CN112763469A - 一种微阵列荧光传感芯片及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微阵列荧光传感芯片及其应用，所述芯片包括阵列载体和分别固定在所述阵列载体上的6种荧光染料，所述阵列载体是聚苯乙烯微球在等离子玻璃表面自组装形成的光子晶体结构，所述荧光染料为NR、TDS、DR、Rh6G、NED和Np。本发明首次将光子晶体应用于白酒检测，通过结合光子晶体的荧光放大特性和染料的广谱识别能力构建固态阵列应用于不同白酒的检测识别。该方法对白酒具有良好的识别能力，为白酒检测提供了一种准确、灵敏、快速的新方法。

Description

一种微阵列荧光传感芯片及其应用
技术领域
本发明涉及纳米技术及食品检测技术领域，尤其涉及一种微阵列荧光传感芯片及其应用。
背景技术
白酒大部分由乙醇和水组成，微量组分仅占2％。由于白酒酿造微生物的多样性，在各种微生物的共同作用下，白酒中的这些风味成分众多，浓度都较低，从ng/L到mg/L不等，同时在各种白酒中的含量和比例不同，从而构成了各种白酒的不同香型和风格。目前，已有一些常规方法用于不同品类和产地白酒的区别，如质谱技术和光谱技术；虽然光谱技术是一种简单、快速、无损的方法，但其灵敏度相对较低，容易在具有相似光谱区域的组分间产生干扰。而质谱技术成本高，操作较为复杂，很难在现场中实现实时检测。因此，开发一种简便、快速且有效的对不同白酒鉴别的方法对于白酒质量监控和真伪评价分析具有重要意义。
光子晶体是指具有光子带隙特性的人造周期性电介质结构的物质，主要由高度有序的介电材料(如聚苯乙烯微球、SiO2微球、TiO2微球、金属有机框架)组成。光子晶体特殊的周期性结构，使其对特定波长或波段的光子具有禁阻作用，形成的光子带称为光子禁带。光子禁带使光子晶体具有调控光传播的能力，由于禁阻作用，光子晶体中光子传播速度在禁带边缘被显著减慢，光传播有效路径增加。基于光子晶体禁带易调控的优势，已经有很多关于光子晶体检测pH、温度、金属离子、同系物、有机溶剂和氨基酸等的报道。如发明专利201910053552.1公开了一种光子晶体荧光增强检测痕量有机胺类化合物的方法，技术方案为：通过利用构建出的能够将其内部荧光探针信号大幅度增强的光子晶体功能体系，进而通过荧光强度变化实现对痕量胺类化合物的高灵敏识别检测。发明专利201811133925.8公开了一种使用一维光子晶体传感器检测有机溶剂的方法，将蚕丝蛋白与壳聚糖，采用旋涂的方法制备一维光子晶体薄膜传感器，当传感器接触到环境中不同的有机溶剂蒸汽时便会显示出不同的颜色，从而达到快速检测的目的。发明专利201811485938.1公开了一种光子晶体传感器及其利用传感器快速检测果蔬中农药残留的方法。传感器通过垂直沉积法自组装获得以SiO2微球作为基元的模板，模板表面涂覆含有待测农药的分子印迹预聚液，而后水浴中进行聚合反应，反应后浸泡在氢氟酸中使模板中的SiO2脱离，而后洗脱即得光子晶体传感器。但至今还没有采用光子晶体应用于白酒检测的相关报道。
发明内容
针对上述现有检测技术的不足，本发明的目的在于提供一种微阵列荧光传感芯片及其应用，解决现有的检测方法存在成本高，操作繁琐以及敏感性较低，导致准确率不高的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种微阵列荧光传感芯片，包括阵列载体和分别固定在所述阵列载体上的6种荧光染料，所述阵列载体是聚苯乙烯微球在等离子玻璃表面自组装形成的光子晶体，所述荧光染料为所述荧光染料为尼罗红(NR)、四氯四碘荧光素二钠盐(TDS)、玫瑰红银试剂(DR)、罗丹明6G(Rh6G)、N-(1-萘基)-乙二胺(NED)和1-萘酚(Np)。优选的，所述微阵列荧光传感芯片在氮气气氛下储存0～10d。
作为优选的，所述阵列载体采用以下步骤制得：
1)聚苯乙烯微球的合成：将丙烯酸和苯乙烯融于超纯水中，氮气冒泡5～20min，并在氮气条件下搅拌，将溶液缓慢加热至70℃后，迅速加入过硫酸铵得到反应液，充分搅拌，反应结束后，将反应溶液冷却到室温，然后去除补体成分，即得聚苯乙烯微球；
2)光子晶体的自组装：将步骤1)得到的聚苯乙烯微球均匀地涂覆在等离子清洁的玻璃片上，先以500～1000rpm的低速旋转5～20s，然后以1800～2500rpm的高速旋转15～25s，使聚苯乙烯微球旋转涂层自组装成光子晶体，然后将玻璃片放入烘箱干燥，使光子晶体结节牢固，置于氮气气氛下保存，即得到所述阵列载体。
作为优选的，所述丙烯酸和苯乙烯的体积比为0.90～0.95:11～12，所述反应液中过硫酸铵的浓度为0.85～0.90mg/mL。
作为优选的，所述干燥温度为84～86℃，干燥时间为1～3h。
作为优选的，所述荧光染料的浓度为0.01～0.05g/L。
本发明的另一个目的在于提供上述微阵列荧光传感芯片在白酒检测方面的应用，白酒检测过程如图1所示，首先通过微阵列点样机在具有光子晶体结构的玻璃芯片上滴加荧光染料构建阵列，然后加入适量的白酒与染料反应，利用光子晶体荧光放大作用扩大荧光信号，接着用特定的荧光扫描仪采集反应信号，最后通过模式识别算法和径向基函数神经网络对采集数据进行处理，具体采用以下步骤：
(1)基于上述的微阵列荧光传感芯片，向阵列点芯片中分别加入不同种类的待测白酒样品进行反应，反应结束后，分别在532nm和635nm的激发波长下扫描；
(2)获取微阵列荧光传感芯片的荧光信号；
(3)根据反应后的荧光数据采用模式识别方法进行区分和判别。
这样，本发明基于上述6种荧光染料构建荧光传感阵列，并利用光子晶体放大荧光信号以检测不同白酒。NR作为一种氧化酶荧光染料，荧光强度主要受脂质、蛋白质以及反应微环境极性影响。当激发波长大于590nm时，NR脂质检测能力减弱，这有利于提高染料对白酒中蛋白质和极性物质检测的特异性和灵敏性。TDS荧光强度主要受蛋白质含量和pH影响，与NR相同，TDS在Ex＝532nm和Ex＝635nm两种激发波长下有激发峰，可提供2个信号通路。Np具有芳香环结构，能够与白酒微量组分进行亲电取代反应，从而引起荧光信号变化。NED可与白酒中微量组分通过酰胺反应产生较强的荧光。DR作为一种金属离子指示剂，能够与白酒中的金属离子反应产生荧光。Rh6G为一种高度敏感的有机分析试剂，广泛用于金属离子和蛋白质的检测。
作为优选的，所述反应时间为3～10min。
作为优选的，所述模式识别方法包括：主成分分析、层序聚类分析、线性判别分析以及径向基函数神经网络分析。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明基于聚苯乙烯微球自组装形成的光子晶体结构作为阵列载体，结合光子晶体的荧光放大特性和染料的广谱识别能力构建固态阵列应用于不同白酒的检测识别。白酒中丰富的微量组分可与荧光染料反应，使荧光增强或猝灭，由于荧光染料发射波长与光子禁带接近，白酒与荧光染料反应的信号被进一步放大，从而大幅增加阵列检测白酒的灵敏度。此外，与液体传感器阵列相比，基于光子晶体的荧光阵列在氮气下存储10d后，线性判别分析LOO准确率仍然在90％以上，显示阵列具有更高的稳定性，具有实际应用的价值。本发明所构建阵列为固体阵列，增加了阵列的储存时间，解决了常规液体阵列必须现配现用的缺点，提升了检测的简便性，同时，首次将光子晶体荧光增强效应与荧光染料的广谱识别功能相结合用于白酒检测，扩大了光子晶体的应用范围，也为白酒检测提供了新思路和新选择。
2、本发明基于光子晶体独特的慢光子效应扩大染料荧光强度构建荧光传感阵列，再结合PCA、HCA、LAD以及RBFN对实验数据进行处理，以达到对不同白酒分类的目的，多种分析处理数据方法的结合使用极大提升了检测的准确性和灵敏度，为白酒检测标准化、数字化的发展奠定了研究基础。通过模式识别和径向基函数神经网络结果表明，阵列能对16种白酒进行正确分类，在HCA中，全部白酒均被正确区分，分类准确率达到100％；在LDA中，除景芝酒和酒鬼酒重叠外，其余白酒均分散于线性判别分析散点图中，且同一酒样的不同平行样之间相互聚集成一簇，对景芝酒和酒鬼酒进行独立样本T检验，两种酒样呈明显差异(P＜0.01)，表明通过LDA能够对不同白酒进行分类识别。在RBFN中，酒样预测结果与实际结果基本一致。表明本发明微阵列荧光传感芯片对白酒具有良好的识别能力，为白酒检测提供了一种准确、灵敏、快速的新方法。
附图说明
图1为微阵列荧光传感芯片进行白酒检测的过程示意图。
图2为聚苯乙烯微球(A)和光子晶体(B)的TEM图谱。
图3为荧光染料荧光强度经光子晶体放大的倍数和光子晶体改性玻璃芯片两个激发波长的原始荧光图像。
图4为本发明微阵列荧光传感芯片对16种白酒主成分分析累积方差柱状图。
图5为本发明微阵列荧光传感芯片对16种白酒层序聚类分析树状图。
图6为本发明微阵列荧光传感芯片对16种白酒的线性判别分析和独立样本T检验。
图7为本发明微阵列荧光传感芯片对16种白酒的径向基函数神经网络检验结果：(A)训练样本与测试样本的拟合曲线；(B)残差结果。
图8为本发明微阵列荧光传感芯片在氮气气氛下的稳定性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、微阵荧光阵列传感芯片的构建
1)聚苯乙烯微球的合成：分别将0.95mL丙烯酸和11mL苯乙烯加入含有100mL超纯水的三颈烧瓶中，氮气冒泡10min。在350rpm转速搅拌下，将溶液缓慢加热至70℃，并在氮气下搅拌。达到目标温度后，迅速加入过硫酸铵使其浓度为0.90mg/mL，持续搅拌8h后，将反应溶液冷却到室温，并去除补体成分，即得聚苯乙烯微球。
2)光子晶体的自组装：首先将2μL步骤1)制得的聚苯乙烯微球均匀地涂覆在等离子清洁的玻璃片上，先以低速(800rpm)旋转10s，高速(2000rpm)旋转20s以上，然后将玻璃片放入烘箱，85℃干燥2h，使光子晶体结节牢固，得到光子晶体即阵列载体。
3)分别将NR(0.01g/L)、TDS(0.05g/L)、DR(0.05g/L)、Rh6G(0.02g/L)、NED(0.01g/L)和Np(0.05g/L)等荧光染料通过微阵列点样机在光子晶体上固定，以构建微阵荧光阵列传感芯片。
采用透射电镜(TEM)对本发明制备的聚苯乙烯微球和光子晶体进行表征，结果如图2所示。
从图2A中可以看出，本发明所制备的聚苯乙烯微球呈规律、大小均匀(直径约250nm)且具有良好的分散性的球形。在可见光下，聚苯乙烯微球的溶液呈乳白色，经涂覆后玻璃片颜色为蓝紫色。聚苯乙烯微球在玻璃片表面自组装后行成光子晶体，其TEM形貌如图2B所示，光子晶体呈具有明确边缘的六边形阵列结构，这种高度重复的序列赋予了光子晶体独特的慢光子效应，从而达到增强荧光信号的作用。
二、基于微阵荧光阵列传感芯片对白酒进行检测
(1)利用点样机向构建好的微阵荧光阵列传感芯片上分别滴加16种品牌的白酒样本进行反应，酒样样本具体信息见表1。反应3min后，利用与微阵列芯片点样仪配套的微阵列芯片荧光扫描装置扫描，其中荧光由两个具有不同激发波长(532和635nm)的激发器激发。
表1白酒详细信息
Figure BDA0002865783050000051
图3为光子晶体改性后荧光染料在两种波长激发下的荧光图像以及荧光强度增加倍数，在引入光子晶体之后，荧光染料的原始荧光强度明显增加。从荧光图像可以看出，阵列点形状规则，大小均匀(约1mm)，且荧光清晰。此外，与阵列点的荧光强度相比，光子晶体的背景荧光十分微弱，不影响实验数据采集。
(2)获取微阵列荧光传感芯片的荧光信号
荧光传感阵列由光子晶体和荧光染料构成，基于六种荧光染料和两种激发波长，共提供8个信号通道，用于区分16种品牌白酒。每种白酒与阵列芯片荧光染料反应之后，都具有一组8维的特异性荧光响应数据。从荧光数据可以看出，各阵列点与白酒反应之后，荧光强度呈现不同变化。在不同激发光源下，NR阵列点荧光强度放大倍数各不相同，这可能是因为在不同激发波长下，荧光染料与酒体微量组分反应后产生不同的荧光信号有关，如前文所述，当激发波长大于590nm时，NR脂质检测能力将受影响，这有利于材料与白酒反应产生不同的交叉信号，提高阵列的检测能力。总体来说，当激发波长为635nm时，68.75％的阵列点与不同白酒反应后荧光信号呈增强趋势，表明NR作为一种具有广谱响应能力的荧光染料，可以与白酒中的蛋白质和极性物质反应，使荧光信号增强。对于TDS阵列点，与白酒反应后，31.25％的阵列点在激发波长为635nm时荧光强度大幅增加，这可能因为荧光染料与白酒微量组分发生交叉反应，产生具有更高激发波长的物质使阵列点荧光强度增强。在NED组成的阵列点中加入16种白酒后，87.5％的阵列点荧光信号明显增强，这可能与白酒微量组分苯基和酰胺基团反应，使荧光信号增强有关。加入16种白酒后，93.75％的Np阵列点荧光强度明显增强，由前文可知，荧光染料Np具有特殊的芳香环，可与白酒的微量组分发生卤化、烷基化、氧化、成谜等反应，从而增强荧光信号。在DR组成的阵列点中，大部分阵列点与16种白酒反应后荧光强度呈不同的增强趋势，表明白酒中金属离子含量各不相同。此外，Rh6G能与蛋白质结合，导致荧光猝灭。只有43.75％的Rh6G阵列点荧光强度减小，表明白酒中蛋白质含量相对较少。
(3)数据分析：根据反应后的荧光数据采用模式识别方法进行区分和判别
对于阵列的高维数据来说，通过合适数据分析方式处理数据，从而对阵列性能进行评价至关重要，因此我们选择主成分分析、线性判别分析、层序聚类分析以及径向基函数神经网络对采集的荧光数据进行分析，详情如下：
①主成分分析(PCA)
本研究基于16种不同品牌的白酒共进行80次实验，通过采集反应后的荧光数据，共获得640维数据，通过PCA把多个变量通过相关矩阵转换成少数几个主变量，得到主成分累积柱状图如图4所示，前6个主成分包含了多维数据92.93％的信息，前8个主成分解释了总体信息的98.13％。较少的主成分解释较多的信息表明通过光子晶体放大信号的荧光传感阵列对16种白酒具有较突出的检测能力，但主成分分析Kaiser-Meyer-Olkin值仅为0.532，需进一步的模式识别方法对差谱图数据进行区分和识别。
②层序聚类分析(HCA)
为探究阵列对白酒的分类能力，基于差值矢量进行HCA，利用荧光染料和白酒之间交叉响应的多维数据，根据响应的特征值，将16种不同品牌的白酒分为多个组。聚类分析树状图如图5所示，基于差值矢量，HCA显示了清晰而紧密的聚类结果，16种白酒在树状图中均被正确区分，且相同白酒的五组平行样在树状图中聚成一组，表现出较好的检测重复性。
③线性判别分析(LDA)
在HCA基础上，我们进行了有监督的LDA，并建立了两个描述16种白酒差异的判别函数，分别利用判别函数绘制二维散点图，结果如图6所示。从散点图中可以看出，除景芝酒和酒鬼酒有部分重叠，其余白酒均分布在散点图不同区域，且同一种酒样的不同平行样之间相互聚集成一簇，进一步显示实验具有很好的重复性。针对在二维散点图中重叠的数据组，我们基于factor1进行独立样本t检验，结果表明，景芝酒和酒鬼酒呈现显著的差异(P＜0.01)。以上结果表明，通过模式识别分析方法，基于光子晶体放大荧光信号的阵列芯片可实现对不同品牌白酒的区分。
④径向基函数神经网络(RBFN)
鉴于模式识别存在一定的误分类，不能够完全对白酒进行直接区分，因此我们采用RBFN对阵列检测白酒性能进一步评估。在全部样本中，我们选择4/5的样本作为训练样，其余的作为未知样，且为达到充分学习目的，将训练样本扩大四倍，达到256组。首先利用平均相对误差为评价标准，对扩散因子和神经元数量进行了优化。结果表明，扩散因子和神经元数分别为50和30时阵列对白酒的识别效果最好。图7A为16种白酒样品的RBFN测试结果，预测结果与实际结果基本一致，且样品测试的平均相对误差仅为0.028，表明本研究所构建的荧光阵列对酒样具有很高识别率。由图7B可知，即使在残差最大的第14个样品中，残差值也低于0.1，对分类结果影响不大。以上结果进一步表明，基于光子晶体放大荧光信号原理的荧光传感阵列芯片对不同白酒具有良好的区分能力。
三、稳定性试验
良好的稳定性可为阵列在实际检测中的应用提供保障，为探究阵列检测白酒的稳定性，我们按照前述实验方法构建基于光子晶体的荧光传感阵列，我们通过将阵列存放于氮气中保存，每隔一段时间(1、3、5、10和15d)取出与16种不同白酒反应测定荧光强度，通过线性判别分析LOO准确率对稳定性进行评估。结果如图8所示。
从图中可以看出，随着存放时间的增加，线性判别分析LOO准确率呈减小的趋势，但下降幅度并不明显，在氮气下干燥存储10d后，阵列LOO准确率仍超过90％，表明荧光传感阵列在氮气下存放具有较高的稳定性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种微阵列荧光传感芯片，其特征在于，包括阵列载体和分别固定在所述阵列载体上的6种荧光染料，所述阵列载体是聚苯乙烯微球在等离子玻璃表面自组装形成的光子晶体结构，所述荧光染料为NR、TDS、DR、Rh6G、NED和Np。
2.根据权利要求1所述的微阵列荧光传感芯片，其特征在于，所述阵列载体采用以下步骤制得：
1）聚苯乙烯微球的合成：将丙烯酸和苯乙烯融于超纯水中，氮气冒泡5~20 min，并在氮气条件下搅拌，将溶液缓慢加热至70 oC后，迅速加入过硫酸铵得到反应液，充分搅拌，反应结束后，将反应溶液冷却到室温，然后去除补体成分，即得聚苯乙烯微球；
2）光子晶体的自组装：将步骤1）得到的聚苯乙烯微球均匀地涂覆在等离子清洁的玻璃片上，先以500~1000 rpm的低速旋转5~20 s，然后以1800~2500 rpm的高速旋转15~25s，使聚苯乙烯微球旋转涂层自组装成光子晶体，然后将玻璃片放入烘箱干燥，使光子晶体结节牢固，置于氮气气氛下保存，即得到所述阵列载体。
3.根据权利要求2所述微阵列荧光传感芯片，其特征在于，所述丙烯酸和苯乙烯的体积比为0.90~0.95:11~12，所述反应液中过硫酸铵的浓度为0.85~0.90 mg/mL。
4.根据权利要求2所述微阵列荧光传感芯片，其特征在于，所述干燥温度为84~86oC，干燥时间为1~3 h。
5.根据权利要求1所述微阵列荧光传感芯片，其特征在于，所述荧光染料的浓度为0.01~0.05g/L。
6.一种如权利要求1~5任一项所述微阵列荧光传感芯片在白酒检测方面的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，包括：
（1）基于权利要求1~5任一项所述的微阵列荧光传感芯片，向阵列点芯片中分别加入不同种类的待测白酒样品进行反应，反应结束后，分别在532 nm 和 635 nm的激发波长下扫描；
（2）获取微阵列荧光传感芯片的荧光信号；
（3）根据反应后的荧光数据采用模式识别方法进行区分和判别。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述反应时间为3~10min。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述模式识别方法包括：主成分分析、层序聚类分析、线性判别分析以及径向基函数神经网络分析。
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