CN112795640A - 三种microRNA作为RA标志物的应用及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及circPTPN22作为分子标志物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用，还涉及miR‑34c‑5p、miR‑373‑3p或/和miR‑3074‑5p作为分子标志物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用。ROC曲线表明miR‑3074‑5p、hsa‑miR‑34c‑5p、hsa‑miR‑373‑3p不仅可单独，还可以联合作为RA诊断分子标志物。为RA的诊断和治疗提供多种新的应用方向。有研究报道micro RNA对疾病的提前诊断和发病预测都有很好的特异性和敏感性，且micro RNA稳定性好，检测结果可靠。本发明的标本为受试者外周血，样品标本易于获得，临床操作性强且对受试者属于无创伤性。
Description
技术领域
本发明属于生物分子技术领域，涉及miR-34c-5p、miR-373-3p或/和miR-3074-5p作为类风湿关节炎标志物的应用及其试剂盒。
背景技术
类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的以滑膜炎、滑膜增生、骨软骨破坏为特征的慢性炎症疾病，最终可导致软骨或骨损伤，甚至是残疾。RA在女性中的发病率高于男性，遗传因素、环境因素和生活方式是风湿性关节炎的高危因素，如吸烟、饮酒、饮食不良等，但其发病机制尚不清楚。RA的早期诊断对于积极治疗关节或器官的不可逆损伤以及通过广泛使用常规药物和抗风湿性关节炎药物(DMARDs)控制慢性炎症至关重要。然而，部分类风湿因子和环瓜氨酸抗体均为阴性的RA患者可能会被误诊，延误可能导致临床预后恶化。因此，探讨RA的病因病机对RA的早期预防、早期诊断和有效干预具有重要价值。
小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)是一种18-25nt长的内源性非编码RNA，广泛分布在多个真核生物，通过调节mRNA的降解或翻译抑制来调节一个或多个基因的表达。miRNA的合成和功能的分子机制已被广泛研究。随着分子生物学的发展，miRNA可以影响免疫系统的各个方面，从造血到效应功能，但其在RA中的作用机制尚未明确。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供circPTPN22作为分子标志物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用，目的之二在于提供miR-34c-5p、miR-373-3p或/和miR-3074-5p作为microRNA分子标志物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用，以及分别检测miR-34c-5p、miR-373-3p或/和miR-3074-5p表达水平的引物的相关应用，还提供一种检测类风湿关节炎的诊断试剂盒。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.circPTPN22作为分子标志物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用。
进一步，检测circPTPN22表达水平的引物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用。
进一步，检测circPTPN22表达水平的引物的序列为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。
2.检测miR-34c-5p表达水平的引物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用。
3.检测miR-373-3p表达水平的引物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用。
4.检测miR-34c-5p、miR-373-3p和miR-3074-5p表达水平的引物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用。
进一步，检测miR-373-3p表达水平的引物的序列为SEQ ID No.2；检测miR-34c-5p表达水平的引物的序列为SEQ ID No.3；检测miR-3074-5p表达水平的引物的序列为SEQ IDNo.4。
5.一种检测类风湿关节炎的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括检测miR-34c-5p、miR-373-3p或/和miR-3074-5p表达水平的引物。
进一步，检测miR-373-3p表达水平的引物的序列为SEQ ID No.2；检测miR-34c-5p表达水平的引物的序列为SEQ ID No.3；检测miR-3074-5p表达水平的引物的序列为SEQ IDNo.4。
进一步，试剂盒还包括反转录试剂部分和荧光定量检测试剂部分。
进一步，反转录试剂部分由2×miRNA RT Reaction Buffer、miRNA RT EnzymeMix、RNase-Free ddH2O组成。
进一步，荧光定量检测试剂部分由2×miRcute Plus miRNA PreMix、10μMReverse Primer、ddH2O组成。
进一步，2×miRcute Plus miRNA PreMix中包含SYBR和ROX染料。
进一步，反转录体系总体积20μl，总RNA为2～5μl，2×miRNA RT Reaction Buffer10μl、miRNA RT Enzyme Mix 2μl，最后RNase-Free ddH2O补至20μl。
进一步，荧光定量检测体系总体积20μl或50μl，20μl体系组成为2×miRcute PlusmiRNA PreMix 10μl、10μM Reverse Primer 0.4μl、Forward Primer 0.4～0.8μl、cDNA1-2μl、余量为ddH2O。
进一步，2×miRcute Plus miRNA PreMix中包含SYBR和ROX染料。
本发明的有益效果在于：本发明通过RA外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cells,PBMC)中circRNA和mRNA的表达谱分析，发现RA和HC之间存在41个上调和30个下调环状RNA，进一步测试各circRNA在RA中的相对表达水平；发现受试者PBMC中的circPTPN22可以作为分子标志物在类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中进行临床应用。
继续通过实验研究得到miR-3074-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-373-3p与circPTPN22基因的有潜在关系，ROC曲线表明miR-3074-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-373-3p可单独，也可以联合作为RA诊断分子标志物。为RA的诊断和治疗提供多种新的应用方向。有研究报道micro RNA对疾病的提前诊断和发病预测都有很好的特异性和敏感性，且microRNA稳定性好，检测结果可靠。本发明的标本为受试者外周血，样品标本易于获得，临床操作性强且对受试者属于无创伤性。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为HC和RA患者PBMC中circRNA和mRNA的表达谱Circos图；显示了cricRNA在人类染色体上的位置，其中最外层是人类基因组的染色体图，内部的两个圆圈分别代表通过RNA-seq检测到的RA和HC样品的所有circRNA，条形图显示了circRNA的表达水平。
图2为基于基因组来源的明显失调的circRNA的分类。
图3为测序阶段3个HC和4RA内的基因显示归一化强度的近似等效分布。
图4为MA图显示在RA和HC的均值范围内基因表达显著差异，x轴是一个(平均)尺度，y轴是M(log2倍变化)。
图5为RA与健康对照之间差异表达基因的火山图。
图6为circPTPN22在RA和HC的PBMC中表达量比较图。
图7为ROC曲线图。
图8为miR-34c-5p的qRT-PCR熔解曲线。
图9为miR-373-3p的qRT-PCR熔解曲线。
图10为miR-3074-5p的qRT-PCR熔解曲线。
图11为U6的qRT-PCR熔解曲线。
图12为qRT-PCR测定hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-373-3p等miRNA在RA和HC组PBMC中的表达结果及比较。
图13为RA和HC组的PBMC中miR-3074-5p的ROC分析。
图14为RA和HC组的PBMC中hsa-miR-373-3p的ROC分析。
图15为RA和HC组的PBMC中hsa-miR-34c-5p的ROC分析。
图16为hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-34c-5p三个miRNA联合的ROC分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
主要仪器：
Nanodrop-2000核酸定量仪来源为美国Thermo Fisher公司，高速冷冻离心机来源为德国Eppendorf公司，qRT-PCR仪来源为美国Bio-Rad公司。
实施例1
研究对象：2019年3月至2020年10月在陆军军医大学西南医院招募46例RA患者。RA疾病活动度由疾病活动度评分28(DAS28)来定义。此外，本研究纳入47名健康人(Healthycontrol,HC)作为对照(表1)。研究由西南医院伦理委员会批准并监督，所有参与者均给出了书面知情同意书。人T淋巴细胞白血病细胞，Jurkat(Clone E6-1)和人胚肾细胞293T细胞(HEK-293T)购自中国科学院上海细胞库。
表1研究人群的临床特征
其中RF:rheumatoid factor(类风湿因子)；anti-CCP:anti-cyclocitrullineantibody(抗环瓜氨酸抗体)；TJC:number of tenderness joints(压痛关节数)；SJC:Number of joint swelling(关节肿胀数)；ESR:Erythrocyte sedimentation rate(红细胞沉降率)；CRP:C-reactive protein(C反应蛋白)；DAS28:Condition score of patientswith rheumatoid arthritis(类风湿关节炎患者的病情评分)。所有数据均表示为平均值±SD。N/A(Not applicable)：不适用。
实施例2
首先了解环状RNA和mRNA在RA中的表达情况，我们对其中4例RA患者和3例健康对照的PBMC(外周血单个核细胞)进行了RNA测序分析，图1-图5为RA患者PBMC中circRNA和mRNA的表达谱各种分析图。图1的Circos图显示了circRNA在人类染色体上的位置。最外层是人类基因组的染色体图谱。内2圈分别代表RNA-seq检测到的RA和HC样本的所有环状RNA。条形图展示了circRNA的表达水平。HC:健康对照，RA:类风湿性关节炎。RNA-Seq共检测到25646个环状RNA，它们广泛分布在包括性染色体X和Y在内的所有染色体上(图1)。图2为根据基因组起源对显著失调的环状RNA进行分类，在RA患者和HC患者之间有71个差异表达的环状RNA，其中66个环状RNA来自外显子。图3是测序阶段3个HC和4RA内的基因显示归一化强度的近似等效分布小提琴图，显示所有测试对象的归一化强度分布近似相等。图4的MA图显示在RA和HC的均值范围内基因表达显著差异，x轴是一个(平均)尺度，y轴是M(log2倍变化)。红点表示显著上调的环状RNA，绿点表示显著下调的环状RNA。与健康对照组相比，RA患者中分别有41个上调和30个下调环状RNA，表2展示其中上调和下调前21个circRNA信息。MA图充分展示了基因丰度与显著差异表达的环状RNA之间的关系，以fold change>2.0为截断标准，RA的PBMC中P<0.05。图5火山图显示了RA与健康对照之间差异表达基因，两条垂直的灰色虚线对应于两倍的上调和下调(log2缩放)，而水平的灰色虚线表示p值为0.05(log10缩放)。右边垂直的灰色虚线的右边红点表示显着上调的mRNA，左边垂直的灰色虚线的左边蓝点表示显着下调的mRNA。使用相同的截断标准，924个mRNA有差异表达，包括597个上调mRNA和327个下调mRNA。
表2上调和下调前21个circRNA信息
实施例3
进一步验证从RA患者与HC中RNA-seq鉴定出异常表达的各circRNA在RA中的表达水平是否与测序数据一致，我们采用42例RA患者、44例健康对照组作为独立样本，进行了定量RT-PCR(试剂盒来源takara)。
circPTPN22 PCR引物序列：
F:5′-AATTCTCACCAAATGTTCCCA-3′,SEQ ID No.9；
R:5′-AAGGTACATCATGGTCTGGC-3′；SEQ ID No.10。
GAPDH PCR引物序列：
F:5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3′,SEQ ID No.11；
R:5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3′，SEQ ID No.12。
对比分析所有的结果表明，与健康对照组相比，circPTPN22在RA患者的pbmc中平均表达水平显著下调，图6为circPTPN22在RA和HC的PBMC中表达量比较图。此外，使用ROC曲线分析来验证circPTPN22在RA中的潜在诊断生物标志物。图7为ROC曲线图，曲线下面积(area under the curve,AUC)值表明，circPTPN22在PBMC中可以分别区分RA患者与HC。
进一步通过实验研究证明各microRNAs差异表达与circPTPN22基因的潜在关系，以发现和证明microRNAs可作为RA诊断分子标志物的潜能。以下只记载与本发明技术方案相关的内容，其余实验在此不提。
实施例4
进一步在42例RA患者和44例健康对照组中进行了定量RT-PCR检测和验证各miRNA在RA中的表达水平，并建立工作特征曲线以确认外周血单个核细胞中miRNA对HA患者与健康对照间的筛查效能。
外周血单个核细胞的制备及总RNA的提取，(TaKaRa，Code No.9108Q)：实验前从每个受试者中取约5ml全血，储存在乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中。采用室温密度梯度离心法(2000rpm，20min)从供者新鲜血液提取PBMCs。随后，根据说明书用Trizol提取总RNA，nanodrop 2000和1％琼脂糖凝胶用于测定RNA浓度和纯度，将总的RNA保存在-80℃以备进一步实验。
将总RNA反转录为cDNA，选用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(天根，KR211)，反转录体系总体积20μl，具体体系成分见下表1：
表1：反转录体系
| 试剂组分 | 体积 | 终浓度 |
| 总RNA | 2-5μl | 可达2μg |
| 2×miRNA RT Reaction Buffer | 10μl | 1× |
| miRNA RT Enzyme Mix | 2μl | - |
| RNase-Free ddH<sub>2</sub>O | 补至20μl | - |
逆转录miRNA为cDNA：42℃60min加poly A尾和逆转录反应，95℃灭活逆转录酶3min，-20℃保存。
实时定量聚合酶链反应：使用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(天根，FP411)，定量RT-PCR体系总体积20μl或50μl，具体体系成分见下表2：
表2：
本实施例中使用的microRNA和U6的正向引物由天根生物技术合成(北京，中国)，U6snRNA作为microRNA规范化的内源性对照。通用反向引物在天根逆转录试剂盒中提供。各miRNA的Forward Primer如下表3所示，各miRNA序列如下表4所示。
表3
| miRNA | 引物序列 | 序列号 |
| U6 | 5'-CGCAAGGATGACACGCAAATTC-3'(F) | SEQ ID No.1 |
| miR-373-3p | 5'-AGTGCTTCGATTTTGGGGTGT-3'(F) | SEQ ID No.2 |
| miR-34c-5p | 5'-AGGCAGTGTAGTTAGCTGATTGC-3'(F) | SEQ ID No.3 |
| miR-3074-5p | 5'-TTCCTGCTGAACTGAGCCA-3'(F) | SEQ ID No.4 |
表4
| miRNA | miRNA序列 | 序列号 |
| miR-373-3p | gaagugcuucgauuuuggggugu | SEQ ID No.5 |
| miR-34c-5p | aggcaguguaguuagcugauugc | SEQ ID No.6 |
| miR-3074-5p | guuccugcugaacugagccag | SEQ ID No.7 |
| miR-766-3p | acuccagccccacagccucagc | SEQ ID No.8 |
将上述cDNA(稀释10倍)为模板，用表3所示的各miRNA引物进行qRT-PCR反应。qRT-PCR反应条件：95℃预变性30s，95℃变性15s，60℃退火30s，共40个循环。反应结束后根据扩增曲线分析扩增结果，得到了每个样本的Ct值，按照2-ΔΔCt法计算目的基因和内参U6的相对表达量相对表达量。每个样本独立重复三次以上。
图8-图11为qRT-PCR的实验结果，其中图8为miR-34c-5p的qRT-PCR熔解曲线，图9为miR-373-3p的qRT-PCR熔解曲线，图10为miR-3074-5p的qRT-PCR熔解曲线，图11为U6的qRT-PCR熔解曲线。由各图可以看出PCR产物熔解曲线单一，均为单峰，表明目的基因扩增的特异性好且结果可靠。图12为qRT-PCR测定hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-373-3p等miRNA在RA和HC组PBMC中的表达结果及比较。结果表明，42例RA患者PBMC中hsa-miR-3074-5p的相对表达量为(1.66±0.36)，与44例HC的相对表达量(1.02±0.28)相比，差异有统计学意义(P<0.0001)，具有极显著性差异。RA患者PBMC中hsa-miR-34c-5p的相对表达量为1.02±0.25，与44例HC的相对表达量(0.87±0.21)相比，差异有统计学意义(P<0.005)，具有显著性差异。RA患者PBMC中hsa-miR-373-3p的相对表达量为(1.63±0.45)，与44例HC相比(1.32±0.38)，差异有统计学意义(P<0.001)，具有显著性差异。RA患者PBMC中miR-3074-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-373-3p的相对表达量都高于健康人组。
进一步，我们使用ROC曲线及曲线下面积(area under the curve，AUC)分析来验证hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-34c-5p作为RA诊断分子标志物的潜能。其中AUC反映了检测效能，AUC越接近1.0，检测方法真实性越高；0.5＜AUC＜0.7检测效能较低；0.7＜AUC＜0.85检测效能一般；0.85＜AUC＜1，检测效能很好；AUC＝1，检测效能完美。检测分析结果如图13-图16所示，其中图13为RA和HC组的PBMC中miR-3074-5p的ROC分析，图14为RA和HC组的PBMC中hsa-miR-373-3p的ROC分析，图15为RA和HC组的PBMC中hsa-miR-34c-5p的ROC分析。图16为hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-34c-5p三个miRNA联合的ROC分析。
由曲线下面积(area under The curve,AUC)表明，miR-34c-5p、miR-373-3p、miR-3074-5p对RA患者与健康对照间的筛查效能是很好的，其中miR-3074-5p的AUC＝0.982(95％CI,0.948-1.000)；miR-373-3p的AUC＝0.885(95％CI,0.774-0.997)；miR-34c-5p的AUC＝0.746(95％CI,0.589-0.903)；miR-3074-5p、miR-373-3p、miR-34c-5p联合的AUC＝0.789(95％CI,0.708-0.871)。说明miR-34c-5p、miR-373-3p、miR-3074-5p不仅分别可以在PBMC中可以区分RA患者与HC，可以作为RA PBMC中的诊断生物标记物。miR-34c-5p、miR-373-3p、miR-3074-5p联合也可以作为RA和HC的区分标记物，可以检测受试者PBMC中的microRNA水平，以提早对RA患者进行筛查。检测的血液标本易于获得，临床可操作性强且属于无创性操作，而且循环microRNA稳定性好，检测便利，因此，miR-34c-5p、miR-373-3p、miR-3074-5p等microRNA具有作为RA无创性检验生物标志物值得推广和临床应用。
以上实验统计学方法：采用双尾Student's t检验和Mann-Whitney's t检验分别评估组间表达的正态分布参数和偏态分布参数。相关分析采用单样本Kolmogorov-Smirnov检验，组间正态分布时采用Pearson相关检验；非正态分布时采用Spearman相关检验分析。采用SPSS22.0统计软件分析，P<0.05为差异有统计学意义。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 安徽省立医院（中国科学技术大学附属第一医院）
中国人民解放军陆军军医大学
<120> 三种microRNA作为RA标志物的应用及其试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcaaggatg acacgcaaat tc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtgcttcga ttttggggtg t 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggcagtgta gttagctgat tgc 23
<210> 4
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcctgctga actgagcca 19
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagugcuuc gauuuugggg ugu 23
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggcagugua guuagcugau ugc 23
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
guuccugcug aacugagcca g 21
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acuccagccc cacagccuca gc 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aattctcacc aaatgttccc a 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaggtacatc atggtctggc 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggagtccact ggcgtcttc 19
<210> 12
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctgatgatc ttgaggctgt tg 22
Claims (10)
1.circPTPN22作为分子标志物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用。
2.检测miR-34c-5p表达水平的引物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用。
3.检测miR-373-3p表达水平的引物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用。
4.检测miR-34c-5p、miR-373-3p和miR-3074-5p表达水平的引物在制备类风湿关节炎的诊断试剂或试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，检测miR-373-3p表达水平的引物的序列为SEQ ID No.2；检测miR-34c-5p表达水平的引物的序列为SEQ ID No.3；检测miR-3074-5p表达水平的引物的序列为SEQ ID No.4。
6.一种检测类风湿关节炎的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括检测miR-34c-5p、miR-373-3p或/和miR-3074-5p表达水平的引物。
7.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，检测miR-373-3p表达水平的引物的序列为SEQ ID No.2；检测miR-34c-5p表达水平的引物的序列为SEQ ID No.3；检测miR-3074-5p表达水平的引物的序列为SEQ ID No.4。
8.根据权利要求6或7所述的诊断试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括反转录试剂部分和荧光定量检测试剂部分。
9.根据权利要求8所述的诊断试剂盒，其特征在于，反转录试剂部分由2×miRNA RTReaction Buffer、miRNA RT Enzyme Mix、RNase-Free ddH2O组成。
10.根据权利要求8所述的诊断试剂盒，其特征在于，荧光定量检测试剂部分由2×miRcute Plus miRNA PreMix、10μM Reverse Primer、ddH2O组成。
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