CN112795463A - 一种单细胞自动分离系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种单细胞自动分离系统及方法，该系统包括细胞溶液容器、细胞培养液容器、细胞废液容器、单细胞容器、细胞分离流道和细胞检测装置，细胞分离流道包括连接进液管一的弯曲状的进液流道一、连接进液管二的进液流道二、汇合进液流道一和进液流道二的主流道，主流道通过分支流道一连接废液管，主流道通过分支流道二连接出液管，进液管一插入细胞溶液容器内，进液管二插入细胞培养液容器内，废液管插入细胞废液容器内；出液管上位于出液阀之后依次设置三通管、喷射阀和喷头；三通管连接喷射管的一端，喷射管的另一端插入细胞培养液容器中。本发明所公开的系统及方法单细胞分离准确率高，分离速度快、系统结构简单、成本低。

Description

一种单细胞自动分离系统及方法
技术领域
本发明涉及细胞分离技术领域，特别涉及一种单细胞自动分离系统及方法。
背景技术
细胞包含生命科学大量重要信息，细胞群异质性导致同一类型的细胞也可能表现出不同的特征，因此对细胞群的分析就可能在大背景中丢失关于个体的重要信息。单细胞分析具有以下优点：1)单细胞包含一个物种全部的遗传信息；2)单细胞实验避免了细胞异质性的干扰，准确性更高；3)单细胞实验有利于还原生物事件本身，诸多生物事件如胚胎发育、肿瘤形成及转移等均以单细胞为起点。单细胞分析对于药物筛选、干细胞研究、组织器官再生、癌症诊断和治疗等具有重要意义，单细胞分离是单细胞分析的重要前置条件。
在传统的单细胞分离技术中，有限稀释技术(Limiting Dilution)简单易操作，但是单细胞分离准确率低。荧光活化细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)系统分离效率高，准确率高，但是系统构造复杂，成本高。激光显微切割技术(LaserCapture Microdissection，LCM)，常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞，该方法准确率高，但是分离效率低，对操作人员要求高。人工提取技术单细胞分离速率和准确率受操作人员影响较大。
相较于传统技术，微流控技术分离单细胞有其自身的优势，包括样品和试剂使用量小、集成度高及灵敏度高等优点，但是大部分基于微流控技术的单细胞分离装置都没有把单细胞分离到单个容腔中，且所使用的微流控芯片结构复杂，加工困难。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种单细胞自动分离系统及方法，以达到单细胞分离准确率高，分离速度快、系统结构简单、单细胞分离成本低的目的。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种单细胞自动分离系统，包括细胞溶液容器、细胞培养液容器、细胞废液容器、单细胞容器、细胞分离流道和细胞检测装置，所述细胞分离流道包括连接进液管一的弯曲状的进液流道一、连接进液管二的进液流道二、汇合进液流道一和进液流道二的主流道，所述主流道通过分支流道一连接废液管，所述主流道通过分支流道二连接出液管，所述进液管一插入细胞溶液容器内，所述进液管二插入细胞培养液容器内，所述废液管插入细胞废液容器内；所述进液管一或进液流道一上设置进液阀一，所述进液管二或进液流道二上设置进液阀二，所述废液管或分支流道一上设置废液阀，所述废液管上设置废液泵，所述出液管或分支流道二上设置出液阀，所述出液管上位于出液阀之后依次设置三通管、喷射阀和喷头，所述喷头位于单细胞容器上方；所述三通管连接喷射管的一端，所述喷射管的另一端插入细胞培养液容器中，所述喷射管上设置喷射泵；所述细胞检测装置位于所述主流道的进液区。
上述方案中，所述细胞分离流道为刻在微流控芯片上的流道。
上述方案中，所述细胞分离流道为通过3D打印或者倒模技术加工的流道。
进一步的技术方案中，所述细胞检测装置为显微摄像头或检测电极，所述显微摄像头位于主流道的进液区上方，所述检测电极集成于细胞分离流道上。
进一步的技术方案中，所述进液阀一、进液阀二、废液阀和出液阀为设置于进液管一、进液管二、废液管和出液管上的电磁阀或集成于微流控芯片上位于进液流道一、进液流道二、分支流道一和分支流道二上的微流控阀门。
优选地，所述单细胞容器为九十六孔板。
优选地，所述进液流道一为蛇形流道或螺旋流道。
上述方案中，所述喷头内部流道为倒锥形。
一种单细胞自动分离方法，采用上述的单细胞自动分离系统，包括如下步骤：
(1)关闭进液阀二、出液阀和喷射泵，开启进液阀一、废液阀和废液泵，控制废液泵正转，细胞溶液容器中的细胞溶液经过进液阀一、细胞分离流道、废液阀和废液泵流入细胞废液容器中，上述管道及流道中充满细胞溶液；
(2)然后关闭进液阀一、废液阀、喷射阀和废液泵，开启进液阀二、出液阀和喷射泵，控制喷射泵反转，细胞培养液容器中的细胞培养液经过进液阀二、细胞分离流道、出液阀、三通管和喷射泵流入细胞培养液容器中，上述管道及流道中充满细胞培养液，至此管道及流道中的空气已排出；
(3)重复步骤(1)，细胞检测装置实时监测主流道的进液区是否流经单细胞，当未检测到细胞时，不需要操作，当检测到多个细胞时，关闭进液阀一，打开进液阀二，此时进液区的多个细胞由细胞培养液驱动，流经主流道、废液阀、废液泵到细胞废液容器中；
(4)重复步骤(3)直到细胞检测装置检测到单个细胞，此时关闭进液阀一、废液阀、喷射阀和废液泵，打开进液阀二、出液阀和喷射泵，控制喷射泵反转以抽取细胞分离流道中的细胞溶液，经过设定时间，当单细胞从进液区靠近喷射泵后，关闭出液阀、打开喷射阀，控制喷射泵正转，驱动单细胞流经三通管、经过喷射阀和喷头后，喷射到单细胞容器中。
上述方案中，当单细胞到达靠近喷射泵后，可在喷射同时进行下一次的单细胞分离。
通过上述技术方案，本发明提供的一种单细胞自动分离系统及方法具有如下有益效果：
1、本发明通过控制喷射泵的正反转进行抽取液体或喷射单细胞，单细胞分离准确率高，单细胞分离速度快；
2、本发明的系统结构简单易加工，单细胞分离成本低；
3、本发明易于扩展，便于与其他结构结合使用；
4、本发明的系统对细胞浓度无严格要求，细胞无需染色标记，操作简单。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例所公开的一种单细胞自动分离系统示意图；
图2为本发明实施例所公开的微流控芯片结构示意图；
图3为本发明实施例所公开的3D打印流道结构示意图。
图中，1、细胞溶液容器；2、细胞培养液容器；3、细胞废液容器；4、九十六孔板；5、微流控芯片；6、显微摄像头；7、进液管一；8、进液管二；9、废液管；10、出液管；11、进液流道一；12、进液流道二；13、主流道；14、分支流道一；15、分支流道二；16、进液区；17、进液阀一；18、进液阀二；19、废液阀；20、废液泵；21、出液阀；22、三通管；23、喷射阀；24、喷头；25、喷射管；26、喷射泵。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明提供了一种单细胞自动分离系统，如图1所示，包括细胞溶液容器1、细胞培养液容器2、细胞废液容器3、单细胞容器、细胞分离流道和细胞检测装置。本实施例的单细胞容器为九十六孔板4，细胞分离流道为刻在微流控芯片5上的流道，细胞检测装置为显微摄像头6。
如图2所示，细胞分离流道包括连接进液管一7的蛇形的进液流道一11、连接进液管二8的进液流道二12、汇合进液流道一11和进液流道二12的主流道13，主流道13通过分支流道一14连接废液管9，主流道13通过分支流道二15连接出液管10。显微摄像头6位于主流道13的进液区16上方。进液管一7、进液管二8、废液管9和出液管10均为硅胶软管。
进液管一7插入细胞溶液容器1内，进液管二8插入细胞培养液容器2内，废液管9插入细胞废液容器3内；进液管一7上设置进液阀一17，进液管二8上设置进液阀二18，废液管9上设置废液阀19和废液泵20，出液管10上依次设置出液阀21、三通管22、喷射阀23和喷头24，喷头24位于单细胞容器上方。三通管22连接喷射管25的一端，喷射管25的另一端插入细胞培养液容器2中，喷射管25上设置喷射泵26。
如图3所示，细胞分离流道也可以为通过3D打印或者倒模技术加工的流道。
细胞检测装置也可以为检测电极，检测电极集成于细胞分离流道上，使用电阻法、电容法等方法检测细胞或者粒子。
进液阀一17、进液阀二18、废液阀19和出液阀21可以为设置于进液管一7、进液管二8、废液管9和出液管10上的电磁阀，也可以为集成于微流控芯片5上位于进液流道一11、进液流道二12、分支流道一14和分支流道二15上的具有通断功能的微流控阀门。
废液泵20和喷射泵26为蠕动泵或具有类似功能的泵都可。
进液流道一11也可以为螺旋流道，或者根据流体力学特性可以进行流体聚焦的其它形状的流道。
本实施例中，喷头24内部流道为倒锥形，内部流道由宽变窄以加速单细胞液滴喷射，从而使得液滴更容易滴落。
一种单细胞自动分离方法，采用上述的单细胞自动分离系统，包括如下步骤：
首先将配置好的细胞溶液转移到细胞溶液容器1中，将配置好的细胞培养液转移到细胞培养液容器2中。由于空气受压缩形变较大，如果依靠空气传动则有较大迟滞性，因此需要将管道及流道中的空气排出。
(1)关闭进液阀二18、出液阀21和喷射泵26，开启进液阀一17、废液阀19和废液泵20，控制废液泵20正转，细胞溶液容器1中的细胞溶液经过进液阀一17、细胞分离流道、废液阀19和废液泵20流入细胞废液容器3中，上述管道及流道中充满细胞溶液；
(2)然后关闭进液阀一17、废液阀19、喷射阀23和废液泵20，开启进液阀二18、出液阀21和喷射泵26，控制喷射泵26反转，细胞培养液容器2中的细胞培养液经过进液阀二18、细胞分离流道、出液阀21、三通管22和喷射泵26流入细胞培养液容器2中，上述管道及流道中充满细胞培养液，至此管道及流道中的空气已排出；
(3)关闭进液阀二18、出液阀21和喷射泵26，开启进液阀一17、废液阀19和废液泵20，控制废液泵20正转，细胞溶液容器1中的细胞溶液经过进液阀一17、细胞分离流道、废液阀19和废液泵20流入细胞废液容器3中；细胞检测装置实时监测主流道13的进液区16是否流经单细胞，当未检测到细胞时，不需要操作，当检测到多个细胞时，关闭进液阀一17，打开进液阀二18，此时进液区16的多个细胞由细胞培养液驱动，流经主流道13、废液阀19、废液泵20到细胞废液容器3中；
(4)重复步骤(3)直到细胞检测装置检测到单个细胞，此时关闭进液阀一17、废液阀19、喷射阀23和废液泵20，打开进液阀二18、出液阀21和喷射泵26，控制喷射泵26反转以抽取细胞分离流道中的细胞溶液，经过设定时间，当单细胞从进液区16靠近喷射泵26后，关闭出液阀21、打开喷射阀23，控制喷射泵26正转，驱动单细胞流经三通管22、经过喷射阀23和喷头24后，喷射到单细胞容器中。
由于喷射泵26的流量L及进液区16到三通管22之间所需溶液体积V是确定的，因此可以计算单细胞从进液区16到三通管22的时间t＝V/L。因此，设定时间稍大于该时间即可。
当单细胞到达靠近喷射泵26后，可在喷射同时进行下一次的单细胞分离，不必等待喷射完成。判断喷射次数是否达到单细胞容器最大容量，若满足要求则终止喷射，否则重复进行下一次喷射。需要注意的是，当再次检测到单个细胞时，判断时间间隔是否大于喷射时间Tp，若时间间隔大于喷射时间Tp，则进行下一次喷射，若时间间隔小于喷射时间Tp，则等待直到时间间隔大于喷射时间Tp再进行下一次喷射，即保证上一次细胞喷射完成后再进行下一次细胞喷射。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种单细胞自动分离系统，其特征在于，包括细胞溶液容器、细胞培养液容器、细胞废液容器、单细胞容器、细胞分离流道和细胞检测装置，所述细胞分离流道包括连接进液管一的弯曲状的进液流道一、连接进液管二的进液流道二、汇合进液流道一和进液流道二的主流道，所述主流道通过分支流道一连接废液管，所述主流道通过分支流道二连接出液管，所述进液管一插入细胞溶液容器内，所述进液管二插入细胞培养液容器内，所述废液管插入细胞废液容器内；所述进液管一或进液流道一上设置进液阀一，所述进液管二或进液流道二上设置进液阀二，所述废液管或分支流道一上设置废液阀，所述废液管上设置废液泵，所述出液管或分支流道二上设置出液阀，所述出液管上位于出液阀之后依次设置三通管、喷射阀和喷头，所述喷头位于单细胞容器上方；所述三通管连接喷射管的一端，所述喷射管的另一端插入细胞培养液容器中，所述喷射管上设置喷射泵；所述细胞检测装置位于所述主流道的进液区。
2.根据权利要求1所述的一种单细胞自动分离系统，其特征在于，所述细胞分离流道为刻在微流控芯片上的流道。
3.根据权利要求1所述的一种单细胞自动分离系统，其特征在于，所述细胞分离流道为通过3D打印或者倒模技术加工的流道。
4.根据权利要求1或2所述的一种单细胞自动分离系统，其特征在于，所述细胞检测装置为显微摄像头或检测电极，所述显微摄像头位于主流道的进液区上方，所述检测电极集成于细胞分离流道上。
5.根据权利要求2所述的一种单细胞自动分离系统，其特征在于，所述进液阀一、进液阀二、废液阀和出液阀为设置于进液管一、进液管二、废液管和出液管上的电磁阀或集成于微流控芯片上位于进液流道一、进液流道二、分支流道一和分支流道二上的微流控阀门。
6.根据权利要求1所述的一种单细胞自动分离系统，其特征在于，所述单细胞容器为九十六孔板。
7.根据权利要求1所述的一种单细胞自动分离系统，其特征在于，所述进液流道一为蛇形流道或螺旋流道。
8.根据权利要求1所述的一种单细胞自动分离系统，其特征在于，所述喷头内部流道为倒锥形。
9.一种单细胞自动分离方法，采用如权利要求1所述的单细胞自动分离系统，其特征在于，包括如下步骤：
(1)关闭进液阀二、出液阀和喷射泵，开启进液阀一、废液阀和废液泵，控制废液泵正转，细胞溶液容器中的细胞溶液经过进液阀一、细胞分离流道、废液阀和废液泵流入细胞废液容器中，上述管道及流道中充满细胞溶液；
(2)然后关闭进液阀一、废液阀、喷射阀和废液泵，开启进液阀二、出液阀和喷射泵，控制喷射泵反转，细胞培养液容器中的细胞培养液经过进液阀二、细胞分离流道、出液阀、三通管和喷射泵流入细胞培养液容器中，上述管道及流道中充满细胞培养液，至此管道及流道中的空气已排出；
(3)重复步骤(1)，细胞检测装置实时监测主流道的进液区是否流经单细胞，当未检测到细胞时，不需要操作，当检测到多个细胞时，关闭进液阀一，打开进液阀二，此时进液区的多个细胞由细胞培养液驱动，流经主流道、废液阀、废液泵到细胞废液容器中；
(4)重复步骤(3)直到细胞检测装置检测到单个细胞，此时关闭进液阀一、废液阀、喷射阀和废液泵，打开进液阀二、出液阀和喷射泵，控制喷射泵反转以抽取细胞分离流道中的细胞溶液，经过设定时间，当单细胞从进液区靠近喷射泵后，关闭出液阀、打开喷射阀，控制喷射泵正转，驱动单细胞流经三通管、经过喷射阀和喷头后，喷射到单细胞容器中。
10.根据权利要求9所述的一种单细胞自动分离方法，其特征在于，当单细胞到达靠近喷射泵后，可在喷射同时进行下一次的单细胞分离。
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