CN112791074A - 鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠在制备ndm-1抑制剂中的用途 - Google Patents

鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠在制备ndm-1抑制剂中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鱼腥草素、新鱼腥草素钠、以及两者的混合物作为新德里金属β‑内酰胺酶‑I(NDM‑1)抑制剂的新应用。本发明还公开了鱼腥草素、新鱼腥草素钠、以及两者的混合物在制备抑制NDM‑1的药物和制备抗耐药细菌药物中的应用，这将有助于由金属β‑内酰胺酶引起的超级细菌感染疾病的治疗。此外，鱼腥草素和新鱼腥草素钠的分子骨架特征，还可以为后续NDM‑1抑制剂的设计提供借鉴。

Description

鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠在制备NDM-1抑制剂中的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠在制备NDM-1抑制剂中的用途。
背景技术
新德里金属β-内酰胺酶-I(NDM-1)是一种主要存在于大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌中的遗传物质。NDM-1的危害性极大，其可以造成细菌对包括碳青霉烯类抗生素在内的几乎所有的β-内酰胺抗生素耐药，目前仅替加霉素和多粘菌素对其有一定的抑制效果。此外，NDM-1的传播性强，它几乎可以跨越不同的细菌种类，广泛存在于各种细菌的DNA线粒体中，使得各种病菌拥有传播和变异的惊人潜能。
从NDM-1被发现至今，针对NDM-1抑制剂的研究日益受到重视。目前见诸报道的NDM-1抑制剂总数达500余个，主要可分为两种类型。一种是来源于天然产物的抑制剂，目前报道的这一类型的抑制剂种类较少，但是其分子骨架特征可以为后续抑制剂的设计提供借鉴；另外一种是合成的小分子化合物，主要为以EDTA为代表的金属螯合剂，含巯基的卡托普利类似物，硼酸类化合物，以及吡啶二羧酸类化合物。然而，由于目前没有高效的金属β-内酰胺酶抑制剂，复方治疗药物亦没有上市，所以由金属β-内酰胺酶引起的超级细菌感染疾病的治疗困难。因此，研发高效的金属β-内酰胺酶抑制剂，成为研发该类型治疗药物的关键之一。
鱼腥草素和新鱼腥草素钠，最早来源于鱼腥草的天然提取物，被发现具有一定的抗菌和抗病毒作用。中国专利CN 107261146A公开了一种鱼腥草素钠制备杀灭耐药烟曲霉的组合物及其应用，所述鱼腥草素钠可提高药物对耐药烟曲霉菌株的抗菌效果，降低抗真菌药物的使用剂量。但鱼腥草素、新鱼腥草素钠、以及两者的混合物作为NDM-1抑制剂的新应用还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠在制备NDM-1抑制剂中的应用。
本发明的第一个目的是提供鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠作为或在制备NDM-1抑制剂中的应用。
本发明的第二个目的是提供鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠在制备抑制NDM-1的药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠在制备抗NDM-1细菌或NDM-1超级细菌的药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供抑制NDM-1的药物组合物在制备抗NDM-1细菌或NDM-1超级细菌的药物制剂中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究表明鱼腥草素、新鱼腥草素钠、以及两者的混合物对NDM-1均具有抑制活性。其中，鱼腥草素对NDM-1的抑制IC50值为1.3±0.31μM，新鱼腥草素钠对NDM-1的抑制IC50值为2.3±0.23μM，鱼腥草素和新鱼腥草素钠1∶1混合时对NDM-1的抑制IC50值为3.0±0.5μM，均明显优于阳性对照卡托普利的抑制活性IC50值97.8±6.3μM。
所述鱼腥草素的化学结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002981205730000021
所述新鱼腥草素钠的化学结构式如式(II)所示：
Figure BDA0002981205730000022
因此，本发明申请保护鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠在以下几个方面的应用：
鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠作为或在制备NDM-1抑制剂中的应用。
鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠在制备抑制NDM-1的药物中的应用。
鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠在制备抗NDM-1细菌或NDM-1超级细菌的药物中的应用。
优选地，在上述应用中，所述鱼腥草素和新鱼腥草素钠的摩尔比为1～10∶1～10。
更优选地，所述鱼腥草素和新鱼腥草素钠的摩尔比为1∶1。
本发明还提供一种抑制NDM-1的药物组合物，其特征在于，包含鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠及其药学上可接受的药物载体。
优选地，所述药物组合物还包含β-内酰胺类抗生素及其药学上可接受的药物载体。
本发明还提供所述药物组合物在制备抗NDM-1细菌或NDM-1超级细菌的药物制剂中的应用。
优选地，所述NDM-1细菌或NDM-1超级细菌选自大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌，阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌中的一种或多种。
优选地，所述药物制剂为口服片剂、胶囊剂、注射剂、注射用无菌粉末、膏剂或霜剂。
本发明具有以下有益效果：
本发明研究表明鱼腥草素、新鱼腥草素钠、以及二者的混合物具有抑制NDM-1的活性，并在此基础上提供了鱼腥草素、新鱼腥草素钠、以及二者的混合物在制备NDM-1抑制剂中的应用，及其在制备抑制NDM-1的药物和制备抗耐药细菌药物中的应用，有助于由金属β-内酰胺酶引起的超级细菌感染疾病的治疗。此外，鱼腥草素和新鱼腥草素钠的分子骨架特征，还可以为后续NDM-1抑制剂的设计提供借鉴。
附图说明
图1为获得的NDM-1重组蛋白的SDS-gel扫描图。
图2为鱼腥草素对NDM-1的抑制活性结果。
图3为新鱼腥草素钠对NDM-1的抑制活性结果。
图4为鱼腥草素和新鱼腥草素钠按摩尔比1∶10混合后对NDM-1的抑制活性结果。
图5为鱼腥草素和新鱼腥草素钠按摩尔比1∶1混合后对NDM-1的抑制活性结果。
图6为鱼腥草素和新鱼腥草素钠按摩尔比10∶1混合后对NDM-1的抑制活性结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1鱼腥草素、新鱼腥草素钠及NDM-1重组蛋白的制备
本发明所用鱼腥草素及新鱼腥草素参照中国专利CN 101659629A的方法制备而成。鱼腥草素的化学结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002981205730000041
新鱼腥草素钠的化学结构式如式(II)所示：
Figure BDA0002981205730000042
本发明所用NDM-1为NDM-1重组蛋白，经表达纯化所得，其表达纯化过程如下：
1、将从-80℃冰箱中取出来的大肠杆菌种BL21(CodonPlus)感受态细胞放置在冰桶中溶解，并加入0.5μL pET15b-NDM-1(39-270)的质粒DNA，混合均匀后放置在冰桶中恒温20min。接着，快速将其置于42℃水浴中孵化90s，再放置在冰桶中保持3min。随后，加入100μL LB培养液，在37℃条件下培养45-60min。最后，将该转化细胞涂布在含有氨苄西林和氯霉素的LB培养基上，37℃条件下培养过夜。
2、挑选20株上述菌落，将其加入到每升含有10g胰蛋白胨、5g酵母膏、10g氯化钠、100mg氨苄西林和20mg氯霉素的LB培养液中，在37℃条件下生长到A600＝0.7。加入0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，15℃条件下继续生长48h。离心收集细胞，冰水洗涤之后再次离心，将收集得到的细胞放置在-80℃冰箱中冷冻过夜。
3、将裂解液(20mMTris.base pH 7.5,0.3M NaCl,15mM咪唑,1mMβ-巯基乙醇)加入到细胞中，得到悬浮液。将该悬浮液通过细胞均化器进行细胞裂解，离心收集上清液。上清液上样到Ni-NTA琼脂糖树脂柱，用缓冲溶液I(20mMTris.base pH 7.5,0.3M NaCl,15mM咪唑,1mMβ-巯基乙醇)冲洗至A280<0.05，再用100mL缓冲溶液II(20mMTris.base pH 7.5,50mMNaCl,15mM咪唑,1mMβ-巯基乙醇)冲洗，然后用缓冲溶液III(20mMTris.base pH 7.5,50mMNaCl,150mM咪唑,1mMβ-巯基乙醇)洗脱，得到目标蛋白。所得目标蛋白的SDS-PAGE结果如图1所示，条带大小与预期相符，证明所得重组蛋白确为NDM-1，同时实验测试所得目标蛋白的活度为80％，可用于后续试验。
实施例2
本发明通过以下方式测试鱼腥草素、新鱼腥草素、以及二者混合物对NDM-1的抑制活性，具体如下：
试剂：亚胺培南-水化合物(毕得医药)、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸，阿拉丁)、七水硫酸锌(安耐吉化学)、二甲亚砜(General-reagent)
测试仪器：BioTek EPOCH2，96孔石英酶标板
测试方法：先将抑制剂用DMSO溶解，再逐级稀释成不同浓度的抑制剂溶液。往96孔板中加入128uL pH＝7.5的缓冲液(50mM HEPES，20uM ZnSO4)，再加入2uL抑制剂溶液和20uL NDM-1酶稀释液，常温下孵育15min后，加入50uL 2mM的亚胺培南溶液，立即放入BioTek EPOCH2酶标仪中，在300nm下进行测试。
鱼腥草素对NDM-1的抑制活性结果如图2所示，由图可知，其IC50值为1.3±0.31μM。新鱼腥草素钠对NDM-1的抑制活性结果如图3所示，IC50值为2.3±0.23μM。鱼腥草素和新鱼腥草素钠按1∶10混合后对NDM-1的抑制活性结果如图4所示，IC50值为16.6±0.9μM。鱼腥草素和新鱼腥草素钠按1∶1混合后对NDM-1的抑制活性结果如图5所示，IC50值为3.0±0.5μM。鱼腥草素和新鱼腥草素钠按10∶1混合后对NDM-1的抑制活性结果如图6所示，IC50值为18.6±1.0μM。上述所用阳性对照均为卡托普利，阳性对照卡托普利的抑制活性IC50值为97.8±6.3μM，鱼腥草素、新鱼腥草素钠、以及二者的混合物对NDM-1的抑制活性均明显优于阳性对照。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠作为或在制备NDM-1抑制剂中的应用。
2.鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠在制备抑制NDM-1的药物中的应用。
3.鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠在制备抗NDM-1细菌或NDM-1超级细菌的药物中的应用。
4.根据权利要求1～3任一所述应用，其特征在于，所述鱼腥草素和新鱼腥草素钠的摩尔比为1～10∶1～10。
5.一种抑制NDM-1的药物组合物，其特征在于，包含鱼腥草素和/或新鱼腥草素钠及其药学上可接受的药物载体。
6.根据权利要求5所述药物组合物，其特征在于，还包含β-内酰胺类抗生素及其药学上可接受的药物载体。
7.权利要求5或6所述药物组合物在制备抗NDM-1细菌或NDM-1超级细菌的药物制剂中的应用。
8.根据权利要求3或7所述应用，其特征在于，所述NDM-1细菌或NDM-1超级细菌选自大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌，阴沟肠杆菌、变形杆菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述药物制剂为口服片剂、胶囊剂、注射剂、注射用无菌粉末、膏剂或霜剂。
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