次为200μM，100μM，50μM，10μM，2μM，400nM；拟合KD为0.19μM；
图6为化合物8的热漂移曲线，以箭头标注的释放峰值所对应的浓度从左至右依次为200μM、100μM、50μM、5μM；
图7为化合物11的热漂移曲线，以箭头标注的释放峰值所对应的浓度从左至右依次为200μM、100μM、50μM、5μM；
图8为为化合物15的热漂移曲线，以箭头标注的释放峰值所对应的浓度从左至右依次为200μM、100μM、50μM、5μM；
图9为化合物17的热漂移曲线，以箭头标注的释放峰值所对应的浓度从左至右依次为200μM、100μM、50μM、5μM；
图10为化合物23的热漂移曲线，以箭头标注的释放峰值所对应的浓度从左至右依次为200μM、5μM、50μM、100μM；
图11为采用两种不同类型的阴性化合物平行实验结果，选取浓度为20μM，均无热漂移；
图12为化合物热量变化实验结果，其中，(A)化合物11的热量变化曲线，化合物浓度设置为200μM，蛋白浓度设置为22μM；(B)化合物11的热量变化曲线，化合物浓度设置为200μM，蛋白浓度设置为22μM；
图13为化合物对HCT-116细胞的抑制实验结果，其中，(A)化合物8的HCT-116 细胞抑制曲线，设置浓度梯度为200μM，100μM，50μM，10μM，2μM和400nM；(B) 化合物11的HCT-116细胞抑制曲线，设置浓度梯度为200μM，100μM，50μM，10μM， 2μM和400nM；(C)化合物15的HCT-116细胞抑制曲线，设置浓度梯度为200μM， 66μM，22μM，7.4μM，2.4μM、820nM、270nM、90nM、30nM；(D)化合物23的 HCT-116细胞抑制曲线，设置浓度梯度为200μM，100μM，50μM，10μM，2μM和400nM。
具体实施方式
下面是本发明的部分代表化合物的部分药理试验及结果：
1.Cdc37蛋白的制备和生物素化
将Cdc37的质粒DNA克隆至pET28a载体(订购自上海齐合生物技术有限公司)，取出3μl质粒至一支感受态大肠杆菌株BL21，混合均匀后于冰上放置10min，取混合质粒的感受态细胞于42℃热激120s，再放回冰上5min。加入800μl培养基混匀后，37℃摇床培育2h。将培育后的菌株3000rpm离心5min，吸去上清700μl，取10μl于含有卡那霉素的琼脂LB培养基中于37℃温度环境中过夜培养。
挑取适宜的单克隆菌群，于37度条件下在包含卡那霉素(100ug/ml)的LB培养基中继续培养。当OD值达到0.6～0，8时，然后用异丙基-d-1-硫代半乳糖苷(1mm)在16c 条件下诱导蛋白质表达，诱导20h。诱导完成后，5000rpm离心15min去上清，保留菌体，-80℃保存半小时。
蛋白质纯化：将冷冻保存的大肠杆菌混悬于裂解液中(20mM tris-HCl(pH7.4)，200 mM NaCl，and 1mM DTT)。采用超声波破碎40min，取破碎后的浊液置于温度为4℃，离心转速为12000rpm的恒温离心机中离心30min，弃去下层固体。取上层清液用0.45μm 的过滤器过滤后，利用ACTA蛋白纯化系统进行镍柱分离，最后在HiLoad 60 Superdex200 columns柱(GE Healthcare)上进行凝胶过滤，得到纯净目标蛋白。采用SDS-PAGE凝胶电泳实验确证洗脱得到的蛋白质后，将所得蛋白质保存在磷酸盐缓冲液中，置于-80℃备用。
将Cdc37蛋白质与适量生物素混匀加入透析袋中，置于5L磷酸盐缓冲液中透析过夜，次日从透析袋中吸取生物素化完毕的蛋白质冷冻于-80℃备用。实验所用蛋白质使用EZ-Link NHS-Biotin(20217，Thermo Fisher：Scientific)进行生物素化。
2.生物膜层干涉实验(Biolayer interferometry)测定化合物Cdc37结合活性
生物膜层干涉实验(Biolayer interferometry，BLI)无须标记物、直接基于光干涉原理检测亲和力常数(KD)等动力学数据。蛋白质分子通过生物素-链霉亲和素系统牢牢结合至生物传感器表面时会覆盖一层生物膜，当传感器上的蛋白质与待检测化合物分子结合时引起传感器末端分子量发生变化，进而导致传感器表面生物膜厚度改变。光通过传感器的生物膜层后发生透射反射形成干涉，生物膜厚度的变化导致干涉光发生相对位移。生物分子结合前后光检测器检测到光波位移形成干涉光谱，以干涉图谱的实时位移 (nm)显示出来，据此可以计算出蛋白质与化合物分子之间的亲和力常数(KD)。
本实验仪器采用Octet RED96(ForteBio)测定化合物与Cdc37剂量依赖性亲和力，传感器采用SSA biosensor(ForteBio Inc.，Menlo Park，CA)。将SSA生物传感器浸入缓冲液(PBS，0.05％；bovine serum albumin，0.01％Tween 20)预湿10min平衡以挂载生物素化Cdc37蛋白。设置空白对照组，选取新的SSA生物传感器，这些传感器利用不含蛋白质的缓冲液进行孵育，其余过程与实验组完全一致。本测定实验于温度维持在25℃的96 孔黑板上进行，每孔设置体积为200ul。所有数据在Octet data analysis software进行分析。使用双扣除方法对信号进行分析，双扣除方法会减掉背景和非特异性信号对实验结果的影响。研究采用结合和解离速率为1∶1的结合模型。通过Koff/Kon比值计算出平衡离解常数KD。代表性化合物结合KD如表1，具体结合解离曲线如图1-5。
表1代表性化合物的生物膜层干涉实验KD
Figure BDA0002894197910000061
3.Cdc37结合活性的蛋白质热稳定性实验测试(Thermal shift assay)
蛋白质在水中通常以折叠的形态存在，亲水基团指向外界与水接触，而疏水基团被包裹在螺旋或折叠之中不与水接触。而加热会导致蛋白质变性，蛋白质三维结构解体将暴露出正常状态下掩蔽的疏水基团。暴露出的疏水基团与荧光染料SYPRO Orange相结合，提高荧光染料的发射光，因此可以通过检测检测体系散发的荧光强度来反映目标蛋白质的稳定性。在不同温度下，蛋白质暴露的疏水基团数量不同，因此荧光的强度也不同。荧光染料聚集于蛋白质疏水口袋，升温导致蛋白质稳定性逐渐降低，三维结构松散并释放荧光染料，从而得到近似正态分布的蛋白质熔解曲线，其峰值所对应的温度定义为Tm。与配体结合的蛋白质热稳定性会发生变化，导致荧光染料的释放速率有所变化，具体表现为蛋白质的熔解曲线发生偏移，其偏移值ΔTm能够反映测试化合物是否与蛋白质发生结合。
使用96孔板(Life technologies，CF98PV02)进行测试，测试终体积为每孔20μL。每孔分别加入1μL Cdc37端蛋白质(终浓度1μM)，1μL化合物稀释液和16μL assay buffer，室温孵育30min后，加入2μL8×荧光染料(SYPRO Orange dye，Thermo Fisher Scientific)充分混合，每个化合物设置三个复孔，每次试验设置阴性对照(1μL His-Cdc37 蛋白质、阴性化合物和19μL assay buffer)和空白对照(2μL 8×荧光染料和18μL assay buffer)。封板后利用PCR仪(StepOnePlus，Applied Biosystems)进行梯度升温程序，温度从37℃均匀升温至99℃，每分钟升温2℃。程序结束后利用Protein Thermal Shift软件v1.3(ThermoFisher Scientific)进行数据分析。ΔTm表示与化合物发生结合后Cdc37 端蛋白质熔解曲线与空白对照的熔解曲线的偏移，当ΔTm＜2℃时，可认为化合物与蛋白质没有发生结合；当化合物与Cdc37端蛋白质发生结合时，Cdc37蛋白质溶解曲线如图6-11所示，代表性化合物测试结果见表2。
表2代表性化合物的Thermal shift assayΔTm
Figure BDA0002894197910000071
a化合物和Cdc37蛋白质孵育0.5h后的蛋白质熔解曲线测试结果。
4.等温量热滴定法(ITC)实验
等温量热滴定法(Isothermal Titration Calorimetry，ITC)是一种热力学分析技术，使用目标化合物滴定靶标蛋白质。蛋白质与分子结合将使整个体系熵减，因此结合的过程会释放出热量。通过测量反应体系放热的变化可以计算出化合物分子与蛋白相互作用时的亲和常数Kd。
本实验采用MicroCal ITC200测定Cdc37蛋白质与化合物的结合亲和力。预先准备实验所需Buffer(蛋白质透析液)，Cdc37蛋白与待测化合物。首先将Cdc37蛋白稀释至24μM(buffer：透析液，主要内容为1X PBS)，打入样品池；将化合物稀释至浓度 200μM(buffer与蛋白保持一致)吸入滴定器中，开始滴定。整个滴定过程保持间隔180s，转速1000rpm，共计19滴。为了保证实验的准确性，第一滴滴定体积设置为0.5μL。最终使用Origin软件进行分析实验结果，确定结合参数。参数包括结合常数(Ka＝1/ Kd)，焓值(H)和熵值(S)。
测试结果表明，化合物与Cdc37热力学角度存在结合。
选取代表性化合物滴定结果如表3，热量变化曲线如图12。
表3代表性化合物Isothermal Titration Calorimetry实验结果
Figure BDA0002894197910000081
5.基于人类结肠癌细胞HCT116细胞株的MTT抗增殖试验
测试本发明化合物对人类结肠癌细胞HCT116细胞株的抗增殖活性。将HCT116细胞(购自中科院上海细胞库)采用含有10％胎牛血清(gibco)的RPMI-1640培养基(gibco)，于37℃、5％CO2条件下培养。
(1)将处于对数生长期的两种细胞用0.25％胰酶消化液处理，制成浓度为4×105的细胞悬液。将HCT116接种于96孔板中(每孔约4000个细胞，100ul培养基)，在37℃， 5％CO2条件下孵育24h。
(2)将待测化合物用培养基配置成3倍于所需浓度，分别向对应的孔中加入100μL，为阴性对照，DMSO为空白对照。将加好化合物的96孔酶标板至于37℃、5％CO2恒温、饱和湿度的条件下孵育72h。
(3)每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml，PBS配置后0.22μM过滤除菌)，37℃继续孵育4h后，移去培养基，每孔加入150μL DMSO，采用Molecular devices SpectraMax i3X 在490nM下读取吸收值，并用GraphPad Prism 8.0分析结果，计算IC50。代表性化合物测试结果见表4，具体化合物生长抑制曲线见图13。
表4代表性化合物的MTT活性
Figure BDA0002894197910000091
实施例1：
Figure BDA0002894197910000092
步骤1：4-硝基-2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶的制备
Figure BDA0002894197910000093
将2-溴-4-硝基吡啶(1g，4.93mmol)与三甲基硅炔(0.8ml，10.79mmol)加入100ml圆底烧瓶，并溶解于预先放置于烧瓶内的30ml乙腈中。向烧瓶中加入双三苯基膦二氯化钯(30mg，0.042mmol)、碘化亚铜(90mg，0.47mmol)及三乙胺(2ml，29.58mmol)，将整个反应体系置于氮气保护中，78℃冷凝回流反应3小时，反应液变为深红棕色。TLC 监测反应结束，利用石油醚乙酸乙酯体系20∶1硅胶柱层析得到淡棕色目标产物610mg，产率56％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.95(d，J＝5.3Hz，1H)，8.20(s，1H)，8.17(d，J ＝5.8Hz，1H)，0.31(s，9H).
ESI-MS：m/z 220.07
步骤2：2-乙炔基-4-硝基吡啶的制备
Figure BDA0002894197910000101
将4-硝基-2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶(420mg，1.91mmol)与氟化钾固体(133mg， 2.29mmol)溶于甲醇(40ml)中，室温搅拌过夜。TLC监测反应结束，除去溶剂，将残余固体与乙酸乙酯充分混合并抽滤，旋干得目标产物250mg，产率88.65％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.97(dd，J＝5.5，0.8Hz，1H)，8.26(dd，J＝2.2，0.8Hz，1H)，8.19(dd，J＝5.5，2.2Hz，1H)，4.70(s，1H).
步骤3：苄基叠氮的制备
Figure BDA0002894197910000102
将溴苄(1g，5.85mmol)与NaN3(570mg，8.77mmol)溶于20ml二甲基亚砜(DMSO) 中，80℃冷凝回流反应过夜。TLC监测反应结束，加入50ml乙酸乙酯转移至分液漏斗中，用30ml水洗涤5次除去DMSO，有机相利用无水硫酸钠干燥，旋干除去溶剂后得到淡黄色透明液体(693mg，产率89％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.72(m，5H)， 4.34(s，2H)。
步骤4：2-(1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)-4-硝基吡啶的制备
Figure BDA0002894197910000103
将苄基叠氮(540mg，4.05mmol)与2-乙炔基-4-硝基吡啶(500mg，3.38mmol)溶于甲醇中，加入碘化亚铜(128mg，0.67mmol)，50℃冷凝回流反应3小时。TLC监测反应结束，硅藻土抽滤得到目标产物。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.00(dd，J＝5.4，0.7Hz， 1H)，8.92(s，1H)，8.59(dd，J＝2.3，0.7Hz，1H)，8.10(dd，J＝5.4，2.2Hz，1H)，7.45-7.36(m， 5H)，5.74(s，2H).
步骤5：2-(1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)吡啶-4-胺的制备
Figure BDA0002894197910000111
将2-(1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)-4-硝基吡啶溶于乙酸乙酯中，加入氯化亚锡，78℃冷凝回流反应过夜。TLC监测反应结束，向反应液中加入过量饱和碳酸氢钠溶液，见大量灰色固体析出。将乙酸乙酯与水混合溶液利用砂芯布什漏斗进行抽滤，上层滤饼使用乙酸乙酯(20ml)洗涤3次，下层1H NMR(300MHz，DMSO-d6)2H).δ9.20(s，1H)，8.81 (s，1H)，8.58(s，1H)，8.17(d，J＝5.6Hz，1H)，7.50-7.24(m，7H)，6.65(dd，J＝5.7，2.2Hz， 1H)，5.67(s，2H)
步骤6：N-(2-(1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)吡啶-4-基)-5-氯-2-羟基苯甲酰胺的制备
Figure BDA0002894197910000112
将2-(1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)吡啶-4-胺(250mg，0.9mmol)与5-氯水杨酸(206mg， 1.19mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)(385mg， 2.98mmol)与1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(Pybop)(1g，2mmol)室温搅拌过夜。TLC监测反应结束，加入50ml乙酸乙酯转移至分液漏斗中，用30ml 水洗涤5次除去DMF，有机相利用无水硫酸钠干燥，旋干除去溶剂利用石油醚乙酸乙酯体系20∶1硅胶柱层析得到产物45mg，产率11％。1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ8.80 (s，1H)，8.71(d，J＝5.6Hz，1H)，8.48(d，J＝2.1Hz，1H)，8.08(d，J＝2.2Hz，1H)，7.95(dd，J＝ 9.0，2.2Hz，1H)，7.87-7.78(m，2H)，7.50-7.34(m，5H)，5.73.(s，1H)
实施例2：
步骤1：2-苯氧基吡啶-4-胺的制备
Figure BDA0002894197910000121
将2-氟吡啶-4-胺(1g，8mmol)和苯酚(6.72g，71.36mmol)溶于DMF(30ml)中，加入DIPEA(3.46g，26.76mmol)和无水碳酸钾(4.93g，35.68mmol)，整个反应体系利用氮气保护，150℃冷凝回流过夜。TLC监测反应结束，向反应液中加入乙酸乙酯 (60ml)，使用饱和氢氧化钠溶液(30ml)洗涤五次除去苯酚和DMF，有机相利用无水硫酸钠干燥，旋干除去溶剂得到淡红色透明油状产物660mg，产率40％。1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ7.67(d，J＝2.6Hz，1H)，7.44-7.35(m，2H)，7.16(ddt，J＝7.9，7.0，1.1 Hz，1H)，7.10-7.05(m，2H)，6.33(dd，J＝5.7，1.9Hz，2H)，6.21(s，3H)，6.03(d，J＝1.9Hz， 2H).
步骤2：5-氯-2-羟基-N-(2-苯氧基吡啶-4-基)苯甲酰胺的制备
Figure BDA0002894197910000122
将2-苯氧基吡啶-4-胺(500mg，2.69mmol)溶于DMF中，加入5-氯水杨酸(556mg，3.22mmol)和氯化亚砜(479.12mg，4.03mmol)，70℃冷凝回流过夜。TLC监测反应结束，加入50ml乙酸乙酯转移至分液漏斗中，用30ml水洗涤5次除去DMF，有机相利用无水硫酸钠干燥，旋干除去溶剂利用制备板石油醚乙酸乙酯体系2∶1分离得产物 20mg，产率2％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.05(d，J＝5.7Hz，1H)，7.74(d，J＝2.9 Hz，1H)，7.50-7.40(m，3H)，7.34-7.12(m，5H)，6.82(d，J＝8.8Hz，1H).
实施例3：
步骤1：N2-苯基吡啶-2，4-二胺的制备
Figure BDA0002894197910000131
将2-氟吡啶-4-胺(500mg，4.46mmol)溶于10ml苯胺中，150℃冷凝回流过夜。TLC监测反应结束，直接上样柱层析分离PE：EA体系梯度洗脱分离得目标产物450mg，产率54％。1HNMR(300MHz，Chloroform-d)δ7.80(d，J＝5.8Hz，0H)，7.39-7.18(m，2H)， 7.05(t，J＝7.2Hz，0H)，6.13(d，J＝2.0Hz，0H)，6.07(dd，J＝5.8，2.1Hz，0H)，4.15(s，1H).
步骤2：5-氯-2-羟基-N-(2-(苯氨基)吡啶-4-基)苯甲酰胺的制备
Figure BDA0002894197910000132
将5-氯水杨酸(223.59mg，1.3mmol)、三乙胺(327mg，3.24mmol)和卡特缩合剂(1.4g， 3.24mmol)溶于DMF中，加入N2-苯基吡啶-2，4-二胺(200mg，1.08mmol)室温搅拌过夜。TLC监测反应结束。加入50ml乙酸乙酯转移至分液漏斗中，用30ml水洗涤5 次除去DMF，有机相利用无水硫酸钠干燥，旋干除去溶剂制备板分离得纯净产物35mg，产率9.5％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.77(d，J＝5.6Hz，1H)，7.42-7.20(m，5H)，7.16(dd，J＝8.7，2.7Hz，1H)，6.75(d，J＝8.7Hz，1H)，6.56(s，1H)，6.37(d，J＝5.7Hz，1H)， 6.21(s，2H).
实施例4：
步骤1：5-氯-N-(3-氯吡啶-4-基)-2-羟基苯甲酰胺的制备
Figure BDA0002894197910000133
将5-氯水杨酸(500mg，2.62mmol)溶于20ml氯化亚砜中，78℃冷凝回流，见原料完全溶解后，TLC监测反应结束。旋干除去溶剂得白色固体。将白色固体溶于10ml二甲苯中，加入3-氯吡啶-4-胺(403mg，3.14mmol)，100℃冷凝回流反应过夜，TLC监测反应结束，冷却至室温后有固体析出，抽滤分离固体，弃去滤液，乙酸乙酯洗涤固体纯化得到产物320mg，产率43％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.50(s，1H)，8.14(d，J＝ 6.4Hz，1H)，7.69(d，J＝2.8Hz，1H)，7.33(dd，J＝8.7，2.9Hz，1H)，6.93(d，J＝6.4Hz，1H)， 6.82(d，J＝8.7Hz，1H).
实施例5：
步骤1：5-氯-2-羟基-N-(嘧啶-4-基)苯甲酰胺的制备
Figure BDA0002894197910000141
将5-氯水杨酸(500mg，2.9mmol)溶于乙腈中，加入氯化亚砜(517mg，4.35mmol) 和嘧啶-4-胺(330.68mg，3.48mmol)，80℃冷凝回流过夜。TLC监测反应结束，冷却至室温见少量固体析出，旋干反应液得固体，甲醇打浆得产物220mg，产率为30.4％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ9.27(s，1H)，8.96(s，1H)，8.74(s，1H)，8.22(d，J＝7.0Hz， 1H)，7.70-7.26(m，3H)，6.85(d，J＝7.0Hz，1H).
实施例6：
步骤1：2-苯基吡啶-4-胺的制备
Figure BDA0002894197910000142
将2-溴吡啶-4-胺(500mg，2.89mmol)与苯硼酸(421.37mg，3.47mmol)溶于水中，加入碳酸铯(1.33g，8.67mmol)、双三苯基膦二氯化钯(80.86mg，0.15mmol)和碘化亚铜(87.76mg，0.29mmol)，将整个反应体系置于氮气保护中，100℃冷凝回流反应8小时。TLC监测反应结束，利用石油醚乙酸乙酯体系40∶1硅胶柱层析得到淡棕色目标产物310mg，产率62.8％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.12(t，J＝4.6Hz，1H)，7.99-7.91 (m，2H)，7.44(dt，J＝10.6，5.6Hz，3H)，7.07-7.01(m，1H)，6.54-6.45(m，1H)，6.11(s， 2H).
步骤2：5-氯-2-羟基-N-(6-硝基-[1，1′-联苯]-3-基)苯甲酰胺的制备
Figure BDA0002894197910000151
将2-苯基吡啶-4-胺和5-氯水杨酸溶于30ml二甲苯中，120℃冷凝回流反应过夜。TLC 监测反应结束，冷却至室温，见大量固体析出，抽滤除去溶剂，收集上层固体利用少量乙酸乙酯进行洗涤后再次抽滤，得到产物550mg，产率67％。1H NMR(300MHz， DMSO-d6)δ11.59(s，1H)，10.75(s，1H)，8.64(d，J＝5.5Hz，1H)，8.30(d，J＝1.9Hz，1H)，8.09-8.04(m，2H)，7.92(d，J＝2.7Hz，1H)，7.78(dd，J＝5.6，2.0Hz，1H)，7.59-7.50(m， 4H)，7.10(d，J＝8.8Hz，1H).
实施例7：
步骤1：3，5-二氯-N-(3-氯吡啶-4-基)-2-羟基苯甲酰胺的制备
Figure BDA0002894197910000152
将3，5-二氯-2-羟基苯甲酸(500mg，2.42mmol)溶于20ml氯化亚砜中，78℃冷凝回流，见原料完全溶解后，TLC监测反应结束。旋干除去溶剂得白色固体。将白色固体溶于10ml二甲苯中，加入3-氯吡啶-4-胺(465mg，3.63mmol)，150℃冷凝回流反应过夜， TLC监测反应结束，冷却至室温后有固体析出，抽滤分离固体，弃去滤液，少量乙酸乙酯和甲醇洗涤固体，纯化得到产物185mg，产率24％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ 8.77-8.53(m，2H)，8.47(s，1H)，7.78(d，J＝2.8Hz，1H)，7.55(d，J＝2.9Hz，1H).
实施例8：
步骤1：5-氯-N-(3-氯吡啶-4-基)-2-硝基苯甲酰胺的制备
Figure BDA0002894197910000161
将5-氯-2-硝基苯甲酸(500mg，2.27mmol)溶于20ml氯化亚砜中，78℃冷凝回流，见原料完全溶解后，TLC监测反应结束。旋干除去溶剂得白色固体。将白色固体溶于 10mlDMF中，加入3-氯吡啶-4-胺(465mg，3.63mmol)120℃冷凝回流反应过夜，TLC 监测反应结束，加入50ml乙酸乙酯转移至分液漏斗中，用30ml水洗涤5次除去DMF，有机相利用无水硫酸钠干燥，加入50ml乙酸乙酯转移至分液漏斗中，用30ml水洗涤5 次除去DMF，有机相利用无水硫酸钠干燥，旋干除去溶剂利用石油醚乙酸乙酯体系5∶1 硅胶柱层析得到产物450mg，产率63.4％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.69(s，1H)， 8.56(d，J＝5.4Hz，1H)，8.28(d，J＝8.8Hz，1H)，8.12(d，J＝5.5Hz，1H)，8.00(d，J＝2.3Hz， 1H)，7.91(dd，J＝8.8，2.3Hz，1 H).
步骤2：2-氨基-5-氯-N-(3-氯吡啶-4-基)苯甲酰胺的制备
Figure BDA0002894197910000162
将5-氯-N-(3-氯吡啶-4-基)-2-硝基苯甲酰胺(200mg，0.64mmol)溶于甲醇后，加入 10％钯碳(30mg)，将整个反应体系置于氢气中，室温搅拌5小时。TLC监测反应结束，向抽滤漏斗加入助滤剂硅藻土抽滤，收集滤液旋干除去溶剂得目标产物95mg，产率 52％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.76(d，J＝6.9Hz，2H)，8.42-8.32(m，2H)，7.90 (dd，J＝8.0，1.5Hz，1H)，7.39(ddd，J＝8.4，7.1，1.5Hz，1H)，7.00(d，J＝8.3Hz，1H)，6.81(q， J＝7.5，6.6Hz，1H)。

Claims (3)

1.N-吡啶-4-基苯甲酰胺Cdc37抑制剂及其衍生物，为如下任一种：
Figure FDA0003873765790000011
2.权利要求1所述的N-吡啶-4-基苯甲酰胺Cdc37抑制剂及其衍生物在制备治疗Cdc37相关疾病药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：Cdc37相关疾病为结肠癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、头颈癌、神经系统癌症、白血病。
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