CN112779328A - 新冠病毒感染血浆中特异性miRNA鉴定及其应用 - Google Patents

新冠病毒感染血浆中特异性miRNA鉴定及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新冠病毒感染血浆中特异性miRNA鉴定及其应用，鉴定了显著的miRNA来区分COVID‑19疾病的不同严重程度，例如COV和HC的has‑miR‑302a‑3p，SM和AS的miR‑122‑5p，SD和MD的hsa‑miR‑214‑3p_L+1R‑4。LTNP和STNP组的hsa‑miR‑95‑3p_R‑1和hsa‑miR‑429可预测和区分病人新冠病毒感染病情长短。本发明的生物标志物可以监测不同感染阶段，如感染初期和恢复期miRNA的差异表达水平，以反映患者病情的进展情况，有助于预测疾病的预后，并区分治疗策略，本发明的特异性miRNA用于在新冠肺炎的诊断、形成新冠肺炎的风险的预测或新冠肺炎的结果的预测。

Description

新冠病毒感染血浆中特异性miRNA鉴定及其应用
技术领域
本发明属于新型冠状病毒肺炎的诊断领域，特别涉及新冠病毒感染血浆中特异性miRNA鉴定及其应用。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，简称“新冠肺炎”，是由2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2病毒)引起的。据报道，SARS-CoV-2不断进化变异，可能与人类持续存在很久，因此探索诊断标记和药物治疗的靶标来治疗COVID-19十分迫切。成熟的microRNA是广泛分布于生物体和病毒中，一类内源表达进化保守的非编码单链小RNA分子，长度约为18至28个核苷酸。已知病毒感染和免疫反应密切相关，microRNA为免疫系统和免疫反应中的一般调节机制，但是宿主或病毒编码的microRNA分别与病毒或宿主mRNA相互作用的具体机制还不清楚。因此，特异性miRNA的发现和验证对于改进COVID-19的感染诊断和临床监测至关重要。
发明内容
本发明涉及一种分类新冠肺炎或者有风险形成新冠肺炎的患者的样品的方法，所述样品选自血液样品、血清样品或血浆样品中的一种或多种，所述方法包括如下步骤：
a)确定所述样品中选自如下至少一组中的至少一种miRNA的表达水平的步骤，
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss 19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；SM和AS比较组包括：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1、hsa-miR-885-5p；AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1；SD和AS比较组包括：hsa-miR-92b-5p_R+1；MD和AS比较组包括：hsa-miR-193b-5p_R-1；MD和MD-R比较组包括hsa-miR-7977_1ss6AG，SD和SD-R比较组包括：hsamiR-625-5p；LTNP和STNP比较组包括：hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-429；SD和MD比较组包括：hsa-miR-214-3p_L+1R-4；
b)比较步骤a)中确定的表达水平的表达量与一种或几种参照表达水平的表达量；
c)从步骤b)中比较的结果将所述患者的样品分类为至少两类之一。
缩略词含义：SM是指，有新冠肺炎症状感染；AS是指，无新冠肺炎症状感染；SD是指，有新冠肺炎症状感染的重型和危重型；MD是指，有新冠肺炎症状感染轻型和普通型；SD-R是指，SD重复样本；MD-R是指，MD重复样本；LTNP是指，长期核酸检测(SARS-CoV-2)阳性样本(≥60天)；STNP是指，短期核酸检测SARS-CoV-2阳性样本(≤45天)；HC是指，健康对照组(Healthy Controls)、COV是指，新冠肺炎患者或试验组。
术语“新冠肺炎的患者”包括新冠肺炎症状和无新冠肺炎症状患者。“有风险形成新冠肺炎的患者”包括新冠病毒的易感人群、疑似人群、接近参照表达水平的表达量的人群等。
术语“表达水平”指例如感兴趣核酸的确定的水平表达。术语“表达水平的表达量”，可为表达水平的绝对表达量或表达水平的相对表达量；“表达水平的相对表达量”，可为与来自参照核酸(例如来自对照)相比较，或与计算的平均表达值(例如在DNA芯片分析中)相比较的确定的表达水平。“参照表达水平的表达量”“参照的表达水平式样”可以为可以用于和另一个表达水平的表达量相比较的任何表达水平的表达量。在本发明优选的实施方式中，参照的表达水平的表达量为例如在充当参照组的健康或患病个体的组中观察到的表达水平的表达量。
本发明还涉及一种在新冠肺炎或者有风险形成新冠肺炎的患者中诊断新冠肺炎、预测形成新冠肺炎的风险、预测新冠肺炎的结果的方法、监测新冠肺炎的临床试验，所述方法包括如下步骤：
a)确定来自所述患者的样品中选自如下至少一组中的至少一种miRNA的表达水平的步骤，所述样品选自血液样品、血清样品或血浆样品中的一种或多种，
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；SM和AS比较组包括：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1、hsa-miR-885-5p；AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1；SD和AS比较组包括：hsa-miR-92b-5p_R+1；MD和AS比较组包括：hsa-miR-193b-5p_R-1；MD和MD-R比较组包括：hsa-miR-7977_1ss6AG，SD和SD-R比较组包括：hsamiR-625-5p；LTNP和STNP比较组包括：hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-429；SD和MD比较组包括：hsa-miR-214-3p_L+1R-4；
b)比较步骤a)中确定的表达水平的表达量与一种或几种参照表达水平的表达量；
c)由步骤b)中的比较结果诊断新冠肺炎、预测形成新冠肺炎的风险、预测新冠肺炎的结果。
术语“预测形成新冠肺炎的风险”是指，比如接近参照表达水平的表达量的人群可能会有较高的确诊为新冠肺炎的风险。
“预测新冠肺炎的结果”是指，比如新冠病毒在感染的早期阶段和晚期阶段之间的DEmiRNA可被用来帮助预测预后；在诊断新冠肺炎的基础上，比如进一步区分SM和AS、SD和MD、LTNP和STNP等。
“监测新冠肺炎的临床试验”是指，比如在重病患者感染进展过程中，可以在不同阶段监测miRNA水平。
根据前述本发明的方法，包括在步骤a)中确定所述miRNA：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1和hsa-miR-2020_010-5p的表达水平，能区分COVID-19患者和健康对照者。
根据前述本发明的方法，包括在步骤a)中确定所述miRNA：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1和hsa-miR-885-5p的表达水平，能区分SM和AS。
根据前述本发明的方法，包括在步骤a)中确定所述miRNA：hsa-miR-146a-3p_L+2R-2，hsa-miR-1-3p和hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC，能区分AS和HC。
根据前述本发明的方法，包括在步骤a)中确定所述miRNA：hsa-miR-92b-5p_R+1的表达水平，区分SD与AS。
根据前述本发明的方法，包括在步骤a)中确定所述miRNA：hsa-miR-193b-5p_R-1的表达水平，区分MD与AS。
根据前述本发明的方法，包括在步骤a)中确定所述miRNA：hsa-miR-7977_1ss6AG的表达水平，只在MD和MD-R比较组中出现，可作为轻型和普通型新冠病人预后监测的生物标志物。
根据前述本发明的方法，包括在步骤a)中确定所述miRNA：hsamiR-625-5p的表达水平，只在SD和SD-R比较组中出现，可作为重型和危重型新冠病人预后监测的生物标志物。
根据前述本发明的方法，包括在步骤a)中确定所述miRNA：hsa-miR-95-3p_R-1和hsa-miR-429的表达水平，区分LTNP和STNP的生物标志物以预测病人新冠病毒感染病情长短。
根据前述本发明的方法，包括在步骤a)中确定所述miRNA：hsa-miR-214-3p_L+1R-4的表达水平，区分SD和MD。
一种涉及在新冠肺炎或者有风险形成新冠肺炎的患者中诊断新冠肺炎、预测形成新冠肺炎的风险、预测新冠肺炎的结果的试剂盒，所述试剂盒包括：
用于确定来自所述患者的样品中选自如下至少一组中的至少一种miRNA的表达水平的装置，所述样品选自血液样品、血清样品或血浆样品中的一种或多种，
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；SM和AS比较组包括：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1、hsa-miR-885-5p；AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1；SD和AS比较组包括：hsa-miR-92b-5p_R+1；MD和AS比较组包括：hsa-miR-193b-5p_R-1；MD和MD-R比较组包括：hsa-miR-7977_1ss6AG，SD和SD-R比较组包括：hsamiR-625-5p；LTNP和STNP比较组包括：hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-429；SD和MD比较组包括：hsa-miR-214-3p_L+1R-4；
至少一种用于和来自所述样品的至少一种miRNA的表达水平进行比较的参照的表达水平的装置。
一种涉及在新冠肺炎或者有风险形成新冠肺炎的患者中诊断新冠肺炎、预测形成新冠肺炎的风险、预测新冠肺炎的结果的计算机程序产品，其包括：
用于接收代表在患者样品中的至少一种miRNA表达水平的数据的步骤，所述miRNA选自：
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；SM和AS比较组包括：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1、hsa-miR-885-5p；AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1；SD和AS比较组包括：hsa-miR-92b-5p_R+1；MD和AS比较组包括：hsa-miR-193b-5p_R-1；MD和MD-R比较组包括：hsa-miR-7977_1ss6AG，SD和SD-R比较组包括：hsamiR-625-5p；LTNP和STNP比较组包括：hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-429；SD和MD比较组包括：hsa-miR-214-3p_L+1R-4；
用于接收代表用于和来自于所述样品的miRNA的表达水平进行比较的参照的表达水平的表达量的数据的步骤；
用于比较代表患者样品中的所述miRNA的表达水平的所述数据的步骤；
用于从比较的结果中确定新冠肺炎的诊断、形成新冠肺炎的风险的预测或新冠肺炎的结果的预测的步骤。
一种在新冠肺炎或者有风险形成新冠肺炎的患者中诊断新冠肺炎、预测形成新冠肺炎的风险、预测新冠肺炎的结果的装置，其包括：
用于接收代表在患者样品中的至少一种miRNA表达水平的数据的装置，所述miRNA选自：
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；SM和AS比较组包括：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1、hsa-miR-885-5p；AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1；SD和AS比较组包括：hsa-miR-92b-5p_R+1；MD和AS比较组包括：hsa-miR-193b-5p_R-1；MD和MD-R比较组包括hsa-miR-7977_1ss6AG，SD和SD-R比较组包括：hsamiR-625-5p；LTNP和STNP比较组包括：hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-429；SD和MD比较组包括：hsa-miR-214-3p_L+1R-4；
用于接收代表用于和来自于所述样品的miRNA的表达水平进行比较的参照的表达水平的表达量的数据的装置；
用于比较代表患者样品中的所述miRNA的表达水平的所述数据的装置；
用于从比较的结果中确定新冠肺炎的诊断、形成新冠肺炎的风险的预测或新冠肺炎的结果的预测的装置。
至少一组中的至少一种miRNA作为筛选用于新冠肺炎的药物候选物或疫苗候选物的生物标记物的用途，
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；SM和AS比较组包括：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1、hsa-miR-885-5p；AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1；SD和AS比较组包括：hsa-miR-92b-5p_R+1；MD和AS比较组包括：hsa-miR-193b-5p_R-1；MD和MD-R比较组包括：hsa-miR-7977_1ss6AG，SD和SD-R比较组包括：hsamiR-625-5p；LTNP和STNP比较组包括：hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-429；SD和MD比较组包括：hsa-miR-214-3p_L+1R-4。
术语“药物候选物或疫苗候选物的生物标记物的用途”是指，比如包括有效和快速评价给定药物或疫苗具有预期功效的可能性；以及，避免药物候选物或疫苗候选物在临床过程中不需要的太高剂量、太低剂量的功效缺乏；以及，确保将适当药物或疫苗施用于适当患者(排除非特异性患者)。
进一步的，所述药物候选物或疫苗候选物包括靶向SARS-CoV-2基因的药物，靶向位点包括膜蛋白(Membrane protein)、刺突蛋白(Spike protein)、核壳蛋白(Nucleocapsid protein)和开放阅读狂区域(Openreading frame)中的至少一种；
其中，所述hsa-mir-1976-p5、hsa-mir-382-5p靶向膜蛋白；所述hsa-mir-15b-5p、hsa-mir-21-3p靶向刺突蛋白；所述hsa-mir-29b-3p、hsa-mir-214-3p_L-1R+1靶向核壳蛋白；所述hsa-miR-194-5p_R-1靶向ORF1ab区域)；所述hsa-miR-214-3p_L+1R-4靶向N/ORF1ab区域。
能够与至少一组中的至少一种miRNA杂交的经分离的核酸探针在制备诊断试剂中的用途，所述诊断试剂用于诊断新冠病毒感染，或者用于评价用于新冠病毒感染的药物候选物或疫苗候选物的活性。
特别的，本发明还提供了用于前文用途的生物标记物，所述生物标记物选自SEQID NO：1至SEQ ID NO：12的一种或多种miRNA。
特别进一步的，至少一种或多种miRNA，与其他miRNA进行组合成如下组：
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；
AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1。
本发明的有益效果在于，本发明的生物标志物可以监测新冠肺炎不同感染阶段，如感染初期和恢复期miRNA的差异表达水平，以反映患者病情的进展情况，有助于预测疾病的预后，并区分治疗策略，特别是本发明的特异性miRNA用于在新冠肺炎的诊断、形成新冠肺炎的风险的预测或新冠肺炎的结果的预测。
附图说明
图1本发明实施例的技术路线图；
图2本发明实施例的分组信息图；
图3本发明实施例的10个比较组的差异表达miRNA火山图；
图4本发明实施例的SD22和MD12比较组的差异表达miRNA火山图、GO分析和KEGG分析；
图5本发明实施例的COV vs HC、AS vs HC、SM vs HC和SM vs AS四组Venn图；
图6本发明实施例的COV vs HC、AS vs HC、SM vs HC和SM vs AS四组差异表达miRNA小提琴图；
图7本发明实施例的COV vs HC、AS vs HC、SM vs HC和SM vs AS四组GO富集分析；
图8本发明实施例的COV vs HC、AS vs HC、SM vs HC和SM vs AS四组KEGG富集分析；
图9本发明实施例的COV vs HC、AS vs HC、SM vs HC和SM vs AS、MD与AS、SD与AS、SD与MD七组的热图；
图10本发明实施例的MD与AS、SD与AS、SD与MD、MD与MD-R、SD与SD-R及LTNP与STNP六组GO富集分析；
图11本发明实施例的MD与AS、SD与AS、SD与MD、MD与MD-R、SD与SD-R及LTNP与STNP六组KEGG富集分析；
图12本发明实施例的MD与MD-R、SD与SD-R两组的热图；
图13本发明实施例的MD12与SD22两组热图；
图14本发明实施例的LTNP与STNP组差异表达miRNA与病情长短的相关性分析；
图15本发明实施例的LTNP与STNP组显著miRNA热图；
图16本发明实施例的人源miRNA靶向SARS-CoV-2病毒基因组；
以下为附图中外文的中文译文
图3中，pValue，P值；significance，显著；up，上调；down，下调；no_diff不显著；FC，倍数。
图4中，pValue，P值；up，上调；down，下调；no_diff不显著；FC，倍数。
具体实施方式
以下具体实施方式公开了诸多技术细节，然而，不应当理解为对本发明保护范围的限制。
为了探索microRNA如何参与SARS-CoV-2感染时宿主和病毒之间相互作用的机制，对基础健康状况不同、病情程度不同和SARS-CoV-2核酸转阴时间长短不同的COVID-19患者的血浆样本进行了血浆microRNA组(miRNAome)的检测。分析了不同组别患者之间血浆中microRNAs表达水平的差异和病情发生发展过程中的变化趋势，并查找这些差异表达microRNAs的靶基因及其参与的信号通路，预测这些microRNA的功能，从而达到了本发明目的。即确定COVID-19潜在的可用于新冠疾病分型的生物标志物及探索可用于诊断和治疗COVID-19的特异miRNA。
1.1伦理声明
本研究经西安交通大学第一附属医院伦理委员会和武汉大学人民医院伦理委员会批准。血浆样本是在标准诊断检测中收集的现有样本上进行的，不会给患者带来额外负担。
1.2样本收集及组别
共采集231份样本，分别为116位COVID-19患者总共165份新冠外周血样本和61名健康对照者的66份外周血样本。COVID-19患者的临床资料和实验室检查结果来自武汉大学人民医院东医院。所有纳入本研究的COVID-19患者均按照世界卫生组织暂行指南、中华人民共和国国家卫生委员会制定的《新型冠状病毒感染性肺炎的诊断和治疗指南》以及患者的首次样本采集时的状态和实验室检查指标进行分类。
为避免个体重复对数据分析结果造成的误差，将165份外周血样本分为116份单人单次首次采血样本，及相对应的34份单人最后一次采血外周血样本和14份中间重复采血样本和1次死亡样本。116份单人单次首次采血样本分别为有症状感染(SymptomaticInfection，SM)、无症状感染(Asymptomatic Infection，AS)。对病情严重程度不同、SARS-CoV-2核酸检测转阴时间不同的COVED-19患者和未感染新冠病毒的正常人的血浆样本总计231份进行了收集。分别为116位COVED-19患者总共165份新冠外周血样本和61名健康对照者的66份外周血样本。首先将116份单人单次首次采血样本分为有症状感染(SM)、无症状感染(AS)。将有症状感染样本根据病情的严重程度分为重型和危重型(SD)和轻型和普通型(MD)。根据以病人开始出现新冠症状时间到病人两次以上核酸检测转阴时间计算的病程时间长短将有症状感染样本进一步分为长期核酸检测阳性样本(LTNP，核酸检测阳性时间≥60天)和短期核酸检测阳性样本(STNP，核酸检测阳性时间≤45天)。34份单人最后一次采血外周血样本分为MD重复样本(MD-R)和SD重复样本(SD-R)。正常人样本做差异表达分析只取首次采血的61份样本(HC)。具体分组流程见图2。
同时，为了便于纵向分析，即SD与SD-R、MD与MD-R两组的比较，我们选取了新冠病人两次以上采血个体的首次采血样本进行了进一步的差异表达分析，分别命名为重型和危重型(SD22)和轻型和普通型(MD12)。因此便于与之前的分组区分，以上分型，重型和危重型(SD)和轻型和普通型(MD)标注为SD48与MD52。将66份健康人外周血样本分为61份单人单次首次采血样本(Healthy Controls，HC)和5份重复样本，具体的临床信息分析见表1。
表1：本文中的样本信息表
Figure BDA0002881392260000131
Figure BDA0002881392260000141
缩写：四分位间距，INQ。
1.5 miRNA序列数据分析
首先，原始测序数据通过fastx_toolkit(版本：0.0.13.2，http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)来过滤掉低质量的
reads。使用cutadapt(版本：1.15)修剪测序序列。然后，对待分析的数据(cleanreads)进行进一步的处理，消除在库准备和测序过程中引入的重复偏倚。简单地说，首先根据UMI序列对cleanreads数据进行聚类，其中具有相同UMI序列的reads被分到同一个簇中。通过成对比较，将同一簇中的reads数据进行比对，然后将序列一致性为100％的reads数据提取到一个新的子簇中。所有的亚聚类产生后，进行多序列比对以获得每个子簇的一个共有序列。
然后，通过内部程序ACGT101 miR(LCSciences，Houston，Texas，USA)来去除常见的RNA家族(rRNA，tRNA，snRNA，snRNA)和重复序列。随后，通过BLAST搜索将长度为18-26个核苷酸的独特序列映射到miRBase 22.0中的人类前体，以识别已知的miRNA和新的3p和5p衍生的miRNA。在3’和5’端的长度变化和序列内部的一个不匹配是允许的。在发夹臂中定位到人类成熟miRNA的独特序列被鉴定为miRNA。与已注释的成熟miRNA臂相反的已知人类前驱发夹臂的独特序列被认为是新的5p或3p衍生miRNA候选序列。未映射的序列被BLAST到人类基因组(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-96/fasta/homo_sapiens/dna/)并采用RNAfold软件从侧翼80nt序列中预测了含有发夹状结构的RNA序列(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi).二级结构预测的标准为：(1)茎中一个突起的核苷酸数目(≤12)；(2)预测发夹茎区碱基对的数目(≥16)；(3)自由能的cutoff值(kCal/mol≤-15)；(4)发夹长度(上下茎+末端环≥50)；(5)发夹环长度(≤20)；(6)成熟区域中一个凸起中的核苷酸数目(≤8))；(7)成熟区域中一个凸起中的偏差误差数量(≤4)；(8)成熟区域中偏斜凸起的数量(≤2)；(9)成熟区域中的错误数(≤7)；(10)预测发夹成熟区域中的碱基对数目(≥12)；(11)茎中成熟的百分比(≥80)。
1.6 miRNA的差异表达分析
对11个比较组，总共采用211份血浆样本进行差异表达分析。分别是116份COVID-19单人单次首次采血样本、34个COVID-19重复样本和61个健康人外周血样本。Student’t检验分析基于标准化深度测序计数的miRNA差异表达量。11个对照组(图1)采用相同的方法进行分析。本研究中P显著阈值设为＜0.05，倍数变化(Fold change)＞1.50或＜0.67，miRNA的均值在任一组中的表达量＞10，三个条件都满足则为具有显著差异表达。另外，低表达被定义为拷贝数均小于10的miRNA。至少一个样本拷贝数大于10且小于数据集平均拷贝数(拷贝数之和/(样本数×miRNA总数))的miRNA被定义为中表达。
高表达被定义为拷贝数大于数据集平均拷贝数的miRNA。本实施例中剔除了低表达的miRNA。
1.7靶基因预测
为了预测差异表达miRNA靶向基因，
TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/docs/help.html)和miRanda(http://cbio.mskcc.org/miRNA2003/miranda.html)两种算法被用于识别miRNA结合位点的靶向预测。TargetScan算法去除context scorepercentile＜90的目标基因，miRanda算法去除score cutoff＜140，最大能量＞-20kcal/mol的目标基因，最后将两种算法预测的结果取交集得到最终的靶基因预测结果。
1.8 Gene Ontology和KEGG途径富集分析
对差异表达显著的miRNA靶基因进行功能分析，来研究其相关的生物学功能，包括GO生物学过程、G0分子功能、G0细胞成分和京都基因基因组百科全书(KEGG)途径。对于GO或KEGG通路，P值计算公式如式I所示。
Figure BDA0002881392260000171
S表示被映射到特定G0术语或路径的显著基因的数量。TS代表显著差异表达基因的总数。B表示映射到特定GO或路径的基因数量。TB代表所有G0或通路的基因总数。详细的流程图如图1所示。
1.9 SARS-COV-2基因组与miRNA序列的比较
为进一步探讨miRNA在COVID-19发病机制中的作用，使用从武汉地区(NC_045512.2)获得的SARS-CoV-2全基因组序列来进行比较。我们对本库中的所有miRNA，使用miRanda和TargetScan预测靶向SARS-CoV-2基因组的
miRNA，TargetScan得分≥90，miRanda评分≥140，最大能量＜-20kcal/mol。
1.10统计分析
用Student’t检验计算差异表达的miRNA。P＜0.05，倍数变化＞1.50或＜0.67，均值在任一分析组中>10，三个条件都满足则为具有显著差异表达。低表达的miRNA被踢除。对LTNP组和STNP组显著的miRNA，采用Spearman相关分析核酸检测阳性天数与miRNA标准化拷贝数之间的相关性。以P＜0.05为显著水平。GraphPad Prism 8.0.2，SPSS 18.0和OmicStudio工具(https://www.omicstudio.cn/tool)用于本分析。
2.研究结果
2.1差异表达的miRNA
通过对231份样本(165份患者样本和66份正常样本)的miRNA序列分析，在我们的miRNA序列文库中鉴定出2336个已知miRNA和361个新miRNA。表2-1显示了显著差异表达的miRNA(DE miRNA)的概况。共鉴定出75个差异表达miRNA，包括63个已知的miRNA(表2-2)和12个新miRNA(表2-3)。此外，各组火山图见图3和图4。
2.2 COV与HC、AS与HC、SM vs HC和SM vs AS的显著差异表达miRNA比对分析，靶基因预测及功能分析结果
对于COVvs HC、AS vs HC、SM vs HC和SMvs AS，miRNA测序分别鉴定出24、24、27和17个显著的DE miRNA(表2-1、表3)。COV vs HC、ASvs HC和SMvs HC组之间共有的DE miRNA有6个，说明这6个DE miRNA可区分新冠病人和正常人。COVvs HC和AS vs HC组共有的DEmiRNA有8个，说明这8个DE miRNA可区分无症状新冠病人和正常人，四组总共有51个miRNA(图5)。其中文献报道过36个与病毒、炎症、免疫系统或肺部疾病有关，36个miRNA在四组的差异显著分析小提琴图见图6。
表2-1 11个比较组miRNA差异表达的研究概况
Figure BDA0002881392260000181
Figure BDA0002881392260000191
表2-2 63个已知miRNA列表
Figure BDA0002881392260000192
Figure BDA0002881392260000201
表2-3 12个新发现miRNA的序列列表
序号 miRNA 序列
1 hsa-miR-2020_003-3p CGAGUCCCAUCAGCCACCCCA
2 hsa-miR-2020_005-<sup>3</sup>p ACAACUCACCUGCCGAAUG
3 hsa-miR-2020_004-3p AGUAGGUAAUCUUCAGGCU
4 hsa-miR-2020_007-3p UCAGAGUUCUACGGUCCGA
5 hsa-miR-2020_008-3p AGACUCGUCUCCCGCUCU
6 hsa-miR-2020_016-3p AGACUCGUCUCCUGCUCCA
7 h sa-miR-2020_001-3p AUCCCUCCGUCUCCGCCA
8 hsa-miR-2020_009-5p AGAGUGGGGUUUUGCAGUC
9 hsa-miR-2020_010-5p ACUUGACUGCUCUGACCA
10 hsa-miR-2020_017-5p UUAUCCAGCUUGUUACUAUAUG
11 hsa-miR-2020_013-5p UGGGGGAAGGGAGCUAGCCUGACU
12 hsa-miR-2020_002-5p AGCAGGACGGUGGCCAUGGAAGC
通过靶基因预测分析，将COV vs HC、AS vs HC、SM vs HC和SM vs AS的DE miRNA分别定位到3108、3814、2790和1199个靶基因上，如hsa-miR-370-3p的IL32，hsa-miR-302b-3p_R-2的FAM13B，hsa-miR-302a-3p的CD44。COV vs HC、AS vs HC、SM vs HC和SM Vs AS的显著的G0项分别为936、952、854和512项。例如，NF-kappa B信号通路正调控(GO：0043123)，慢性炎症反应的副调控信号通路(GO：0002677)和I型IFN受体活性信号(GO：0004905)等是显著的GO项。四个比较组G0富集分析见图7，富集分析显示，GO通路主要富集在NF-kappa B信号通路、自噬和膜融合等。KEGG通路分析检测到COV vs HC、AS vs HC、SM vs HC和SM vsAS的显著途径分别为59、71、60和27条，比如非小细胞肺癌(ko05223)，Rap1信号通路(ko04015)和PI3K-Akt信号通路(ko04151)等。四个比较组KEGG富集分析见图8，可以看出，主要富集在癌症通路和PI3K-AKT等信号通路相关。这些GO和KEGG显著和富集的相关的信号通路都可能与新冠病毒感染之后宿主的炎症反应、肺部症状和抗病毒反应等相关。
对以上结果进行总的梳理发现(图9)，与免疫功能相关的在COV vs HC、AS vs HC、SM vs HC和SM vs AS四个比较组中的miRNA分别有17、19、18和13个，与病毒有关的有18、13、18和11个miRNA。其次和肺相关的miRNA在COV vs HC、AS vs HC、SM vs HC和SM vs AS中分别有13，8，12和2个，请参考表3。
Figure BDA0002881392260000221
Figure BDA0002881392260000231
Figure BDA0002881392260000241
2.3 MD与AS、SD与AS、SD与MD、MD与MD-R、SD与SD-R的显著比对分析，靶基因预测及功能分析结果
对于MD vs AS，SD vs AS，SD48 vs MD52和SD22 vs MD12，miRNA测序分别鉴定出15，7，1和5个显著的DE miRNA(表4)。有趣的是，与AS相比，SD患者和MD患者的hsa-miR-885-5p的表达水平显著升高(FCSD vs AS＝2.64，P＝0.011；FCMD vs AS＝3.40，P＝0.002)。
hsa-miR-302b-3p_R-2在SD22 vs MD12中有着极大程度的表达水平升高(FCSD vs MD＝49.46，P＝0.026)，SD22 vs MD12组的5个差异表达的miRNA热图分析见图13。SD48vsMD52比较组中，hsa-miR-214-3p_L+1R-4在MD组上调表达。
对于MD vs MD-R和SD vs SD-R，miRNA测序分别鉴定出5个和3个DE-miRNA，比如，只在MD vs MD-R这一比较组中出现的一个DEmiRNA，miR-7977_1ss6AG(FCMD vs MD-R＝1.56，PMD vs MD-R＝0.016)(表5)。
其中hsa-miR-625-5p(FCaD vs SD-R＝1.63，PSD vs SD-R＝0.000014)在SD vs SD-R组显著表达，在重复样本中，表达量明显降低。hsa-miR-625主要与肺癌、急性肺损伤有关。
通过靶基因预测分析，将MD vs AS、SD vs AS、SD48 vs MD52、SD22 vs MD12、MDvs MD-R、SD vs SD-R分别定位到1418、573、157、407、542和465个靶基因上，如hsa-miR-885-5p的TRAF6、hsa-miR-302b-3p_R-2的KDM1B和hsa-miR-122b-5p_R-1的TXLNB。我们还发现549、665、512、411、644和542个GO术语分别适用于MD与AS、SD与AS、SD48 vs MD52、SD22vs MD12、MD与MD-R以及SD与SD-R。
例如，T细胞增殖(GO：0042098)，NK细胞介导的免疫反应(GO：0002228)和病毒传播(GO：0019089)等都是重要的GO术语，通过GO富集分析(图10)可见，MD vs AS组、SD vs AS组、MD vs MD-R组、SD与SD-R组和SD48 vs MD52组的GO富集分析表明这几组的差异表达miRNA的功能主要分别和慢性炎症反应的负调节、细胞分裂、细胞群增殖副调控信号通路、MAPK信号通路级联反应和细胞贴壁黏附等功能相关。另外，KEGG通路分析检测到MD与AS、SD与AS、SD48 vs MD52、MD与MD-R、SD与SD-R分别有21、15、25、33、32条重要通
路，如P53信号通路(ko04115)、MAPK信号通路(ko04010)和cAMP信号通路(ko04024)。通过KEGG富集分析(图11)可见，MD vs AS组、SD vs AS组、MD vs MD-R组、SD与SD-R组的KEGG富集分析表明这四组的差异表达miRNA主要是和PI3K-AKT信号通路、细胞内吞作用、HIV病毒感染和癌症信号通路等相关。
SD48 vs MD52组的KEGG富集分析表明这一组的差异表达miRNA的功能主要和PI3K-AKT信号通路和钙调信号通路等相关。SD22 vs MD12组的GO和KEGG分析表明(图4)差异表达miRNA功能主要是和细胞贴壁黏附、钙调信号通路相关。
MD vs AS比较组中有13、11和2个miRNA的靶基因分别与免疫功能、病毒及肺功能相关(图9)。SD vs AS组中有6、5和1个miRNA的靶基因分别与免疫功能、病毒及肺功能相关(图9)。在SD48 vs MD52中显著的hsa-miR-214-3p_L+1R-4的靶基因富集与免疫和病毒相关的功能条目中(图9)。MD vs MD-R与SD vs SD-R分别有3和2个miRNA与免疫功能相关，有4和1个miRNA与病毒相关及1和3个miRNA的靶基因富集于肺功能相关的条目中(图12)。在SD22vs MD12中，分别有4、2和2个miRNA与疫功能、病毒及肺功能相关(图13)。
Figure BDA0002881392260000271
表5 MD vs MD-R和SD vs SD-R的差异表达miRNA
Figure BDA0002881392260000281
缩写：倍数，FC；轻症患者，MD；轻症重复样本，MD-R；重症患者，SD；重症患者重复样本，SD-R.
2.4 LTNP与STNP比较组的显著性差异表达miRNA，靶基因预测及功能分析结果
对于LTNP与STNP，miRNA测序鉴定出20个显著的DE miRNA(表6)。其中，有14个DE-miRNA
表6 LTNP vs STNP显著差异表达miRNA
Figure BDA0002881392260000282
Figure BDA0002881392260000291
缩写：倍数，FC；长期核酸检测阳性，LTNP；短期核酸检测阳性，STNP.
上调表达，6个DE-miRNA下调表达。有14个miRNA只在这一比较组中出现差异表达。选取以上miRNA进行了miRNA表达量高低与病情时间长短的相关性分析(图14)。其中有9个miRNA与病情长短有显著的相关性，其中，hsa-miR-370-3p和hsa-miR-574-5p与病程长短呈负相关，随着病程增加，表达量降低。与病程长短呈正相关的有7个miRNA，分别是：hsa-miR-574-5p、hsa-miR-2020_007-3p、hsa-miR-320c_R-1、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-378i_R+1_1ss9AT、hsa-miR-429和hsa-miR-499a-5p。通过靶基因预测分析，将LTNP与STNP组的差异表达miRNA定位到1848个靶基因。比如hsa-mir-10b-5p_R-1的INF2和hsa-miR-214-3p_L+1R-4的MAPK10等靶基因。
对于LTNP与STNP，发现594个重要的GO术语。例如，调节性T细胞的分化(GO：0045589)，CD4+细胞活性的负调节(GO：0043371)和线粒体功能(G0：0005739)等是显著的GO项。GO富集分析表明(图10)LTNP与STNP组的差异表达miRNA的功能主要是和MAPK级联反应信号通路、细胞侵袭和自嗜相关。此外，KEGG通路分析检测到LTNP与STNP的显著通路为44个，如HIF-1信号通路(ko04066)，Ras信号通路(ko04014)和p53信号通路(ko04115)。KEGG富集分析(图11)表明LTNP与STNP组的差异表达miRNA的功能主要和cAMP信号通路、钙调信号和癌症相关信号通路等相关。
LTNP及STNP的11、10和8个显著miRNA的靶基因主要富集与免疫功能、病毒及肺功能相关的条目中(图15)
2.5区分不同COVID-19病情的可能生物标志物
在上述比较结果中，我们可以进一步找到特异性miRNA，以区分不同疾病的严重程度。首先，我们想确定特异性miRNA以区分COVID-19患者和正常人。由于COV组包括AS和SM，特异性miRNA在AS和SM，AS和HC中也应有差异表达。因此，本次共发现有6个miRNA，分别是：hsa-miR-370-3p，hsa-mir-12136-p3_1ss19TC，hsa-miR-302b-3p_R-2，hsa-miR-302a-3p，hsa-miR-939-5p_R+1和hsa-miR-2020_010-5p。
其次，我们还选择了hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1和hsa-miR-885-5p作为生物标志物来区分COVID-19患者的SM和AS。这三个miRNA是符合在COV vs HC、SM vsAS、SD vs AS、MD vs AS中都差异表达条件的miRNA。
有4个novel和7个known DEmiRNA只在AS和HC比较组中出现，分别为hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p和hsa-miR-2020_017-5p，hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p和hsa-miR-133a-3p_R+1。其中，根据查阅文献和数据的稳定性，hsa-miR-146a-3p_L+2R-2，hsa-miR-1-3p和hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC为区分AS和HC的生物标志物。
hsa-miR-92b-5p_R+1只在SD与AS比较组中差异表达，因此可作为区分SD与AS的特异生物标志物。
hsa-miR-193b-5p_R-1只在MD与AS比较组中差异表达，因此可作为区分MD与AS的特异生物标志物。
hsa-miR-7977_1ss6AG只在MD和MD-R比较组中出现，可作为轻型和普通型新冠病人预后监测的生物标志物。hsa-miR-625-5p只在SD和SD-R比较组中出现，可作为重型和危重型新冠病人预后监测的生物标志物。
在比较组STNP与LTNP中，有20个miRNA差异表达，说明这20个miRNA与新冠病毒感染病程的长短有关。
其中有14个miRNA只在这一比较组出现，其中有9个miRNA与病情长短有显著的相关性，其中，hsa-miR-95-3p_R-1和hsa-miR-429可联合作为区分LTNP和STNP的生物标志物以预测病人新冠病毒感染病情长短。
hsa-miR-214-3p_L+1R-4可作为区分SD和MD的特异生物标志物。
2.6人源miRNA靶向SARS-CoV-2病毒基因组
本数据库共建立了2,336个已知的miRNA和361新发现的miRNA，通过miRanda和TargetScan靶向到SARS-CoV-2基因组，结果显示65个miRNA(表7)(58个已知的miRNA和7个新发现的miRNA)靶向SARS-CoV-2基因，靶向位点包括膜蛋白(Membrane protein)、刺突蛋白(Spike protein)、核壳蛋白(Nucleocapsid protein)和开放阅读狂区域(Open readingframe)。如hsa-mir-1976-p5、hsa-mir-382-5p靶向膜蛋白，hsa-mir-15b-5p、hsa-mir-21-3p靶向刺突蛋白，hsa-mir-29b-3p、hsa-mir-214-3p_L-1R+1靶向核壳蛋白，hsa-miR-194-5p_R-1(ORF1ab区域)和hsa-miR-214-3p_L+1R-4(N/ORF 1ab区域)(图16)。
表7 65个靶向SARS-CoV-2基因的miRNA
Figure BDA0002881392260000321
Figure BDA0002881392260000331
2.7总结
本发明的具体实施例鉴定了显著的miRNA来区分COVID-19疾病的不同严重程度，例如COV和HC的has-miR-302a-3p，SM和AS的miR-122-5p，SD和MD的hsa-miR-214-3p_L+1R-4。LTNP和STNP组的hsa-miR-95-3p_R-1和hsa-miR-429可预测和区分病人新冠病毒感染病情长短。此外，对靶基因及相关功能进行预测，以进一步了解miRNA在COVID-19中的作用机制。差异表达miRNA在COVID-19人群筛选中具有广阔的应用前景。例如，我们可以监测不同感染阶段，如感染初期和恢复期miRNA的差异表达水平，以反映患者病情的进展情况，有助于预测疾病的预后，并区分治疗策略。同时，miRNA还可以作为调控病情网络的切入点，用于探索新的治疗靶点。因此，本研究所筛选出来可作为显著生物标志物的DE-miRNA对COVID-19机制的研究和临床治疗具有重要的意义。
以上所述实施例仅仅是本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 西安交通大学医学院第一附属医院
<120> 新冠病毒感染血浆中特异性miRNA 鉴定及其应用
<130> 2020.12.24
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人()
<400> 1
cgagucccau cagccacccc a 21
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
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Claims (15)

1.一种分类新冠肺炎或者有风险形成新冠肺炎的患者的样品的方法，其特征在于，所述样品选自血液样品、血清样品或血浆样品中的一种或多种，所述方法包括如下步骤：
a)确定所述样品中选自如下至少一组中的至少一种miRNA的表达水平的步骤，
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；SM和AS比较组包括：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1、hsa-miR-885-5p；AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1；SD和AS比较组包括：hsa-miR-92b-5p_R+1；MD和AS比较组包括：hsa-miR-193b-5p_R-1；MD和MD-R比较组,SD和SD-R比较组包括：hsa-miR-7977_1ss6AG、hsamiR-625-5p；LTNP和STNP比较组包括：hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-429；SD和MD比较组包括：hsa-miR-214-3p_L+1R-4；
b)比较步骤a)中确定的表达水平的表达量与一种或几种参照表达水平的表达量；
c)从步骤b)中比较的结果将所述患者的样品分类为至少两类之一。
2.一种在新冠肺炎或者有风险形成新冠肺炎的患者中诊断新冠肺炎、预测形成新冠肺炎的风险、预测新冠肺炎的结果的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a)确定来自所述患者的样品中选自如下至少一组中的至少一种miRNA的表达水平的步骤，所述样品选自血液样品、血清样品或血浆样品中的一种或多种，
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；SM和AS比较组包括：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1、hsa-miR-885-5p；AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1；SD和AS比较组包括：hsa-miR-92b-5p_R+1；MD和AS比较组包括：hsa-miR-193b-5p_R-1；MD和MD-R比较组,SD和SD-R比较组包括：hsa-miR-7977_1ss6AG、hsamiR-625-5p；LTNP和STNP比较组包括：hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-429；SD和MD比较组包括：hsa-miR-214-3p_L+1R-4；
b)比较步骤a)中确定的表达水平的表达量与一种或几种参照表达水平的表达量；
c)由步骤b)中的比较结果诊断新冠肺炎、预测形成新冠肺炎的风险、预测新冠肺炎的结果。
3.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，包括在步骤a)中确定所述miRNA：
hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1和hsa-miR-2020_010-5p；的表达水平。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，包括在步骤a)中确定所述miRNA：
hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1和hsa-miR-885-5p的表达水平。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，包括在步骤a)中确定所述miRNA：
hsa-miR-146a-3p_L+2R-2，hsa-miR-1-3p和hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，包括在步骤a)中确定所述miRNA：
hsa-miR-92b-5p_R+1或者hsa-miR-193b-5p_R-1的表达水平。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，包括在步骤a)中确定所述miRNA：
hsa-miR-7977_1ss6AG的表达水平；
或者hsamiR-625-5p的表达水平；
或者hsa-miR-95-3p_R-1的表达水平；
或者hsa-miR-429和hsa-miR-214-3p_L+1R-4的表达水平。
8.一种在新冠肺炎或者有风险形成新冠肺炎的患者中诊断新冠肺炎、预测形成新冠肺炎的风险、预测新冠肺炎的结果的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
用于确定来自所述患者的样品中选自如下至少一组中的至少一种miRNA的表达水平的装置，所述样品选自血液样品、血清样品或血浆样品中的一种或多种，
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；SM和AS比较组包括：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1、hsa-miR-885-5p；AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1；SD和AS比较组包括：hsa-miR-92b-5p_R+1；MD和AS比较组包括：hsa-miR-193b-5p_R-1；MD和MD-R比较组,SD和SD-R比较组包括：hsa-miR-7977_1ss6AG、hsamiR-625-5p；LTNP和STNP比较组包括：hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-429；SD和MD比较组包括：hsa-miR-214-3p_L+1R-4；
至少一种用于和来自所述样品的至少一种miRNA的表达水平进行比较的参照的表达水平的装置。
9.一种在新冠肺炎或者有风险形成新冠肺炎的患者中诊断新冠肺炎、预测形成新冠肺炎的风险、预测新冠肺炎的结果的计算机程序产品，其特征在于，其包括：
用于接收代表在患者样品中的至少一种miRNA表达水平的数据的手段，所述miRNA选自：
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；SM和AS比较组包括：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1、hsa-miR-885-5p；AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1；SD和AS比较组包括：hsa-miR-92b-5p_R+1；MD和AS比较组包括：hsa-miR-193b-5p_R-1；MD和MD-R比较组,SD和SD-R比较组包括：hsa-miR-7977_1ss6AG、hsamiR-625-5p；LTNP和STNP比较组包括：hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-429；SD和MD比较组包括：hsa-miR-214-3p_L+1R-4；
用于接收代表用于和来自于所述样品的miRNA的表达水平进行比较的参照的表达水平的表达量的数据的手段；
用于比较代表患者样品中的所述miRNA的表达水平的所述数据的手段；
用于从比较的结果中确定新冠肺炎的诊断、形成新冠肺炎的风险的预测或新冠肺炎的结果的预测的手段。
10.一种在新冠肺炎或者有风险形成新冠肺炎的患者中诊断新冠肺炎、预测形成新冠肺炎的风险、预测新冠肺炎的结果的装置，其特征在于，其包括：
用于接收代表在患者样品中的至少一种miRNA表达水平的数据的装置，所述miRNA选自：
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；SM和AS比较组包括：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1、hsa-miR-885-5p；AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1；SD和AS比较组包括：hsa-miR-92b-5p_R+1；MD和AS比较组包括：hsa-miR-193b-5p_R-1；MD和MD-R比较组,SD和SD-R比较组包括：hsa-miR-7977_1ss6AG、hsamiR-625-5p；LTNP和STNP比较组包括：hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-429；SD和MD比较组包括：hsa-miR-214-3p_L+1R-4；
用于接收代表用于和来自于所述样品的miRNA的表达水平进行比较的参照的表达水平的表达量的数据的装置；
用于比较代表患者样品中的所述miRNA的表达水平的所述数据的装置；
用于从比较的结果中确定新冠肺炎的诊断、形成新冠肺炎的风险的预测或新冠肺炎的结果的预测的装置。
11.至少一组中的至少一种miRNA作为筛选用于新冠肺炎的药物候选物或疫苗候选物的生物标记物的用途，
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；SM和AS比较组包括：hsa-miR-122-5p_R-1、hsa-miR-1246_R+1、hsa-miR-885-5p；AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1；SD和AS比较组包括：hsa-miR-92b-5p_R+1；MD和AS比较组包括：hsa-miR-193b-5p_R-1；MD和MD-R比较组,SD和SD-R比较组包括：hsa-miR-7977_1ss6AG、hsamiR-625-5p；LTNP和STNP比较组包括：hsa-miR-95-3p_R-1、hsa-miR-429；SD和MD比较组包括：hsa-miR-214-3p_L+1R-4。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述药物候选物或疫苗候选物包括靶向SARS-CoV-2基因的药物，靶向位点包括膜蛋白(Membrane protein)、刺突蛋白(Spikeprotein)、核壳蛋白(Nucleocapsid protein)和开放阅读狂区域(Openreading frame)中的至少一种；
其中，所述hsa-mir-1976-p5、hsa-mir-382-5p靶向膜蛋白；所述hsa-mir-15b-5p、hsa-mir-21-3p靶向刺突蛋白；所述hsa-mir-29b-3p、hsa-mir-214-3p_L-1R+1靶向核壳蛋白；所述hsa-miR-194-5p_R-1靶向ORF1ab区域)；所述hsa-miR-214-3p_L+1R-4靶向N/ORF1ab区域。
13.能够与至少一组中的至少一种miRNA杂交的经分离的核酸探针在制备诊断试剂中的用途，所述诊断试剂用于诊断新冠病毒感染，或者用于评价用于新冠病毒感染的药物候选物或疫苗候选物的活性。
14.一种用于上述任一权利要求用途的生物标记物，其特征在于，所述生物标记物选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12的一种或多种miRNA。
15.如权利要求13所述生物标记物，其特征在于，至少一种或多种miRNA，与其他miRNA进行组合成如下组：
其中，COV和HC比较组包括：hsa-miR-370-3p、hsa-mir-12136-p3_1ss19TC、hsa-miR-302b-3p_R-2、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-939-5p_R+1、hsa-miR-2020_010-5p；
AS和HC比较组包括：hsa-miR-2020_013-5p、hsa-miR-2020_005-3p、hsa-miR-2020_002-5p、hsa-miR-2020_017-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3960_R-2_1ss12AC、hsa-miR-146a-3p_L+2R-2、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-133a-3p_R+1。
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