CN112807441B - 还原和pH超敏感的交联聚合物前药及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种还原和pH超敏感交联聚合物前药，涉及可控交联聚合物前药技术领域，聚合物前药的结构式如式III所示：
Figure DDA0002879578050000011
本发明还提供上述聚合物前药的制备方法及应用。本发明的有益效果在于：本发明交联聚合物结构紧密，血液循环过程不易崩解；在肿瘤部位胞外原酸酯降解，粒径增大，增强滞留效应；被细胞摄取后，在谷胱甘肽和更强的酸性环境下，药物快速释放出来，引发细胞凋亡；在肿瘤细胞内酸性/还原的双重影响下，药物快速释放，从而增强药物的治疗效果。

Description

还原和pH超敏感的交联聚合物前药及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及可控交联聚合物前药技术领域，具体涉及一种还原和pH超敏感交联聚合物前药及其制备方法和应用。
背景技术
目前为止，化疗仍然是临床上治疗癌症最主要的方法。但传统化疗存在着治疗效果差，毒副作用强等缺点。为了解决这些问题，纳米药物载体被开发出来，用以提高肿瘤靶向性，维持血液循环稳定性，实现可控的药物释放等。目前主流的纳米药物载体多是通过物理嵌入抗肿瘤药物来装载药物，如阿霉素、紫杉醇、甲氨蝶呤等。
顺铂作为广谱抗癌药物，对生殖系统肿瘤(如卵巢癌、睾丸癌)有独特疗效，可与多种抗肿瘤药物协同作用。但由于顺铂在体内的非特异性分布，化疗常伴有全身毒性。此外，顺铂难以通过物理包埋的方式嵌入纳米药物载体的疏水核心，导致载药量低，在血液循环中过早释放，限制了顺铂药物递送体系在临床治疗中的进一步发展。为了开发顺铂类药物在临床上的应用，已有研究通过化学修饰将二价的顺铂原药氧化成四价顺铂分子，将平面的结构转变为立体的正八面体结构，并将四价顺铂与其它功能性小分子偶联，形成纳米药物载体，可以有效的延长药物在血液中稳定循环的时间，减少被网状内皮系统清除的可能性。
此外，基于肿瘤细胞快速增殖的特点，需要大量的氧气以及营养物质来供应细胞指数型增长的需求，肿瘤部位的毛细血管增生难以供应足量的氧气和营养物质。导致肿瘤部位的毛细血管壁细胞排列疏松，其细胞间隙从几十到上百纳米不等，药物可以穿过排列疏松的毛细血管壁细胞到达肿瘤部位。与此同时，肿瘤部位长期处于缺氧环境中，部分肿瘤细胞进行无氧呼吸生成了乳酸在肿瘤部位积累，这导致了从血管(pH＝7.4)到肿瘤细胞外(pH＝6.5-7.0)，再到肿瘤细胞内部(pH＝4.0-6.0)存在着一个明显的pH梯度。并且，相比于胞外，肿瘤细胞内部有较高的谷胱甘肽浓度(10mM)。
已有大量文献表明，原酸酯相较于其他酸敏感基团(缩醛、缩酮、腙键等)，在微酸环境下的水解速率要高1-4个数量级，在pH＝5的环境中，只需要数个小时即可完全水解。如公开号为CN106075460A的专利申请公开一种新型原酸酯交联剂单体及其制备酸敏感纳米药物载体的方法，该专利申请中的交联剂构建的酸敏感纳米药物载体靶向到肿瘤部位被内化后在酸性环境下可较快释放抗癌药物，但由于肿瘤细胞内有较高的谷胱甘肽浓度，基于肿瘤细胞内外独特的微环境，需要设计一种自发降解的环境响应型纳米药物载体，使其在正常组织中稳定循环，到达肿瘤部位处快速崩解，引发药物释放。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于基于肿瘤细胞内外独特的微环境，需要设计一种自发降解的环境响应型纳米药物载体，使其在正常组织中稳定循环，到达肿瘤部位处快速崩解，引发药物释放。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
一种还原和pH超敏感交联聚合物前药，所述聚合物前药的结构式如式III所示：
Figure BDA0002879578030000031
有益效果：本发明交联聚合物结构紧密，血液循环过程不易崩解；在肿瘤部位胞外原酸酯降解，粒径增大，增强滞留效应；被细胞摄取后，在谷胱甘肽和更强的酸性环境下，药物快速释放出来，引发细胞凋亡；在肿瘤细胞内酸性/还原的双重影响下，药物快速释放，从而增强药物的治疗效果。
本发明交联聚合物前药具有胞内/胞外双重的pH响应能力，双重的降解机制可以实现动态的粒径变化效果，在到达肿瘤部位后，pH约6.5～7.0，粒径变大，但药物不会被释放出来，直到被肿瘤细胞摄取后，遇到更强的酸性环境和谷胱甘肽的作用，胶束才会崩解，药物快速释放。
本发明中的交联聚合物前药，顺铂-去甲斑蝥素始终保持1:2摩尔比，经验证，在投料比一致的情况下，具有较高的可重复度，能够实现精确给药，不同批次制备的前药胶束，在产率和载药量上只在很小的范围内波动。
本发明将药物作为交联剂引入而不是作为聚合物主链的一部分，可以在此基础上延伸出更多的可操作方案，如在侧链接枝可增强靶向性的化学基团，或接枝改变亲疏水关系的化学基团以优化胶束粒径大小使其更易被细胞摄取等。
本发明还提供上述还原和pH超敏感交联聚合物前药的制备方法，所述还原和pH超敏感交联聚合物前药的合成路线如下所示：
Figure BDA0002879578030000041
有益效果：本发明以式II所示顺铂-去甲斑蝥素双药物偶联小分子前药为交联剂，与式I聚原酸酯主链交联，形成大分子交联聚合物。药物通过化学键合偶联，其结构精准度高，交联大分子结构紧密，具有良好的长效循环稳定性。通过引入酸降解基团，达到可控的药物释放效果。在肿瘤细胞内酸性/还原的双重影响下，药物快速释放，从而增强药物的治疗效果。
优选地，所述还原和pH超敏感交联聚合物前药的制备方法包括以下步骤：
将式Ⅰ所示聚原酸酯、式Ⅱ所示的顺铂-去甲斑蝥素偶联物、活化剂和三乙胺加入至反应器中，加入反应溶剂，通氮气保护条件下，室温避光搅拌48h后，纯化，即获得式III所示还原和pH超敏感的交联聚合物前药。
优选地，所述纯化包括以下步骤：将产物用冰无水乙醚沉降后，用透析袋透析，然后冷冻干燥。
优选地，所述透析液为pH 8.0的去离子水。
优选地，所述透析袋为截留分子量3.5K Da的透析袋。
优选地，所述式Ⅰ所示聚原酸酯、式Ⅱ所示的顺铂-去甲斑蝥素偶联物、活化剂、三乙胺添加量的摩尔比为2:1:(11-13):2。
有益效果：式I和式II的比例主要影响交联度的大小和成胶束后粒径大小，其中交联度越大，载药量越高。曾尝试过提高式II的比例，发现成胶束后粒径大小会增大，目前所采用比例为粒径合适范围中可得到最高载药量的比例。
优选地，所述反应溶剂为DMF、DMSO。
优选地，所述活化剂包括EDC、NHS中的一种或两种。
优选地，所述活化剂包括EDC和NHS。
优选地，所述式Ⅰ所示聚原酸酯、式Ⅱ所示的顺铂-去甲斑蝥素偶联物、EDC、NHS、三乙胺添加量的摩尔比为2:1:(5.5～6.5):(5.5～6.5):2。
本发明还提供包括一种还原和pH超敏感的交联聚合物前药胶束，所述前药胶束由上述还原和pH超敏感的交联聚合物前药制得。
有益效果：本发明中的聚合物前药胶束在血液循环过程不易崩解，在肿瘤部位胞外原酸酯降解，粒径增大，被细胞摄取后，谷胱甘肽和更强的酸性环境下，药物快速释放出来，引发细胞凋亡。
本发明中的交联聚合物胶束具有较低的临界胶束浓度，可以在低浓度下维持胶束形态。
本发明中的交联胶束在pH为5.0的时候迅速崩解，但在pH为6.8时粒径变大，这有利于粒子在肿瘤处滞留富集。
本发明中的交联胶束可以达到甚至高于原药的细胞毒性，并且有较强的剂量依赖性，浓度高时细胞杀伤作用更强。
相较于顺铂原药，交联胶束可以在血液中更长效稳定循环，并且可以在肿瘤部位更好的富集。
相较于原药顺铂，交联聚合物前药胶束对于心脏和肾脏的损伤较低，并且可以更好的杀伤肿瘤细胞，增强治疗效果。
优选地，所述还原和pH超敏感的交联聚合物前药胶束的制备方法包括以下步骤：将还原和pH超敏感的交联聚合物前药溶解在DMSO中，然后逐滴加入磷酸盐缓冲液中，搅拌后，透析，即获得前药胶束。
优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，浓度为0.01M。
优选地，所述交联聚合物前药的在DMSO中的浓度为100mg/mL。
本发明还提供上述还原和pH超敏感交联聚合物前药在药物传递系统中的应用，所述药物传递系统包括还原和pH超敏感交联聚合物前药以及药物制剂上能够接受的辅料。
有益效果：本发明中的聚合物前药可以应用于药物传递系统，用以改良传统化疗药物的缺点，增强治疗效果。
本发明还提供上述还原和pH超敏感交联聚合物前药作为抗肿瘤纳米载体的应用，所述还原和pH超敏感交联聚合物前药负载抗肿瘤药物。
有益效果：本发明中的聚合物前药还可以负载抗肿瘤药物。
优选地，所述抗肿瘤药物包括顺铂或去甲斑蝥素。
本发明的优点在于：本发明交联聚合物结构紧密，血液循环过程不易崩解；在肿瘤部位胞外原酸酯降解，粒径增大，增强滞留效应；被细胞摄取后，在谷胱甘肽和更强的酸性环境下，药物快速释放出来，引发细胞凋亡；在肿瘤细胞内酸性/还原的双重影响下，药物快速释放，从而增强药物的治疗效果。
本发明交联聚合物前药具有胞内/胞外双重的pH响应能力，双重的降解机制可以实现动态的粒径变化效果，在到达肿瘤部位后，pH约6.5～7.0，粒径变大，但药物不会被释放出来，直到被肿瘤细胞摄取后，遇到更强的酸性环境和谷胱甘肽的作用，胶束才会崩解，药物快速释放。
本发明中的交联聚合物前药，顺铂-去甲斑蝥素始终保持1:2摩尔比，经验证，在投料比一致的情况下，具有较高的可重复度，能够实现精确给药，不同批次制备的前药胶束，在产率和载药量上只在很小的范围内波动。
本发明将药物作为交联剂引入而不是作为聚合物主链的一部分，可以在此基础上延伸出更多的可操作方案，如在侧链接枝可增强靶向性的化学基团，或接枝改变亲疏水关系的化学基团以优化胶束粒径大小使其更易被细胞摄取等。
本发明以式II所示顺铂-去甲斑蝥素双药物偶联小分子前药为交联剂，与式I聚原酸酯主链交联，形成大分子交联聚合物。药物通过化学键合偶联，其结构精准度高，交联大分子结构紧密，具有良好的长效循环稳定性。通过引入酸降解基团，达到可控的药物释放效果。在肿瘤细胞内酸性/还原的双重影响下，药物快速释放，从而增强药物的治疗效果。
附图说明
图1为本发明实施例2中式Ⅱ所示化合物的1H NMR图；
图2为本发明实施例2中式III还原和pH超敏感的交联聚合物前药的1H NMR图；
图3是本发明实施例3中交联聚合物胶束的7天稳定性；
图4是本发明实施例3中交联聚合物胶束的临界胶束浓度；
图5是本发明实施例4中交联聚合物胶束在不同pH下的电位变化；
图6是本发明实施例4中交联聚合物胶束在不同pH下的粒径变化；
图7是本发明实施例4中交联聚合物胶束在不同pH下透射电镜形貌；
图8是本发明实施例4中交联聚合物胶束在不同pH下核磁跟踪降解情况；
图9是本发明实施例5中交联聚合物胶束在不同pH下铂的累积释放量；
图10是本发明实施例6中各种药物对人源肝癌细胞毒性对比图；
图11是本发明实施例6中各种药物对鼠肝腺癌细胞毒性对比图；
图12是本发明实施例7中人源肝癌细胞和鼠源肝癌细胞细胞凋亡结果图；
图13是本发明实施例8中人源肝癌细胞和鼠源肝癌细胞定量摄取结果图；
图14是本发明实施例8中人源肝癌细胞和鼠源肝癌细胞定性摄取结果图；
图15是本发明实施例9中各种药物注射后，血液中铂含量对比图；
图16是本发明实施例8中各种药物注射后，肿瘤中铂含量对比图；
图17是本发明实施例10中各种药物注射后，小鼠体重变化对比图；
图18是本发明实施例10中各种药物注射后，肿瘤体积变化对比图；
图19是本发明实施例10中各种药物注射10天后肿瘤重量对比图；
图20是本发明实施例10中各种药物注射10天后解剖肿瘤直观对比图；
图21是本发明实施例11中各种药物注射10天后，组织切片对比图。
图中，偶联小分子指式II顺铂与去甲斑蝥素偶合的前药小分子；交联聚合物前药即为还原和pH超敏感的交联聚合物前药自组装形成的胶束。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
一种还原和pH超敏感的交联聚合物前药，其结构如式III所示：
Figure BDA0002879578030000091
实施例2
还原和pH超敏感的交联聚合物前药的制备，其合成路线如下：
Figure BDA0002879578030000092
还原和pH超敏感的交联聚合物前药的制备步骤如下：
式Ⅰ合成步骤如下：
Figure BDA0002879578030000101
本实施例中式Ⅰ所示化合物及式Ⅰ所示化合物的制备步骤与公开号为CN105949467A的专利中的合成步骤相同。
式Ⅱ合成路线如下：
Figure BDA0002879578030000102
式Ⅱ具体合成步骤如下：
将H2O2水溶液氧化得到的双羟基顺铂(500mg,1.493mmol)、去甲斑蝥素(1004mg,5.972mmol)、三乙胺(催化剂量)、溶解在DMF中，65℃搅拌24小时，减压蒸馏除去溶剂。最后，通过冰乙醚沉淀两次，得到式Ⅰ顺铂-去甲斑蝥素偶联物。图1为式Ⅱ所示化合物的1H NMR图。
式III合成步骤：
在氮气保护下，将式II(300mg,0.45mmol)、EDC(517.6mg,2.7mmol)、NHS(329.9mg,2.7mmol)混合物溶解在DMF(10mL)中搅拌4h，然后将溶有式I(506.7mg,0.9mmol)的DMF(5mL)和三乙胺(0.9mmol)滴入反应溶液中，室温下避光搅拌48h后，用500毫升冰无水乙醚沉降两次，收集底部产物，用截留分子量3500Da的透析袋透析，透析液为pH 8.0的去离子水。聚合物的核磁氢谱如图2。
本实施例中将式I所示物质先溶解在DMF中，再将这含有式I的DMF逐渐滴入反应体系中，与经过EDC和NHS活化后的式II所示物质反应，以提高反应效率。三乙胺在式II物质活化完成后，与式I物质一同加入，可以防止式I中原酸酯的降解。
实施例3
还原和pH超敏感的交联聚合物前药胶束的制备及粒径稳定性与临界胶束浓度检测：
将50mg的交联聚合物前药加入到0.5mL的DMSO中充分溶解后，逐滴加入磷酸盐缓冲液(20mL，pH 7.4，0.01M)中，搅拌6h。然后，将混合物与去离子水(MWCO 3500Da)透析24h，冻干后获得交联胶束。
将交联胶束分别分散在0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液和20mg/mL的SDS溶液中，在室温下用DLS(Malvern，Zeta-sizer Nano-ZS90)测其粒径大小，每天测一次，共测7天，粒径稳定性如图3所示。
尼罗红作为探针，通过荧光分光光度计测定临界胶束浓度。在避光条件下，将交联胶束配成不同浓度样品的水溶液(1×10-7mg/mL)，加入尼罗红，使尼罗红浓度为1×10- 6mol/L。室温下静置过夜，在固定激发波长550nm、放射波长590-720nm条件下检测荧光。图线中点代表聚合物相应浓度下最大放射波长，CMC通过曲线拐点决定，如图4所示。
由图3可知：制备的交联胶束具有较稳定的结构，7天内降解较少。
由图4可知：交联聚合物胶束具有较低的临界胶束浓度，可以在低浓度下维持胶束形态。
实施例4
还原和pH超敏感的交联聚合物前药胶束的不同pH下电位和粒径的变化及核磁跟踪降解：
将交联胶束粒子用磷酸缓冲液配置成7.4、6.8、5.0、5.0/谷胱甘肽的溶液，在特定的时间点取样检测其电位和粒径大小，并用透射电镜观测观测形貌变化，如图5、图6、图7所示。同时，取适量上述样品，用磷酸缓冲液调成弱碱性后(pH约为8)，冷冻干燥，用氘代DMSO溶解，用核磁氢谱检测，如图8。
由图5可知：交联胶束在中性环境中呈现较强的负电位，随着在酸性环境中的降解，负电位逐渐减弱，这有利于粒子被细胞摄取。
由图6、图7可知：交联胶束在pH为5.0的时候迅速崩解，但在pH为6.8时粒径变大，这有利于粒子在肿瘤处滞留富集。
由图8可知：交联胶束在中性环境中相对比较稳定，而在pH 6.8条件下，原酸酯会发生水解，但是pH 5.0酸处理24h后，原酸酯已经被完全降解。
实施例5
还原和pH超敏感的交联聚合物前药胶束的不同pH下铂的累积释放量：
将实施例3中交联胶束分别分散在pH 7.4、6.8、5.0、5.0/谷胱甘肽的磷酸缓冲液中，浸没在盛有5毫升相应pH缓冲液的离心管中。在特定时间取出缓冲液检测铂的含量，并及时补充新的缓冲液。铂含量的检测方法采用硝解后用等离子体电感耦合质谱仪检测，结果如图9所示，可以看出，在pH5.0/谷胱甘肽的磷酸缓冲液中，在10h后，药物累计释放量最高。
实施例6
交联聚合物前药的细胞毒性：
将人源肝癌细胞(HepG2)和鼠源肝癌细胞(H22)在96孔板中培养，培养24h后，每孔细胞约为5,000个，去除培养基，加入180μL的新鲜培养基，分别加入20μL顺铂和去甲斑蝥素、偶联小分子(式Ⅱ所示化合物)、交联聚合物前药(药物浓度从0.5到16微克/毫升)。共培养48h后，去除培养基，加入180μL的新鲜培养基和20μL MTT共培养4h后。最后，去除培养基，加入150μL的DMSO，震荡10min后，在570nm波长下检测活细胞产生的结晶紫吸光度，计算细胞存活率，结果如图10、图11所示。
由图10、图11可知：交联胶束可以达到甚至高于原药的细胞毒性，并且有较强的剂量依赖性，浓度高时细胞杀伤作用更强。
实施例7
细胞凋亡实验：
将人源肝癌细胞(HepG2)和/或鼠源肝癌细胞(H22)接种于6孔板中。当细胞密度达到50,000个细胞/孔时，加入顺铂和去甲斑蝥素、偶联小分子(式Ⅱ所示化合物)、交联聚合物前药(顺铂浓度为16毫克/毫升)，与细胞在37℃共孵育48h，PBS洗涤每孔细胞，转移至离心管。所有细胞用FITC和PI染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡率，检测结果如图12所示，可以看出，在两种不同的细胞中，交联形成的聚合物前药在相同时间内可以达到与原药相近的凋亡效果，这个结果与MTT细胞毒性实验的结果也相符合，从上述结果可以得出，交联聚合物前药胶束被细胞摄取后，在细胞内迅速崩解，释放出药物从而引发细胞凋亡。
实施例8
交联胶束前药的细胞摄取：
将人源肝癌细胞(HepG2)和/或鼠源肝癌细胞(H22)直接接种于6孔板或6孔板的盖玻片上，分别培养24h。之后，吸去旧培养基，加入1.8mL新鲜培养基，加入用FITC标记的交联胶束培养4小时。其中一部分用多聚甲醛固定10min，hoechst3324染色3min，用新鲜PBS洗涤3次后，用共焦激光扫描显微镜(CLSM)观察和拍摄盖玻片上的HepG2。另一部分，经胰蛋白酶消化，1200rpm离心10min，PBS(0.5ml)分散，流式细胞仪测定HepG2和H22摄取含量。细胞定量摄取结果如图13所示，共聚焦定性摄取结果如图14所示。
由图13和图14可知：细胞内荧光信号表现出pH依赖性，在酸性条件下，相同时间内细胞摄取的粒子更多。
实施例9
顺铂在小鼠血液中代谢、肿瘤处富集情况：
用H22荷瘤小鼠评估交联胶束的血液代谢、肿瘤富集效果，当肿瘤组织生长到约100mm3时，将小鼠随机分为3组(18只/组)。静脉给予相同药物浓度(5mg/kg)的顺铂和去甲斑蝥素、偶联小分子、交联聚合物前药。在特定的时间点牺牲小鼠，解剖出肿瘤并通过眼球取血，硝解后用等离子体电感耦合质谱仪检测铂的含量，检测结果如图15、图16所示。
由图15、图16可以知：相较于顺铂原药，交联胶束可以在血液中更长效稳定循环，并且可以在肿瘤部位更好的富集。
实施例10
小鼠体内抗肿瘤效果评估：
用H22荷瘤小鼠评估聚合物前药的体内抗肿瘤效果，当肿瘤组织生长到约100mm3时，将小鼠随机分为4组(7只/组)。静脉给予相同药物浓度(5mg/kg)的顺铂和去甲斑蝥素、偶联小分子、交联聚合物前药。对照组为生理盐水。每天测量体重和肿瘤大小(长径“a”和短径“b”)并记录。10天后，牺牲小鼠，取肿瘤称重并拍照。肿瘤体积计算公式:肿瘤体积＝a×b×b/2
结果如图17、图18、图19、图20所示。图17是小鼠体重变化对比图；图18是肿瘤体积变化对比图；图19是小鼠肿瘤重量对比图；图20是各种药物注射10天后解剖肿瘤直观对比图。
由图17、图18、图19、图20可知，由于粒子的自身优势以及体内EPR效应，交联聚合物前药胶束表现出较好的抗肿瘤效果。
实施例11
小鼠主要器官组织切片观察
实施例10中的小鼠牺牲后，每组取一只解剖取得其主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、肿瘤)，用4％多聚甲醛固定，用石蜡包埋后用苏木精，伊红染色(H&E)，接着在荧光显微镜下观察，观察各组织器官的损伤情况，并拍照，如图21所示。
由图21可知：相较于原药顺铂，交联聚合物前药胶束对于心脏和肾脏的损伤较低，并且可以更好的杀伤肿瘤细胞，增强治疗效果。
实施例12
去甲斑蝥素的载药率的测定
经过三次以上的重复实验，使用ICP-MS计算交联聚合物前药中铂的载药率，以此推算出去甲斑蝥素的载药率，并计算出误差范围。
其中，铂的载药率为8.7％±0.56％，去甲斑蝥素的载药率为15％±0.96％。
产率在最后一步的交联反应进行了重复实验验证，为70.2％±5.9％。
结果表明：在投料比一致的情况下，具有较高的可重复度，能够实现精确给药，不同批次制备的前药胶束，在产率和载药量上只在很小的范围内波动。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种还原和pH超敏感交联聚合物前药，其特征在于：所述聚合物前药的结构式如式III所示：
Figure QLYQS_1
，
R为
Figure QLYQS_2
。
2.一种制备如权利要求1所述的还原和pH超敏感交联聚合物前药的方法，其特征在于：所述还原和pH超敏感交联聚合物前药的合成路线如下所示：
Figure QLYQS_3
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述还原和pH超敏感交联聚合物前药的制备方法包括以下步骤：
将式Ⅰ所示聚原酸酯、式Ⅱ所示的顺铂-去甲斑蝥素偶联物、活化剂和三乙胺加入至反应器中，加入反应溶剂，通氮气保护条件下，室温避光搅拌48h后，纯化，即获得式III所示还原和pH超敏感的交联聚合物前药。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述纯化包括以下步骤：将产物用冰无水乙醚沉降后，用透析袋透析，然后冷冻干燥。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述式Ⅰ所示聚原酸酯、式Ⅱ所示的顺铂-去甲斑蝥素偶联物、活化剂、三乙胺添加量的摩尔比为2:1:(11-13):2。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述反应溶剂为DMF、DMSO。
7.一种还原和pH超敏感的交联聚合物前药胶束，其特征在于：所述前药胶束由权利要求1所述的还原和pH超敏感的交联聚合物前药制得。
8.根据权利要求7所述的还原和pH超敏感的交联聚合物前药胶束，其特征在于：所述还原和pH超敏感的交联聚合物前药胶束的制备方法包括以下步骤：将还原和pH超敏感的交联聚合物前药溶解在DMSO中，然后逐滴加入磷酸盐缓冲液中，搅拌后，透析，即获得前药胶束。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105254867A (zh) * 2015-10-21 2016-01-20 中国科学院长春应用化学研究所 主链含双抗癌药两亲性高分子、制备方法及其纳米胶束
CN105949467A (zh) * 2016-03-29 2016-09-21 安徽大学 一种pH敏感两亲性接枝共聚物POEAd-g-MPEG、制备方法及其应用
CN108144067A (zh) * 2017-12-27 2018-06-12 安徽大学 四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药、其纳米胶束及制备方法和应用
CN109161022A (zh) * 2018-07-26 2019-01-08 安徽大学 四价铂配合物-原酸酯聚合物前药、其胶束及制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105254867A (zh) * 2015-10-21 2016-01-20 中国科学院长春应用化学研究所 主链含双抗癌药两亲性高分子、制备方法及其纳米胶束
CN105949467A (zh) * 2016-03-29 2016-09-21 安徽大学 一种pH敏感两亲性接枝共聚物POEAd-g-MPEG、制备方法及其应用
CN108144067A (zh) * 2017-12-27 2018-06-12 安徽大学 四价铂化合物-双环双键两亲性聚合物前药、其纳米胶束及制备方法和应用
CN109161022A (zh) * 2018-07-26 2019-01-08 安徽大学 四价铂配合物-原酸酯聚合物前药、其胶束及制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Dual Drug Backboned Shattering Polymeric Theranostic Nanomedicine for Synergistic Eradication of Patient-Derived Lung Cancer》;Yuwei Cong等;《Advanced Materials》;20180312;第30卷(第11期);摘要，Scheme 1 *

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