CN112791754B - 一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统 - Google Patents

一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测芯片，通过控制体积调节电极实现液滴体积调节，可完成多个独立聚合酶链式反应，可搭配不同试剂实现不同的检测指标，扩增方法可采用基于可变温温度模块或温度恒定温度模块两种形式。在单个芯片上包含磁珠法核酸提取和聚合酶链式反应的功能，用户仅需要向芯片加载样品即可实现全流程全自动聚合酶链式反应多联检测，并可配合荧光检测模块实现定性或定量检测(即qPCR)，还可通过电极设计或级联实现更高检测通量。

Description

一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统
技术领域
本发明属于数字微流控技术领域，涉及一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)为核酸检测最常用的实验方法，其基本流程为：检测样本与反应试剂结合后首先进行逆转录反应和预变性反应，然后变形反应和退火、延伸反应温度之间进行30-50次温度循环实现目标核酸片段复制。传统的PCR的检测手段使用在所有温度循环完成后以核酸电泳的方式检测目标核酸片段扩增结果，目前较为常用的检测手段是在PCR检测试剂中加入荧光探针，利用荧光检测装置在所有温度循环后或在每一个温度循环完成后检测反应溶液的荧光信号强度，以此检测目标核酸片段的扩增结果。目前商业化的PCR检测设备主要配合例如96孔板、384孔板进行使用，检测样本和试剂混合好后加入孔板的反应井中，利用高精度变温模块实现温度循环，配合荧光检测装置实现结果判定。聚合酶链式反应多联检测是一项重要的检测手段，尤其在例如呼吸道病毒、细菌检测方面有非常重要的应用价值，目前实现聚合酶链式反应多联检测的主要手段依然是依赖手动操作，Biofire的Filmarray产品和Genmark的ePlex产品分别利用微流控技术实现了全流程全自动聚合酶链式反应多联检测，极大的提高了检测效率。
传统的手动操作的主要缺陷在于检测效率低下，检测耗时长，需要配备专业的检测实验室和专业技术人员才能够完成，且检测过程中操作人员的误操作可能导致实验失败或样本污染等风险造成检测结果不可靠。Biofire的Filmarray产品采用压力式微流控芯片实现了全流程全自动聚合酶链式反应多联检测，但是由于该芯片制造工艺复杂导致成本高昂，难以达到市场对该检测方法的价格预期。Genmark的ePlex产品的检测手段采用的是电化学基因杂交而非被行业普遍认可的聚合酶链式反应，其检测结果可靠性方面不如聚合酶链式反应，且同样存在芯片制造成本高昂的缺陷。
因此，有必要提供一种新的集成度高、成本低、可靠性强的全自动数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统，在基于聚合酶链式反应的核酸检测技术领域具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统。在单个芯片上包含一个样本的磁珠法核酸提取功能，可容纳多个独立PCR或qPCR反应和1组阴阳对照反应，用户仅需要向芯片加载样品即可实现全流程全自动聚合酶链式反应多联检测。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测芯片，其主要包含多个样本/试剂入口1、多个储液区2、废液区3、搅拌区4、磁珠分离点5、x个混合分配区6、y排扩增区7和体积调节电极8；所述x和y为大于等于1的正整数；
优选地，所述芯片装载于检测设备之上并使所述芯片内充满生物兼容性介质油；
优选地，所述芯片通过体积调节电极8实现液滴体积调节；
优选地，所述芯片上包含一组阴性对照和/或一组阳性对照作为内参；
优选地，样本及试剂加载位置如图2所示；
优选地，所述试剂可以采用移液枪注射的方式、独立试剂包加载的方式或试剂在芯片中预埋的方式实现加载；
优选地，所述芯片可搭配不同试剂实现不同的检测指标；
优选地，所述芯片功能包含磁珠法核酸提取和聚合酶链式反应；
优选地，所述芯片扩增区的下方还配置有温度模块，用于实现温度控制从而满足聚合酶链式反应所需温度循环条件；
在一个实施方案中，所述温度模块为变温温度模块9，所述变温温度模块9可使扩增区的温控方式采用如图5所示的变温温控方式，在此温控方式下，n个独立聚合酶链式反应溶液不需要移动，通过改变变温温度模块9的温度实现聚合酶链式反应所需温度循环条件，实现扩增；
在另一个实施方案中，所述温度模块为恒定温度模块10和11，各个独立聚合酶链式反应溶液需要在两个温度区间间往复移动，从而实现聚合酶链式反应所需温度循环条件；
优选地，所述温度模块10保持例如恒定变性温度不变，用于进行变性反应；
优选地，所述温度模块11在逆转录反应阶段保持例如恒定逆转录温度不变，用于进行逆转录反应，在逆转录反应完成后升至例如恒定退火、延伸温度不变，用于进行退火、延伸反应；
优选地，所述变性温度为92-99℃，优选为95℃；
优选地，所述逆转录温度为45-75℃，优选为50℃；
优选地，所述退火、延伸温度为55-75℃，优选为60℃。
第二方面，本发明提供了一种数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统，所述系统包括第一方面所述的数字微流控聚合酶链式反应多联检测芯片。
优选地，所述数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统包括荧光检测模块，可实现定性或定量检测(即qPCR)；
优选地，所述数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统包括电极设计或级联，以实现更高检测通量。
第三方面，本发明提供了一种利用第一方面所述的芯片或第二方面所述的系统进行聚合酶链式反应多联检测的方法，所述方法包括：
(1)手动配置样本、裂解液、磁珠的混合溶液并震荡使之混合均匀，该步骤采取手动的原因是为了保证样本中细胞的充分裂解和与磁珠的充分混合；
(2)将芯片装载于检测设备之上并使芯片内充满生物兼容性介质油，按照图2在对应入口按规定体积加载第一步的混合液以及各种试剂；
(3)含有Master Mix 2X的混合分配区6充分混合并分配出n滴等体积的MasterMix 2X液滴并转移至n个靠近引物入口的位置；
(4)含有去离子水的混合分配区6充分混合，并在关闭体积调节电极8的条件下分配出2滴等体积的去离子水液滴，并转移至靠近引物阴性对照、阳性对照入口的位置；
(5)样本、裂解液、磁珠的混合溶液在搅拌区4充分搅拌并在磁珠分离点5进行磁珠分离，洗涤液、漂洗液依次与磁珠在搅拌区4充分搅拌并在磁珠分离点5进行磁珠分离，洗脱液与磁珠在搅拌区4充分搅拌并在磁珠分离点5进行磁珠分离，将洗脱液转移至含有去离子水的混合分配区6；
(6)含有去离子水和洗脱液的混合分配区6充分混合，并在开启体积调节电极8的条件下分配出m滴等体积的液滴，并转移至除引物阴性对照、阳性对照的靠近引物入口的位置，需要指出步骤(4)中去离子水的液滴与阴性或阳性对照的体积之和等于该步骤所分配的液滴体积；
(7)将扩增区的n个独立聚合酶链式反应溶液充分混合；
(8)在扩增区对n个独立聚合酶链式反应进行扩增，配合荧光检测装置实现荧光信号检测和结果判定。
其中，所述n和m为大于等于1的正整数；
在一个实施方案中，扩增区的温控方式可采用如图5所示的基于变温温度模块9的温控方式，在此温控方式下，n个独立聚合酶链式反应溶液不需要移动，通过改变变温温度模块9的温度实现聚合酶链式反应所需温度循环条件实现扩增；
在另一个实施方案中，扩增区的温控方式可采用如图6所示的基于两个温度恒定温度模块10和11的温控方式，n个独立聚合酶链式反应溶液需要在两个温度区间间往复移动，从而实现聚合酶链式反应所需温度循环条件；
优选地，所述温度模块10保持例如恒定变性温度不变，用于进行变性反应；
优选地，所述温度模块11在逆转录反应阶段保持例如恒定逆转录温度不变，用于进行逆转录反应，在逆转录反应完成后升至例如恒定退火、延伸温度不变，用于进行退火、延伸反应；
优选地，所述变性温度为92-99℃，优选为95℃；
优选地，所述逆转录温度为45-75℃，优选为50℃；
优选地，所述退火、延伸温度为55-75℃，优选为60℃。
优选地，所述数字微流控聚合酶链式反应多联检测的方法还包括采用荧光检测模块实现定性或定量检测(即qPCR)的步骤；
优选地，所述数字微流控聚合酶链式反应多联检测的方法还包括使用电极设计或级联以实现更高检测通量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的全流程全自动数字微流控芯片代替人工操作，极大提升检测效率和准确度，检测方法耗时短、成本低、可靠性高，；
(2)本发明的芯片式全封闭检测环境无污染风险，灵活度高，可适用于多种指标检测；
(3)本发明的数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统扩展性高，可通过电极设计或级联实现更高检测通量，集成度高，可以实现定制化实验流程。
附图说明
图1为数字微流控聚合酶链式反应多联检测芯片示意图，其主要包含多个样本/试剂入口1、多个储液区2、废液区3、搅拌区4、磁珠分离点5、x个混合分配区6、y排扩增区7、体积调节电极8；所述x和y为大于等于1的正整数。
图2为样本及试剂加载位置示意图。
图3为数字微流控聚合酶链式反应多联检测操作流程示意图。
图4为体积调节电极8的开关状态示意图。
图5为基于变温温度模块9的数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统示意图。
图6为基于两个温度恒定温度模块10和11的数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统示意图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1：1个样本的13个检测指标的聚合酶链式反应多联检测
图1为数字微流控聚合酶链式反应多联检测芯片示意图，其主要包含多个样本/试剂入口1、多个储液区2、废液区3、搅拌区4、磁珠分离点5、x个混合分配区6、y排扩增区7、体积调节电极8；所述x和y为大于等于1的正整数。1个样本的13个检测指标的聚合酶链式反应多联检测的步骤为：
(1)手动配置样本、裂解液、磁珠的混合溶液并震荡使之混合均匀，该步骤采取手动的原因是为了保证样本中细胞的充分裂解和与磁珠的充分混合；
(2)将芯片装载于检测设备之上并使芯片内充满生物兼容性介质油，按照图2在对应入口按规定体积加载第一步的混合液以及各种试剂；
(3)含有Master Mix 2X的混合分配区6充分混合并分配出n滴等体积的MasterMix 2X液滴并转移至n个靠近引物入口的位置；
(4)含有去离子水的混合分配区6充分混合并在关闭体积调节电极8的条件下分配出2滴等体积的去离子水液滴并转移至靠近引物阴性对照、阳性对照入口的位置；
(5)样本、裂解液、磁珠的混合溶液在搅拌区4充分搅拌并在磁珠分离点5进行磁珠分离，洗涤液、漂洗液依次与磁珠在搅拌区4充分搅拌并在磁珠分离点5进行磁珠分离，洗脱液与磁珠在搅拌区4充分搅拌并在磁珠分离点5进行磁珠分离，将洗脱液转移至含有去离子水的混合分配区6；
(6)含有去离子水和洗脱液的混合分配区6充分混合，并在开启体积调节电极8的条件下分配出m滴等体积的液滴，并转移至除引物阴性对照、阳性对照的靠近引物入口的位置，需要指出步骤(4)中去离子水的液滴与阴性或阳性对照的体积之和等于该步骤所分配的液滴体积；
(7)将扩增区的n个独立聚合酶链式反应溶液充分混合；
(8)在扩增区对n个独立聚合酶链式反应进行扩增，配合荧光检测装置实现荧光信号检测和结果判定。
实施例2：基于变温温度模块9的数字微流控聚合酶链式反应多联检测
芯片扩增区的下方配置有温度模块用于实现温度控制从而满足聚合酶链式反应所需温度循环条件。
扩增区的温控方式可采用如图5所示的基于变温温度模块9的温控方式，在此温控方式下，n个独立聚合酶链式反应溶液不需要移动，通过改变变温温度模块9的温度实现聚合酶链式反应所需温度循环条件，实现扩增。
实施例3：基于两个温度恒定温度模块10和11的数字微流控聚合酶链式反应多联检测
芯片扩增区的下方配置有温度模块用于实现温度控制从而满足聚合酶链式反应所需温度循环条件。
扩增区的温控方式可采用如图6所示的基于两个温度恒定温度模块10和11的温控方式，在此温控方式下，温度模块10保持例如95摄氏度不变用于进行变性反应，温度模块11在逆转录反应阶段保持例如50摄氏度，在逆转录反应完成后升至例如60摄氏度用于进行退火、延伸反应。n个独立聚合酶链式反应溶液需要在两个温度区间见往复移动，从而实现聚合酶链式反应所需温度循环条件，实现扩增。
实施例4：高通量检测
所述数字微流控聚合酶链式反应多联检测系统通过电极设计或级联实现更高检测通量，并可搭配不同试剂实现不同的检测指标。
综上所述，本发明全流程全自动数字微流控聚合酶链式反应多联检测芯片，通过控制体积调节电极实现液滴体积调节，可完成多个独立聚合酶链式反应，可搭配不同试剂实现不同的检测指标，扩增方法可采用基于可变温温度模块或温度恒定温度模块两种形式。所述芯片功能包含磁珠法核酸提取和聚合酶链式反应，并可配合荧光检测模块实现定性或定量检测(即qPCR)，还可通过电极设计或级联实现更高检测通量。本发明提供的数字微流控芯片代替人工操作，极大提升检测效率和准确度，检测方法耗时短、成本低、可靠性高，芯片式全封闭检测环境无污染风险。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种聚合酶链式反应多联检测的方法，其特征在于，所述方法包括利用数字微流控聚合酶链式反应多联检测芯片；
所述数字微流控聚合酶链式反应多联检测芯片，其包含多个样本/试剂入口（1）、多个储液区（2）、废液区（3）、搅拌区（4）、磁珠分离点（5）、x个混合分配区（6）、y排扩增区（7）和体积调节电极（8）；
其中，所述芯片通过体积调节电极（8）的开关实现液滴体积调节；
所述芯片扩增区的下方还配置有温度模块，用于实现温度控制从而满足聚合酶链式反应所需温度循环条件；
所述芯片功能包含磁珠法核酸提取和聚合酶链式反应；
所述x和y为大于等于1的正整数；
所述方法包括如下步骤：
（1）手动配置样本、裂解液、磁珠的混合溶液并震荡使之混合均匀，该步骤采取手动的原因是为了保证样本中细胞的充分裂解和与磁珠的充分混合；
（2）将芯片装载于检测设备之上并使芯片内充满生物兼容性介质油，在对应入口按规定体积加载第一步的混合液以及各种试剂；
（3）含有Master Mix 2X的混合分配区（6）充分混合并分配出n滴等体积的Master Mix2X液滴并转移至n个靠近引物入口的位置；
（4）含有去离子水的混合分配区（6）充分混合并在关闭体积调节电极（8）的条件下分配出2滴等体积的去离子水液滴并转移至靠近引物阴性对照、阳性对照入口的位置；
（5）样本、裂解液、磁珠的混合溶液在搅拌区（4）充分搅拌并在磁珠分离点（5）进行磁珠分离，洗涤液、漂洗液依次与磁珠在搅拌区（4）充分搅拌并在磁珠分离点（5）进行磁珠分离，洗脱液与磁珠在搅拌区（4）充分搅拌并在磁珠分离点（5）进行磁珠分离，将洗脱液转移至含有去离子水的混合分配区（6）；
（6）含有去离子水和洗脱液的混合分配区（6）充分混合，并在开启体积调节电极（8）的条件下分配出m滴等体积的液滴，并转移至除引物阴性对照、阳性对照的靠近引物入口的位置，需要指出步骤（4）中去离子水的液滴与阴性或阳性对照的体积之和等于该步骤所分配的液滴体积；
（7）将扩增区的n个独立聚合酶链式反应溶液充分混合；
（8）在扩增区对n个独立聚合酶链式反应进行扩增，配合荧光检测装置实现荧光信号检测和结果判定；
所述n和m为大于等于1的正整数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芯片装载于检测设备之上并使所述芯片内充满生物兼容性介质油；
所述芯片上包含一组阴性对照和/或一组阳性对照作为内参；
样本和/或试剂可以采用移液枪注射的方式、独立试剂包加载的方式或试剂在芯片中预埋的方式实现加载；
所述芯片可搭配不同试剂实现不同的检测指标。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
扩增区的温控方式采用基于变温温度模块（9）的温控方式，n个独立聚合酶链式反应溶液不需要移动，通过改变变温温度模块（9）的温度实现聚合酶链式反应所需温度循环条件。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
扩增区的温控方式可采用基于第一恒定温度模块（10）和第二恒定温度模块（11）的温控方式，n个独立聚合酶链式反应溶液需要在两个温度区间间往复移动，从而实现聚合酶链式反应所需温度循环条件。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
所述第一恒定温度模块（10）保持恒定变性温度不变，用于进行变性反应；
所述第二恒定温度模块（11）在逆转录反应阶段保持恒定逆转录温度不变，用于进行逆转录反应，在逆转录反应完成后升至恒定退火、延伸温度不变，用于进行退火、延伸反应；
所述变性温度为92-99°C；
所述逆转录温度为45-75°C；
所述退火、延伸温度为55-75°C。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述变性温度为95°C；
所述逆转录温度为50°C；
所述退火、延伸温度为60°C。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应多联检测方法还包括采用荧光检测模块实现定性或定量检测的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述数字微流控聚合酶链式反应多联检测的方法还包括使用电极设计或级联以实现更高检测通量。
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