CN112807289A - 基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法及其使用的纳米颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法及其使用的纳米颗粒,包括如下步骤:步骤1、制备纳米颗粒,使其表面含有‑NH2、‑SH或‑COOH;步骤2、将步骤1制得的纳米颗粒对一种或多种生物活性物质进行负载,获得负载有一种或多种生物活性物质的纳米颗粒;步骤3、采用活性PEG(NHS‑PEG‑MAL、CHO‑PEG‑MAL或EDC和NH2‑PEG‑MAL)对步骤2中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有马来酰亚胺(‑MAL)或者活性酯(‑NHS)基团获得活化了的纳米颗粒;步骤4、收集处于对数生长期的细胞并培养,加入步骤3中活化了的纳米颗粒进行孵育,除去未反应的纳米颗粒;步骤5、采用PEG‑SH或PEG‑NH2封闭与细胞连接了的纳米颗粒表面的活性基团,得到载有生物活性物质的表面改造了的活细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造技术及在肿瘤免疫治疗和组织修复等领域的应用,属于细胞治疗、生物医学、药物递送治疗领域。
背景技术
利用活细胞递送生物活性物质已在很多疾病得到广泛的研究,包括艾滋病、肺结核、帕金森病、真菌感染等疾病。通常涉及的细胞多为自体细胞,如红细胞、巨噬细胞、干细胞和血小板等,这些细胞具有较高的生物相容性,完全可生物降解,不产生毒副产物。
以细胞为载体的递送系统在循环系统中寿命更长,体内药物释放时间更长,且可利用细胞的特异性功能实现活性物质的靶向递送。可通过物理、化学和材料的方法赋予这些细胞新的治疗功能,实施方法包括:1)利用多种作用力将活性物质接在细胞表面;2)将游离活性物质或载有活性物质的纳米粒包埋于细胞内。基于细胞递送活性物质的第一个临床应用是将胎盘葡萄糖脑苷脂酶包埋于红细胞中,并运送到白细胞中用于治疗戈谢病。
然而,将载有活性物质的纳米粒接于活细胞表面,实现活性物质和活细胞的时空协同联合治疗的研究还未见报道。
发明内容
本发明设计了一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法及其使用的纳米颗粒,其解决的技术问题是现有技术中没有将载有活性物质的纳米粒接于活细胞表面的技术公开。
为了解决上述存在的技术问题,本发明采用了以下方案:
一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,包括如下步骤:
步骤1、制备纳米颗粒,使其表面含有-NH2、-SH或-COOH;
步骤2、将步骤1制得的纳米颗粒对一种或多种生物活性物质进行负载,获得负载有一种或多种生物活性物质的纳米颗粒;
步骤3、采用活性PEG(NHS-PEG-MAL、CHO-PEG-MAL或EDC和NH2-PEG-MAL)对步骤2中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有马来酰亚胺(-MAL)或者活性酯(-NHS)基团获得活化了的纳米颗粒;
步骤4、收集处于对数生长期的细胞并培养,加入步骤3中活化了的纳米颗粒进行孵育,除去未反应的纳米颗粒;
步骤5、采用PEG-SH或PEG-NH2封闭与细胞连接了的纳米颗粒表面的活性基团,得到载有生物活性物质的表面改造了的活细胞。
优选地,所述步骤4中的细胞活化预处理步骤如下:将步骤1所得的纳米颗粒负载有抗原OVA,然后再与所述细胞共同孵育获得活化了的细胞使得细胞就不吞噬纳米颗粒。
优选地,步骤3中具体步骤:50-500μg步骤2中的载有活性物质PEG(NHS-PEG-MAL、CHO-PEG-MAL或EDC和NH2-PEG-MAL)的纳米颗粒分散于PBS溶液中,之后加入等体积含有10-500μg的活性PEG(NHS-PEG-MAL、CHO-PEG-MAL或EDC和NH2-PEG-MAL)并于4℃搅拌0.5-8小时,后将其用PBS洗涤并置于4℃备用。
优选地,步骤4中的具体步骤如下:收集处于对数生长期的细胞,并铺于24孔板中,每孔1 mL,细胞密度为1×104个/孔—1×108个/孔,采用无血清培养基37℃下培养;之后加入步骤3中活化了的纳米颗粒,使其终浓度为3.125-200 μg/mL,之后在4℃孵育10-120min,每15 min轻轻摇晃一次,之后用PBS洗涤细胞去除未反应的纳米颗粒,并最终获得活化了的纳米颗粒。
优选地,步骤5中的具体步骤如下:采用PEG-SH或PEG-NH2封闭与细胞连接了的纳米颗粒表面的活性基团:将PEG-SH或PEG-NH2溶解于无血清培养基中使其浓度为0.125-2mg ml−1,加入步骤(4)中的孔板中并在4℃与细胞孵育10-120 min,之后用PBS洗涤去除未反应的PEG-SH或PEG-NH2,得到载有生物活性物质的表面改造了的活细胞。
优选地,所述步骤1中使用所述的纳米颗粒为氧化硅、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒、聚乳酸PLA纳米颗粒、聚苯乙烯球、金属有机骨架(MOFs)或共价有机骨架(COFs)中的一种。
优选地,所述纳米颗粒的粒径小于500 nm。
优选地,所述步骤2中的生物活性物质为细胞因子(IL-12、IL-2、IL-4、IL-13),酶(胎盘葡萄糖脑苷脂酶、磷酸肌酸激酶)、蛋白质(β-乳球蛋白、索马鲁肽、胰岛素)、细胞集落刺激因子(GM-CSF、M-CSF)等中的一种或几种的组合。
优选地,对于所述的不同纳米颗粒,其生物活性物质的负载方式不同。
优选地,步骤4中所述的细胞种类可以是树突状细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、干细胞、红细胞、单核细胞等,只要是表面含有-NH2或-SH的细胞都可以,而且不需要预处理去提高细胞表面-NH2或-SH的含量。
一种活细胞表面改造中使用的纳米颗粒,其特征在于:其应用于上述的基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法中。
该基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法及其使用的纳米颗粒具有以下有益效果:
本发明公开的活细胞表面改造技术,可以通过选择不同的纳米颗粒、活性物质和细胞种类,将其应用于不同疾病的治疗,如肿瘤免疫治疗、下肢缺血和II型糖尿病等,具有良好的适用前景和效果。
附图说明
图1为实施例1制备的载有IL-2的SiO2-NH2(IL-2@SiO2)扫描电子显微镜照片。
图2为实施例1制备的载有IL-2的SiO2-NH2(IL-2@SiO2)DLS粒径分布图。
图3为实施例1制备的IL-2@SiO2表面改造树突状细胞的扫描电子显微镜照片。
图4为实施例1制备的不同浓度SiO2-MAL共价接于树突状细胞表面的量。
图5为实施例2制备的载有IL-2和IL-12的SiO2-NH2(IL-2/IL-12@SiO2)扫描电子显微镜照片。
图6为实施例2制备的载有IL-2和IL-12的SiO2-NH2(IL-2/IL-12@SiO2)的纳米颗粒跟踪分析(NTA)结果图。
图7为实施例2制备的载有IL-2和IL-12的SiO2表面改造了的树突状细胞抗肿瘤的机理图。
图8为实施例3制备的SiO2-SH的BET表面积和BJH孔径分布图。
图9为实施例3制备的载有β-乳球蛋白的SiO2-SH的透射电子显微镜照片。
图10为实施例3制备的SiO2-SH对β-乳球蛋白不同吸附时间的负载量和包埋率。
图11为实施例3制备的β-乳球蛋白@SiO2表面改造巨噬细胞的扫描电子显微镜照片。
图12为实施例4制备的SiO2-COOH的纳米颗粒跟踪分析(NTA)结果图。
图13为实施例4制备的SiO2-COOH对磷酸肌酸激酶不同吸附时间的负载量和包埋率。
图14为实施例4制备的磷酸肌酸激酶@SiO2表面改造平滑肌细胞的扫描电子显微镜照片。
图15为实施例4中磷酸肌酸激酶@SiO2表面改造平滑肌细胞后对细胞活力的影响(CCK-8法)。
图16为实施例5制备的SiO2-NH2的纳米颗粒跟踪分析(NTA)结果图。
图17为实施例5制备的SiO2-NH2对不同浓度磷酸肌酸激酶的负载量和包埋率。
图18为实施例5制备的蛋白/激酶@SiO2表面改造平滑肌细胞对细胞活力的影响(CCK-8法)。
图19实施例5中SiO2-NH2和SiO2-MAL在平滑肌细胞表面的吸附和共价情况。
图20为实施例6制备的载有IL-4的PLGA-NH2纳米颗粒(IL-4@PLGA)DLS粒径分布图。
图21为实施例6制备的PLGA-NH2对IL-4不同吸附时间的负载量和包埋率。
图22为实施例6中IL-4@PLGA-NH2表面改造单核细胞后对细胞活力的影响(CCK-8法)。
图23为实施例7中IL-4@PLGA-MAL与间充质干细胞共同孵育的光学照片
图24为实施例7中PLGA-NH2对不同浓度IL-4和IL-13的负载量和包埋率。
图25为实施例7中PLGA和PLGA-MAL在间充质干细胞表面的吸附和共价情况。
图26为实施例7中改造了的间充质干细胞体外培养不同时间后细胞内ROS表达水平。
图27为实施例7中改造了的间充质干细胞促进下肢血管生成的机理图。
图28为实施例8中PLGA-SH对不同浓度葡萄糖脑苷脂酶的负载量和包埋率。
图29为实施例8中改造了的红细胞体外培养不同时间后细胞内ROS表达水平。
图30为实施例8中不同浓度PEG-SH对红细胞上PLGA-MAL活性基团的封闭情况。
图31为实施例9中制备的载有索马鲁肽的ZIF-8-NH2纳米颗粒的透射电子显微镜照片。
图32为实施例9中不同浓度ZIF-8-NH2改造的单核细胞体外培养后分泌到上清中LDH水平。
图33为实施例9中RITC@ZIF-8-MAL共价接于单核细胞表面对其表面巯基含量的影响。
图34为实施例10中载有GM-CSF的ZIF-8-COOH(GM-CSF@ZIF-8)DLS粒径分布图。
图35为实施例10中ZIF-8-COOH对不同浓度GM-CSF的负载量和包埋率。
图36为实施例10中改造了的红细胞体外培养不同时间后细胞内ROS表达水平。
具体实施方式
实施例1:SiO2-NH2,IL-2,树突状细胞,NHS-PEG-MAL,PEG-SH。
一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,包括如下步骤:
(1)制备具有放射状孔径的氧化硅纳米颗粒,并修饰使其表面带有-NH2:1.0g的CTAB,1.0g的正丁醇,30.0g,0.4M的尿素,12.0 g的环己烷在25℃水浴中缓慢搅拌。然后缓慢滴入2.0 g的正硅酸乙酯(TEOS),加快转速,使得上下两相混合均匀。25℃稳定30 min后升温至70℃,搅拌20 h。20 h后取出离心,洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板,既得到具有放射状孔径的氧化硅纳米颗粒;250 mL圆底烧瓶中按顺序加入20 mL正己烷,100 mg氧化硅纳米颗粒,100 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),冷凝回流,80 ℃反应12 h,用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥得到表面含有-NH2的氧化硅纳米颗粒(SiO2-NH2);
(2)将步骤(1)得到的SiO2-NH2对IL-2进行负载,获得负载有细胞因子IL-2的氧化硅纳米颗粒(IL-2@SiO2):130 μg的SiO2-NH2分散于0.5 mL的PBS溶液中,加入0.5 mL的50 μg/mL的IL-2,37℃摇床中吸附2 h之后离心PBS洗涤3次之后,置于4℃保存待用。
(3)采用NHS-PEG-MAL对步骤(2)中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有马来酰亚胺(IL-2@SiO2-MAL):50μg步骤(2)中的IL-2@SiO2纳米颗粒分散于PBS溶液中,之后加入等体积含有10 μg的NHS-PEG-MAL并于4℃搅拌0.5小时,后将其用PBS洗涤并置于4℃备用。
(4)采用步骤(1)得到的SiO2-NH2吸附模型抗原OVA,得到负载有抗原OVA的SiO2-NH2纳米颗粒(OVA@SiO2-NH2);采用6-8周大的C57BL6小鼠,分离出其股骨和胫骨,并提取骨髓树突状细胞DC;将骨髓树突状细胞DC与OVA@SiO2-NH2共同孵育12-48 h后,离心分离得到活化了的树突状细胞。
(5)将步骤(4)中活化了的树突状细胞铺于24孔板中,每孔1 mL,细胞密度为1×104个/孔,采用无血清培养基37℃下培养;之后加入等体积3.125 μg/mL的步骤(3)中的IL-2@SiO2-MAL,之后在4℃孵育15 min,每15 min轻轻摇晃一次,之后用PBS洗涤细胞去除未反应的IL-2@SiO2-MAL。
(6)采用PEG-SH封闭与细胞连接了的SiO2表面的活性MAL基团:将PEG-SH溶解于无血清培养基中使其浓度为0.125 mg ml−1,加入步骤(4)中的孔板中并在4℃与细胞孵育10min,之后用PBS洗涤去除未反应的PEG-SH,得到载有IL-2的SiO2表面改造了的树突状细胞。
参见图1、图2、图3和图4。
图3:将步骤(5)得到的细胞用2.5%的戊二醛溶液固定30min之后,用纯水洗涤细胞4次之后,采用扫描电子显微镜SEM进行观察得到附图3。
图4:采用荧光染料罗丹明RITC对SiO2-NH2进行染色得到RITC@SiO2-NH2,之后采用NHS-PEG-MAL修饰RITC@SiO2-NH2得到RITC@SiO2-MAL,并用荧光光谱仪分析不同质量浓度的荧光强度,并做标曲如图4A所示。将树突状细胞与不同浓度的荧光SiO2-MAL(6.25-300 μgmL-1)在37 °C下孵育30 min,每10 min轻摇一次,之后收集细胞上清,并用荧光光谱仪分析上清中RITC@SiO2-MAL的荧光强度,由标曲分析出上清中RITC@SiO2-MAL的质量浓度,计算得到共价到树突状细胞表面的RITC@SiO2-MAL纳米颗粒的量,如图4B所示。
实施例2:SiO2-NH2,IL-2,IL-12,树突状细胞,NHS-PEG-MAL,PEG-SH。
一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,包括如下步骤:
(1)制备具有放射状孔径的氧化硅纳米颗粒,并修饰使其表面带有-NH2:1.0g的CTAB,1.0g的正丁醇,30.0g,0.4M的尿素,12.0 g的环己烷在25℃水浴中缓慢搅拌。然后缓慢滴入2.0 g的正硅酸乙酯(TEOS),加快转速,使得上下两相混合均匀。25℃稳定30 min后升温至70℃,搅拌20 h。20 h后取出离心,洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板,既得到具有放射状孔径的氧化硅纳米颗粒;250 mL圆底烧瓶中按顺序加入20 mL正己烷,100 mg氧化硅纳米颗粒,100 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),冷凝回流,80 ℃反应12 h,用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥得到表面含有-NH2的氧化硅纳米颗粒(SiO2-NH2);
(2)将步骤(1)得到的SiO2-NH2对IL-2和IL-12进行负载,获得负载有细胞因子IL-2和IL-12的氧化硅纳米颗粒(IL-2/IL-12@SiO2):130 μg的SiO2-NH2分散于0.5 mL的PBS溶液中,加入0.5 mL的24 μg/mL的IL-2,37℃摇床中吸附2 h之后离心PBS洗涤1次之后,加入0.5mL的10 μg/mL的IL-12,37℃摇床中吸附2 h之后离心PBS洗涤1次之后,置于4℃保存待用。
(3)采用NHS-PEG-MAL对步骤(2)中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有马来酰亚胺(IL-2/IL-12@SiO2-MAL):50μg步骤(2)中的IL-2/IL-12@SiO2纳米颗粒分散于PBS溶液中,之后加入等体积含有10 μg的NHS-PEG-MAL并于4℃搅拌0.5小时,后将其用PBS洗涤并置于4℃备用。
(4)采用步骤(1)得到的SiO2-NH2吸附模型抗原OVA,得到负载有抗原OVA的SiO2-NH2纳米颗粒(OVA@SiO2-NH2);采用6-8周大的C57BL6小鼠,分离出其股骨和胫骨,并提取骨髓树突状细胞DC;将DC与OVA@SiO2-NH2共同孵育12-48 h后,离心分离得到活化了的树突状细胞。
(5)将步骤(4)中活化了的树突状细胞铺于24孔板中,每孔1 mL,细胞密度为1×104个/孔,采用无血清培养基37℃下培养;之后加入等体积6.25 μg/mL的步骤(3)中的IL-2/IL-12@SiO2-MAL,之后在4℃孵育15 min,每15 min轻轻摇晃一次,之后用PBS洗涤细胞去除未反应的IL-2/IL-12@SiO2-MAL。
(6)采用PEG-SH封闭与细胞连接了的SiO2表面的活性MAL基团:将PEG-SH溶解于无血清培养基中使其浓度为0.5 mg ml−1,加入步骤(4)中的孔板中并在4℃与细胞孵育10min,之后用PBS洗涤去除未反应的PEG-SH,得到载有IL-2和IL-12的SiO2表面改造了的树突状细胞。
参见图5、图6、和图7。
图7:载有IL-2和IL-12的SiO2表面改造了的树突状细胞(改造DC)抗肿瘤的机理图,IL-12和IL-2能协同发挥抗肿瘤的效果,IL-12与IFN-γ形成正反馈回路,促进DC激活CD8+ Tc和Th1细胞,IL-2进一步刺激Tc和Th1细胞增殖,增强CD8+ Tc细胞杀伤肿瘤的能力。
实施例3:SiO2-SH,β-乳球蛋白,巨噬细胞,NHS-PEG-MAL,PEG-NH2。
一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,包括如下步骤:
(1)制备具有放射状孔径的氧化硅纳米颗粒,并修饰使其表面带有-SH:0.5 g的CTAB,0.5 g的正丁醇,15.0g,0.4M的尿素,6.0 g的环己烷在25℃水浴中缓慢搅拌。然后缓慢滴入1.0 g的正硅酸乙酯(TEOS),加快转速,使得上下两相混合均匀。25℃稳定30 min后升温至70℃,搅拌15 h。15 h后取出离心,洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板,既得到具有放射状孔径的氧化硅纳米颗粒;250 mL圆底烧瓶中按顺序加入20 mL正己烷,50 mg氧化硅纳米颗粒,50 μL的3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS),冷凝回流,80 ℃反应12 h,用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥得到表面含有-SH的氧化硅纳米颗粒(SiO2-SH);
(2)将步骤(1)得到的SiO2-SH对β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)进行负载,获得β-lactoglobulin@SiO2:200 μg的SiO2-SH分散于4 mL的PBS溶液中,加入4 mL的50 μg/mL的β-lactoglobulin,并置于37℃摇床中吸附,不同时间之后离心取上清保存于-80℃待测β-乳球蛋白的负载量和包埋率,PBS洗涤3次之后获得β-lactoglobulin@SiO2,置于4℃下保存待用。
(3)采用NHS-PEG-MAL对步骤(2)中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有活性酯(β-lactoglobulin@SiO2-NHS):100μg步骤(2)中的β-lactoglobulin@SiO2纳米颗粒分散于PBS溶液中,之后加入等体积含有100 μg的NHS-PEG-MAL并于4℃搅拌1小时,后将其用PBS洗涤并置于4℃备用。
(4)采用6-8周大的C57BL6小鼠,分离出其股骨和胫骨,并提取骨髓来源巨噬细胞,采用MCSF体外培养6天后得到M2型巨噬细胞,收集M2型巨噬细胞,并铺于24孔板中,每孔1mL,细胞密度为1×106个/孔,采用无血清培养基37℃下培养;之后加入等体积12.5 μg/mL的步骤(3)中的β-lactoglobulin@SiO2-NHS,之后在4℃孵育45 min,每15 min轻轻摇晃一次,促使纳米颗粒表面NHS基团与细胞表面游离伯氨基反应,之后用PBS洗涤细胞去除未反应的β-lactoglobulin@SiO2-NHS。
(5)采用PEG-NH2封闭与细胞连接了的SiO2表面的活性酯NHS基团:将PEG-NH2溶解于无血清培养基中使其浓度为1 mg ml−1,加入步骤(4)中的孔板中并在4℃与细胞孵育30min,之后用PBS洗涤去除未反应的PEG-NH2,得到载有β-lactoglobulin的SiO2表面改造了的M2型巨噬细胞。
见图8、图9、图10和图11。
图11:将步骤(5)得到的巨噬细胞用2.5%的戊二醛溶液固定30min之后,用纯水洗涤巨噬细胞4次之后,采用扫描电子显微镜SEM进行观察得到附图11。
实施例4:SiO2-COOH,磷酸肌酸激酶,平滑肌细胞,EDC和NH2-PEG-MAL,PEG-SH。
一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,包括如下步骤:
(1)制备具有放射状孔径的氧化硅纳米颗粒,并修饰使其表面带有-COOH:2.0 g的CTAB,2.0 g的正丁醇,60 g,0.4M的尿素,24 g的环己烷在25℃水浴中缓慢搅拌。然后缓慢滴入4.0 g的正硅酸乙酯(TEOS),加快转速,使得上下两相混合均匀。25℃稳定30 min后升温至70℃,搅拌24 h。24 h后取出离心,洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧10 h以去除模板,既得到具有放射状孔径的氧化硅纳米颗粒;之后加入到含有2 mg/mL的3,4-二羟基苯乙酸的Tris-HCl(50 mM,pH 8.0)水溶液中,并室温下搅拌4 h,之后PBS洗涤3次,后干燥得到表面含有-COOH的氧化硅纳米颗粒(SiO2-COOH);
(2)将步骤(1)得到的SiO2-COOH对磷酸肌酸激酶(Creatine Phosphokinase)进行负载,获得Creatine Phosphokinase@SiO2:500 μg的SiO2-NH2分散于4 mL的PBS溶液中,之后加入等体积含有500 μg的磷酸肌酸激酶,并置于37℃摇床中进行吸附,不同时间之后离心取上清保存于-80℃中待测磷酸肌酸激酶的负载量和包埋率,PBS洗涤3次之后获得Creatine Phosphokinase@SiO2,置于4℃下保存待用。
(3)采用EDC和NH2-PEG-MAL对步骤(2)中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有马来酰亚胺(Creatine Phosphokinase@SiO2-MAL):500 μg步骤(2)中的CreatinePhosphokinase@SiO2纳米颗粒分散于pH 5.5的PBS溶液中,之后加入100 μg的EDC和500 μg的NH2-PEG-MAL并于4℃搅拌8小时,后将其用PBS洗涤并置于4℃备用。
(4)收集处于对数生长期的平滑肌细胞,并铺于24孔板中,每孔1 mL,细胞密度为1×108个/孔,采用无血清培养基37℃下培养;之后加入等体积200 μg/mL的步骤(3)中的Creatine Phosphokinase@SiO2-MAL,之后在4℃孵育120 min,每15 min轻轻摇晃一次,之后用PBS洗涤细胞去除未反应的β-Creatine Phosphokinase@SiO2-MAL。
(5)采用PEG-SH封闭与细胞连接了的SiO2表面的活性MAL基团:将PEG-SH溶解于无血清培养基中使其浓度为2 mg ml−1,加入步骤(4)中的孔板中并在4℃与细胞孵育120 min,之后用PBS洗涤去除未反应的PEG-SH,得到载有Creatine Phosphokinase的SiO2表面改造了的平滑肌细胞。
见图12、图13、图14和图15。
图14:将步骤(5)得到的平滑肌细胞用2.5%的戊二醛溶液固定30min之后,用纯水洗涤平滑肌细胞4次之后,采用扫描电子显微镜SEM进行观察得到附图14。
图15:在步骤(4)中,改用不同浓度的Creatine Phosphokinase@SiO2-MAL来对平滑肌细胞进行表面改造,并用CCK-8试剂盒评估改造之后继续培养细胞0 h和24 h的细胞活力。
实施例5:SiO2-NH2,β-乳球蛋白/磷酸肌酸激酶,平滑肌细胞,CHO-PEG-MAL,PEG-SH。
一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,包括如下步骤:
(1)制备具有放射状孔径的氧化硅纳米颗粒,并修饰使其表面带有-SH:0.5 g的CTAB,0.5 g的正丁醇,15.0g,0.4M的尿素,6.0 g的环己烷在25℃水浴中缓慢搅拌。然后缓慢滴入1.0 g的正硅酸乙酯(TEOS),加快转速,使得上下两相混合均匀。25℃稳定30 min后升温至70℃,搅拌15 h。15 h后取出离心,洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板,既得到具有放射状孔径的氧化硅纳米颗粒;250 mL圆底烧瓶中按顺序加入20 mL正己烷,50 mg氧化硅纳米颗粒,50 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),冷凝回流,80 ℃反应12 h,用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥得到表面含有-NH2的氧化硅纳米颗粒(SiO2-NH2);
(2)将步骤(1)得到的SiO2-NH2对β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)和磷酸肌酸激酶进行负载,获得同时载有蛋白和激酶的SiO2(蛋白/激酶@SiO2):130 μg的SiO2-NH2分散于0.5 mL的PBS溶液中,加入0.5 mL的50 μg/mL的β-乳球蛋白,并置于37℃摇床中吸附2小时,之后离心取上清保存于-80℃待测β-乳球蛋白的负载量和包埋率,PBS洗涤3次之后,加入0.5 mL的不同浓度的磷酸肌酸激酶(3-48 μg mL),再吸附2小时,之后离心取上清保存于-80℃待测磷酸肌酸激酶的负载量和包埋率,PBS洗涤3次之后,获得蛋白/激酶@SiO2,置于4℃下保存待用。
(3)采用CHO-PEG-MAL对步骤(2)中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有马来酰亚胺(蛋白/激酶@SiO2-MAL):100 μg步骤(2)中的蛋白/激酶@SiO2纳米颗粒分散于PBS溶液中,之后加入等体积含有100 μg的CHO-PEG-MAL并于4℃搅拌1小时,后将其用PBS洗涤并置于4℃备用。
(4)收集处于对数生长期的平滑肌细胞,并铺于24孔板中,每孔1 mL,细胞密度为1×106个/孔,采用无血清培养基37℃下培养;之后加入等体积12.5 μg/mL的步骤(3)中的蛋白/激酶@SiO2-MAL,之后在4℃孵育45 min,每15 min轻轻摇晃一次,之后用PBS洗涤细胞去除未反应的蛋白/激酶@SiO2-MAL。
(5)采用PEG-SH封闭与细胞连接了的SiO2表面的活性MAL基团:将PEG-SH溶解于无血清培养基中使其浓度为1 mg ml−1,加入步骤(4)中的孔板中并在4℃与细胞孵育30 min,之后用PBS洗涤去除未反应的PEG-SH,得到载有β-lactoglobulin的SiO2表面改造了的平滑肌细胞。
参见图16、图17、图18和图19。
图18:在步骤(4)中,改用不同浓度的蛋白/激酶@SiO2-MAL来对平滑肌细胞进行表面改造,并用CCK-8试剂盒评估改造之后继续培养细胞0 h和24 h的细胞毒性。
图19:采用荧光染料罗丹明RITC对SiO2-NH2进行染色得到RITC@SiO2-NH2,之后采用CHO-PEG-MAL修饰RITC@SiO2-NH2得到RITC@SiO2-MAL,之后将平滑肌细胞分别与荧光SiO2-NH2和荧光SiO2-MAL在37 °C下孵育30 min,每10 min轻摇一次,之后收集平滑肌细胞并PBS洗涤,并流式分析RITC的阳性率(Positive rate)和荧光强度得到图19。由图19可以看出,平滑肌细胞表面能吸附少量SiO2-NH2,这是因为SiO2-NH2表面带正点,而细胞膜表面带负电,所以会有部分纳米颗粒吸附于细胞表面,而几乎所有的平滑肌细胞都能共价上SiO2-MAL纳米颗粒。
实施例6:PLGA-NH2,IL-4,单核细胞,NHS-PEG-MAL,PEG-SH。
一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,包括如下步骤:
(1)制备PLGA纳米颗粒,并修饰使其表面带有-NH2:将PLGA-PEG-NH2溶解于0.6 mL的二氯甲烷溶液中,使其浓度为30 mg/mL,往上述溶液中逐滴滴入0.4 mL水溶液,4℃下30kw超声1 min形成初乳,将初乳滴入5 mL、2%的F127水溶液中,超声后搅拌至室温,持续搅拌使有机溶液自然挥发,得到PLGA-NH2纳米颗粒。
(2)将步骤(1)得到的PLGA-NH2对IL-4进行负载,获得IL-4@PLGA:将100 μg的IL-4溶解于0.4 mL水溶液中,并将此水溶液逐滴滴入PLGA-PEG-NH2的二氯甲烷溶液中,4℃下30kw超声1 min形成初乳,将初乳滴入5 mL、2%的F127水溶液中,超声后搅拌至室温,持续搅拌使有机溶液自然挥发,得到IL-4@PLGA纳米颗粒。
(3)采用NHS-PEG-MAL对步骤(2)中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有马来酰亚胺(IL-4@PLGA-MAL):100 μg步骤(2)中的IL-4@PLGA纳米颗粒分散于PBS溶液中,之后加入等体积含有100 μg的NHS-PEG-MAL并于4℃搅拌1小时,后将其用PBS洗涤并置于4℃备用。
(4)小鼠眼丛静脉取血,并用单核细胞分离液分离出单核细胞,无血清培养基洗涤2次,之后置于24孔板中,每孔1 mL,细胞密度为1×106个/孔,采用无血清培养基37℃下培养;之后加入等体积12.5 μg/mL的步骤(3)中的IL-4@PLGA-MAL,之后在4℃孵育45 min,每15 min轻轻摇晃一次,之后用PBS洗涤细胞去除未反应的IL-4@PLGA-MAL。
(5)采用PEG-SH封闭MAL基团:将PEG-SH溶解于无血清培养基中使其浓度为1 mgml−1,加入步骤(4)的孔板中并在4℃与细胞孵育30 min,之后用PBS洗涤去除未反应的PEG-SH,得到载有IL-4的PLGA表面改造了的单核细胞。
参见图20、图21和图22。
图22:在步骤(4)中,改用不同浓度的IL-4@PLGA-MAL对单核细胞进行表面改造,并用CCK-8试剂盒评估改造之后继续培养细胞0 h和24 h的细胞活力。
实施例7:PLGA-NH2,IL-4/IL-13,间充质干细胞,NHS-PEG-MAL,PEG-SH。
一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,包括如下步骤:
(1)制备PLGA纳米颗粒,并修饰使其表面带有-NH2:将PLGA-PEG-NH2溶解于0.6 mL的二氯甲烷溶液中,使其浓度为30 mg/mL,往上述溶液中逐滴滴入0.4 mL水溶液,4℃下30kw超声1 min形成初乳,将初乳滴入5 mL、2%的F127水溶液中,超声后搅拌至室温,持续搅拌使有机溶液自然挥发,得到PLGA-NH2纳米颗粒。
(2)将步骤(1)得到的PLGA-NH2对IL-4和IL-13进行负载,获得IL-4/IL-13@PLGA:将IL-4和IL-13溶解于0.4 mL水溶液中,使其浓度为3.125-50 μg/mL,并将此水溶液逐滴滴入PLGA-PEG-NH2的二氯甲烷溶液中,4℃下30 kw超声1 min形成初乳,将初乳滴入5 mL、2%的F127水溶液中,超声后搅拌至室温,持续搅拌使有机溶液自然挥发,离心得到IL-4/IL-13@PLGA纳米颗粒,上清保留并用ELISA法测上清中IL-4和IL-13的浓度,并计算其负载量和包埋率。
(3)采用NHS-PEG-MAL对步骤(2)中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有马来酰亚胺(IL-4/IL-13@PLGA-MAL):100 μg步骤(2)中的IL-4/IL-13@PLGA纳米颗粒分散于PBS溶液中,之后加入等体积含有100 μg的NHS-PEG-MAL并于4℃搅拌1小时,后将其用PBS洗涤并置于4℃备用。
(4)收集处于对数生长期的间充质干细胞,并铺于24孔板中,每孔1 mL,细胞密度为1×106个/孔,采用无血清培养基37℃下培养;之后加入等体积12.5 μg/mL的步骤(3)中的IL-4/IL-13@PLGA-MAL,之后在4℃孵育45 min,每15 min轻轻摇晃一次,之后用PBS洗涤细胞去除未反应的IL-4/IL-13@PLGA-MAL。
(5)采用PEG-SH封闭MAL基团:将PEG-SH溶解于无血清培养基中使其浓度为1 mgml−1,加入步骤(4)的孔板中并在4℃与细胞孵育30 min,之后用PBS洗涤去除未反应的PEG-SH,得到载有IL-4和IL-13的PLGA表面改造了的间充质干细胞。
见图23、24、图25、图26和图27。
图23:步骤(4)中IL-4/IL-13@PLGA-MAL与间充质干细胞共同孵育的光学照片
图25:采用荧光染料罗丹明RITC对PLGA-PEG-NH2进行染色得到PLGA-PEG-RITC,之后将PLGA-PEG-NH2和PLGA-PEG-RITC按照1:1的比例制备荧光PLGA纳米颗粒,之后将间充质干细胞分别与荧光PLGA和荧光PLGA-MAL在37 °C下孵育30 min,每10 min轻摇一次,之后收集间充质干细胞并PBS洗涤,并流式分析RITC的阳性率(Positive rate)和荧光强度得到图25。由图25可以看出,间充质干细胞表面能吸附少量不含MAL基团的PLGA,而几乎所有的间充质干细胞都能共价上PLGA-MAL纳米颗粒。
图26:将步骤(5)中改造了的间充质干细胞用完全培养基分散并置于37 oC中继续培养0 h,4h和24h,未改造的间充质干细胞为阴性对照组,之后采用活性氧荧光探针(DCFH-DA)检测细胞中ROS的水平并流式细胞仪器分析,所有组活性氧探针的荧光强度与阴性对照组荧光强度的比值作图,由图中结果可以看出,对间充质干细胞进行改造并不引起间充质干细胞过表达ROS,说明该改造方法具有细胞水平的生物安全性。
实施例8:PLGA-SH,胎盘葡萄糖脑苷脂酶,红细胞,NHS-PEG-MAL,PEG-NH2。
一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,包括如下步骤:
(1)制备PLGA纳米颗粒,并修饰使其表面带有-SH:将PLGA-PEG-SH溶解于0.6 mL的二氯甲烷溶液中,使其浓度为30 mg/mL,往上述溶液中逐滴滴入0.4 mL水溶液,4℃下30 kw超声1 min形成初乳,将初乳滴入5 mL、2%的F127水溶液中,超声后搅拌至室温,持续搅拌使有机溶液自然挥发,得到PLGA-SH纳米颗粒。
(2)将步骤(1)得到的PLGA-SH对葡萄糖脑苷脂酶进行负载,获得酯酶@PLGA:将葡萄糖脑苷脂酶溶解于0.4 mL水溶液中,使其浓度为50 μg/mL,并将此水溶液逐滴滴入PLGA-PEG-SH的二氯甲烷溶液中,4℃下30 kw超声1 min形成初乳,将初乳滴入5 mL、2%的F127水溶液中,超声后搅拌至室温,持续搅拌使有机溶液自然挥发,离心得到酯酶@PLGA纳米颗粒,上清保留并用BCA法测上清中葡萄糖脑苷脂酶的浓度,并计算其负载量和包埋率。
(3)采用NHS-PEG-MAL对步骤(2)中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有马来酰亚胺(酯酶@PLGA-MAL):100 μg步骤(2)中的酯酶@PLGA纳米颗粒分散于PBS溶液中,之后加入等体积含有100 μg的NHS-PEG-MAL并于4℃搅拌1小时,后将其用PBS洗涤并置于4℃备用。
(4)小鼠眼丛静脉取血,并用红细胞分离液分离出红细胞,无血清培养基洗涤2次,之后置于24孔板中,每孔1 mL,细胞密度为1×106个/孔,之后加入等体积12.5 μg/mL的步骤(3)中的酯酶@PLGA-MAL,之后在4℃孵育45 min,每15 min轻轻摇晃一次,之后用PBS洗涤细胞去除未反应的酯酶@PLGA-MAL。
(5)采用PEG-SH封闭MAL基团:将PEG-SH溶解于无血清培养基中使其浓度为1 mgml−1,加入步骤(4)的孔板中并在4℃与细胞孵育30 min,之后用PBS洗涤去除未反应的PEG-SH,得到载有葡萄糖脑苷脂酶的PLGA表面改造了的红细胞。
参见图28、图29和图30。
图29:将步骤(5)中改造了的红细胞用完全培养基分散并置于37 oC中继续培养0h,4h和24h,未改造的红细胞为阴性对照组,之后采用活性氧荧光探针(DCFH-DA)检测细胞中ROS的水平并流式细胞仪器分析,所有组活性氧探针的荧光强度与阴性对照组荧光强度的比值作图,由图中结果可以看出,对红细胞进行改造并不引起红细胞过表达ROS,说明该改造方法具有细胞水平的生物安全性。
图30:在步骤(5)中,改用不同浓度PEG-SH(0.125-2.0 mg ml−1),来封闭红细胞上PLGA表面的MAL基团,将不同浓度的PEG-SH加入步骤(4)中红细胞的孔板中并在4℃孵育30min,用PBS洗涤去除未反应的PEG-SH,之后再加入10 μg ml−1荧光染料耦合的半胱氨酸(BODIPY-tagged cysteine)并孵育30 min,用PBS洗涤去除未反应的荧光染料,流式分析细胞的荧光染料阳性率(Positive of rate (%))和平均荧光强度(MIF of BODIPY),来观察PEG-SH对活性基团MAL的封闭情况。
荧光染料耦合的半胱氨酸能与PLGA-MAL反应,所以当PEG-SH将MAL完全封闭后,半胱氨酸就不能与PLGA-MAL发生反应了。由图30可以看出,PEG-SH的浓度越高,BODIPY的Positive of rate (%)和MIF of BODIPY越低,说明PEG-SH的浓度越高,活性基团MAL封闭越完全。
实施例9:ZIF-8-NH2,GM-CSF,单核细胞,CHO-PEG-MAL,PEG-SH。
一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,包括如下步骤:
(1)制备ZIF-8纳米颗粒,并修饰使其表面带有-NH2:将283.75 mg的二甲基咪唑溶解于1 mL水溶液中,将14.63 mg的六水合硝酸锌溶于0.1 mL水溶液中,将二甲基咪唑水溶液快速倒入硝酸锌水溶液中,在室温,转速400 rpm下搅拌5min,离心并用超纯水洗,之后加入到含有2 mg/mL二羟基苯丙胺的Tris-HCl(50 mM,pH 8.0)水溶液中,并室温下搅拌4 h,之后PBS洗涤3次,得到ZIF-8-NH2纳米颗粒。
(2)将步骤(1)得到的ZIF-8-NH2对索马鲁肽(Semaglutide)进行负载,获得Semaglutide@ZIF-8:将Semaglutide溶解于1 mL的二甲基咪唑水溶液中,使其浓度为50 μg/mL,并将此水溶液快速加入0.1 mL的硝酸锌水溶液中,在室温,转速400 rpm下搅拌5min,离心并用超纯水洗,之后加入到含有2 mg/mL二羟基苯丙胺的Tris-HCl(50 mM,pH 8.0)水溶液中,并室温下搅拌4 h,之后PBS洗涤3次,得到Semaglutide@ZIF-8-NH2纳米颗粒。
(3)采用CHO-PEG-MAL对步骤(2)中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有马来酰亚胺(Semaglutide@ZIF-8-MAL):100 μg步骤(2)中的ZIF-8纳米颗粒分散于PBS溶液中,之后加入等体积含有100 μg的CHO-PEG-MAL并于4℃搅拌1小时,后将其用PBS洗涤并置于4℃备用。
(4)小鼠眼丛静脉取血,并用单核细胞分离液分离出单核细胞,无血清培养基洗涤2次,之后置于24孔板中,每孔1 mL,细胞密度为1×106个/孔,之后加入等体积12.5 μg/mL的步骤(3)中的Semaglutide@ZIF-8-MAL,之后在4℃孵育45 min,每15 min轻轻摇晃一次,之后用PBS洗涤细胞去除未反应的Semaglutide@ZIF-8-MAL。
(5)采用PEG-SH封闭MAL基团:将PEG-SH溶解于无血清培养基中使其浓度为1 mgml−1,加入步骤(4)的孔板中并在4℃与细胞孵育30 min,之后用PBS洗涤去除未反应的PEG-SH,得到载有索马鲁肽的ZIF-8表面改造了的单核细胞。
图31,图32和图33
图32:在步骤(4)中,改用不同浓度的Semaglutide@ZIF-8-MAL对单核细胞进行表面改造,并用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒评估改造细胞继续培养24 h后,细胞上清中LDH的水平,采用含不同浓度Triton X-100的完全培养基为阳性对照组,未改造的单核细胞为阴性对照。收集细胞离心,取100 μL细胞上清与100 μL的LDH反应液混合并加入96孔板中,室温下摇晃30 min之后酶标仪读取490 nm处吸光度,样品的吸光度与阴性对照的比值为纵坐标,不同Semaglutide@ZIF-8-MAL的浓度为横坐标作图得到图32。由图32可以看出,不同浓度纳米颗粒对单核细胞改造后并不会增大其LDH分泌的水平,说明单核细胞的细胞膜依然保持良好的通透性。
图33:采用绿色荧光染料RITC对索马鲁肽进行染色,并将其包埋入ZIF-8纳米颗粒中,得到RITC@ZIF-8-NH2,按照上述步骤采用CHO-PEG-MAL对其进行修饰,得到RITC@ZIF-8-MAL,将此荧光纳米颗粒按照上述步骤改造单核细胞,之后采用荧光染料Pheoa-MAL去竞争染色单核细胞表面的巯基。之后采用流式细胞仪分析细胞表面RITC@ZIF-8-MAL和Pheoa-MAL的荧光强度,来分析细胞表面共价ZIF-8-MAL对细胞表面巯基含量的影响。如图33所示,ZIF-8接于单核细胞表面仅占用细胞表面4.37%的巯基量,也就是说对单核细胞表面巯基含量的影响很小。
实施例10:ZIF-8-COOH,索马鲁肽,红细胞,EDC和NH2-PEG-MAL,PEG-SH。
一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,包括如下步骤:
(1)制备ZIF-8纳米颗粒,并修饰使其表面带有-COOH:将141.90 mg的二甲基咪唑溶解于2 mL水溶液中,将14.63 mg的六水合硝酸锌溶于0.2 mL水溶液中,将二甲基咪唑水溶液快速倒入硝酸锌水溶液中,在室温,转速400 rpm下搅拌5min,离心并用超纯水洗,之后加入到含有2 mg/mL的3,4-二羟基苯乙酸的Tris-HCl(50 mM,pH 8.0)水溶液中,并室温下搅拌1 h,之后PBS洗涤3次,得到ZIF-8-COOH纳米颗粒。
(2)将步骤(1)得到的ZIF-8-COOH对GM-CSF进行负载,获得GM-CSF@ZIF-8:将GM-CSF溶解于1 mL的二甲基咪唑水溶液中,使其浓度为48 μg/mL,并将此水溶液快速加入0.1mL的硝酸锌水溶液中,在室温,转速400 rpm下搅拌5min,离心并用超纯水洗,之后加入到含有2 mg/mL的3,4-二羟基苯乙酸的Tris-HCl(50 mM,pH 8.0)水溶液中,并室温下搅拌1 h,之后PBS洗涤3次,得到GM-CSF@ZIF-8-COOH纳米颗粒。
(3)采用EDC和NH2-PEG-MAL对步骤(2)中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有马来酰亚胺(GM-CSF@ZIF-8-MAL):100 μg步骤(2)中的ZIF-8纳米颗粒分散于PBS溶液中,之后加入等体积含有50 μg的EDC和100 μg的NH2-PEG-MAL的PBS溶液,并于4℃搅拌1小时,后将其用PBS洗涤并置于4℃备用。
(4)小鼠眼丛静脉取血,并用红细胞分离液分离出红细胞,无血清培养基洗涤2次,之后置于24孔板中,每孔1 mL,细胞密度为1×106个/孔,之后加入等体积12.5 μg/mL的步骤(3)中的GM-CSF@ZIF-8-MAL,之后在4℃孵育45 min,每15 min轻轻摇晃一次,之后用PBS洗涤细胞去除未反应的GM-CSF@ZIF-8-MAL。
(5)采用PEG-SH封闭MAL基团:将PEG-SH溶解于无血清培养基中使其浓度为1 mgml−1,加入步骤(4)的孔板中并在4℃与细胞孵育30 min,之后用PBS洗涤去除未反应的PEG-SH,得到载有GM-CSF的ZIF-8表面改造了的红细胞。
参见图34,图35和图36。
图35:在步骤(2)中将GM-CSF溶解于1 mL的二甲基咪唑水溶液中,得到不同浓度的GM-CSF二甲基咪唑水溶液(6-96 μg/mL),制备GM-CSF@ZIF-8-COOH,保留上清ELISA法测上清中GM-CSF的浓度,并计算不同GM-CSF的负载量和包埋率。
图36:将步骤(5)中改造了的红细胞用完全培养基分散并置于37 oC中继续培养0h,4h和24h,未改造的红细胞为阴性对照组,之后采用活性氧荧光探针(DCFH-DA)检测细胞中ROS的水平并流式细胞仪器分析,所有组活性氧探针的荧光强度与阴性对照组荧光强度的比值作图,由图中结果可以看出,对红细胞进行改造并不引起红细胞过表达ROS,说明该改造方法具有细胞水平的生物安全性。
Claims (10)
1.一种基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,包括如下步骤:
步骤1、制备纳米颗粒,使其表面含有-NH2、-SH或-COOH;
步骤2、将步骤1制得的纳米颗粒对一种或多种生物活性物质进行负载,获得负载有一种或多种生物活性物质的纳米颗粒;
步骤3、采用活性PEG(NHS-PEG-MAL、CHO-PEG-MAL或EDC和NH2-PEG-MAL)对步骤2中的纳米颗粒表面进行修饰,使纳米颗粒表面带有马来酰亚胺(-MAL)或者活性酯(-NHS)基团获得活化了的纳米颗粒;
步骤4、收集处于对数生长期的细胞并培养,加入步骤3中活化了的纳米颗粒进行孵育,除去未反应的纳米颗粒;
步骤5、采用PEG-SH或PEG-NH2封闭与细胞连接了的纳米颗粒表面的活性基团,得到载有生物活性物质的表面改造了的活细胞。
2.根据权利要求1所述的基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,其特征在于:所述步骤4中的细胞活化预处理步骤如下:将步骤1所得的纳米颗粒负载有抗原OVA,然后再与所述细胞共同孵育获得活化了的细胞使得细胞就不吞噬纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,其特征在于:步骤4中的具体步骤如下:收集处于对数生长期的活化细胞,并铺于24孔板中,每孔1 mL,细胞密度为1×104个/孔—1×108个/孔,采用无血清培养基37℃下培养;之后加入步骤3中活化了的纳米颗粒,使其终浓度为3.125-200 μg/mL,之后在4℃孵育10-120 min,每15 min轻轻摇晃一次,之后用PBS洗涤细胞去除未反应的纳米颗粒,并最终获得活化了的纳米颗粒。
4.根据权利要求1所述的基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,其特征在于:步骤5中的具体步骤如下:采用PEG-SH或PEG-NH2封闭与细胞连接了的纳米颗粒表面的活性基团:将PEG-SH或PEG-NH2溶解于无血清培养基中使其浓度为0.125-2 mg ml−1,加入步骤(4)中的孔板中并在4℃与细胞孵育10-120 min,之后用PBS洗涤去除未反应的PEG-SH或PEG-NH2,得到载有生物活性物质的表面改造了的活细胞。
5.根据权利要求1所述的基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,其特征在于:所述步骤1中使用所述的纳米颗粒为具有放射状孔径的氧化硅、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒、沸石咪唑类骨架材料ZIF-8纳米颗粒、聚乳酸PLA纳米颗粒、聚苯乙烯球、金属有机骨架(MOFs)或共价有机骨架(COFs)中的一种。
6.根据权利要求5所述的基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,其特征在于:所述纳米颗粒的粒径小于500 nm。
7.根据权利要求5所述的基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,其特征在于:所述步骤2中的生物活性物质为细胞因子(IL-12、IL-2、IL-4、IL-13),酶(胎盘葡萄糖脑苷脂酶、磷酸肌酸激酶)、蛋白质(β-乳球蛋白、索马鲁肽、胰岛素)、细胞集落刺激因子(GM-CSF、M-CSF)等中的一种或几种的组合。
8.根据权利要求1-7所述的基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,其特征在于:对于所述的不同纳米颗粒,其生物活性物质的负载方式不同。
9.根据权利要求7-8中任何一项所述的基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法,其特征在于:步骤4中所述的细胞种类可以是树突状细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、干细胞、红细胞、单核细胞等,只要是表面含有-NH2或-SH的细胞都可以,而且不需要预处理去提高细胞表面-NH2或-SH的含量。
10.一种活细胞表面改造中使用的纳米颗粒,其特征在于:其应用于权利要求1-9中所述的基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法中。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115136883A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-10-04 | 复旦大学 | 一种活体草本植物体内界面超组装zif-8材料的制备方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102401843A (zh) * | 2010-09-10 | 2012-04-04 | 中国科学院沈阳自动化研究所 | 一种基于原子力显微术的单克隆抗体靶向药疗效检测方法 |
US20170080104A1 (en) * | 2015-08-12 | 2017-03-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell surface coupling of nanoparticles |
CN110179823A (zh) * | 2019-06-18 | 2019-08-30 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | 一种基于金属多酚配位的活细胞递送系统及其制备方法 |
CN110507826A (zh) * | 2018-05-21 | 2019-11-29 | 中国科学院上海药物研究所 | 一种基于巨噬细胞的活细胞载药系统、其制备方法和应用 |
CN110859817A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-03-06 | 深圳先进技术研究院 | 一种纳米颗粒载药系统及其制备方法和应用 |
CN111888480A (zh) * | 2019-10-30 | 2020-11-06 | 中国药科大学 | 一种在活细胞表面锚定修饰纳米药物的方法 |
-
2021
- 2021-02-09 CN CN202110178007.2A patent/CN112807289B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102401843A (zh) * | 2010-09-10 | 2012-04-04 | 中国科学院沈阳自动化研究所 | 一种基于原子力显微术的单克隆抗体靶向药疗效检测方法 |
US20170080104A1 (en) * | 2015-08-12 | 2017-03-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell surface coupling of nanoparticles |
CN110507826A (zh) * | 2018-05-21 | 2019-11-29 | 中国科学院上海药物研究所 | 一种基于巨噬细胞的活细胞载药系统、其制备方法和应用 |
CN110179823A (zh) * | 2019-06-18 | 2019-08-30 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | 一种基于金属多酚配位的活细胞递送系统及其制备方法 |
CN111888480A (zh) * | 2019-10-30 | 2020-11-06 | 中国药科大学 | 一种在活细胞表面锚定修饰纳米药物的方法 |
CN110859817A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-03-06 | 深圳先进技术研究院 | 一种纳米颗粒载药系统及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MATTHIAS T STEPHAN 等: "Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles", 《NATURE MEDICINE》 * |
李丽华: "基于铜/铋基多功能靶向纳米材料的设计、合成及在肿瘤治疗中的应用", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115136883A (zh) * | 2022-06-21 | 2022-10-04 | 复旦大学 | 一种活体草本植物体内界面超组装zif-8材料的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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