CN112755189A - 1型大麻素受体拮抗剂在制备治疗心肌细胞焦亡药剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及1型大麻素受体(CB1R)拮抗剂的新用途，具体涉及心肌细胞焦亡新型调控因子CB1R的鉴定及CB1R选择性拮抗剂在制备治疗抗精神药物心肌细胞毒性药剂中的应用。本发明还提供了相应的试剂盒。本发明经实验证实，奥氮平促使心肌细胞炎性浸润及纤维化重构，奥氮平具有促进NLRP3炎性小体形成，激活心肌细胞焦亡通路而引起心肌毒性的效应，而CB1R是心肌细胞焦亡的重要调控因子，CB1R选择性拮抗剂可用于治疗奥氮平心肌毒性。本发明为心肌细胞毒性治疗药物的开发开辟了新的线索。

Description

1型大麻素受体拮抗剂在制备治疗心肌细胞焦亡药剂中的 应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及焦亡调控因子的鉴定及其药物新用途。具体涉及1型大麻素受体(CB1R)拮抗剂在制备治疗心肌细胞焦亡药剂中的应用，尤其涉及1型大麻素受体(CB1R)调控焦亡的鉴定方法及1型大麻素受体拮抗剂在抗精神药物心肌毒性中的治疗应用。

背景技术

现有技术公开了在治疗精神分裂症，双相情感障碍和重度抑郁症等精神疾病的过程中，非典型抗精神病药，包括奥氮平，氯氮平和喹硫平，是其中治疗效果被公认的一类重要药物。然而，随着抗精神病药物的不断应用与普及，随之而来的毒副作用也引起了各界的广泛关注。越来愈多的报道表明长期服用抗精神病药物是诱发心源性猝死的常见因素。新英格兰医学杂志的统计学研究表明，长期使用精神药物，尤其是长期服用抗精神病药相较于不用药人群，其心源性猝死的概率约升高2倍。在美国，精神分裂症患者平均寿命为61岁，比普通人平均寿命(76岁)减少了20％，其原因与长期使用抗精神病药引起的心肌功能损害密切相关。

目前主要有两代抗精神病药，其中第一代药物在各年龄段内(15-44岁、45-64岁和65-84岁)诱发心源性猝死的风险分别为万分之二、十九和二十七。第一代精神药物主要通过阻滞心肌延迟整流钾通道快速激活成分(IKr)而诱发QT间隙延长甚至扭转性室性心动过速(torsade de pointes)等恶性心律失常。第二代抗精神病药如喹硫平、利培酮、奥氮平等共同被FDA批准作为精神分裂和双向障碍的治疗用药，是国内外治疗精神症状的一线用药。相较于第一代抗精神病药而言，第二代抗精神病药诱发致命性心律失常的概率显著下降；在治疗严重抑郁症(major depressive disorder，MDD)和广泛性焦虑症(generalizedanxiety disorder，GAD)中也因具有潜在用途而受到广泛关注。然而随着该类药物的长期使用，其对心肌的损害效应也逐渐凸现。部分案例报道显示在使用奥氮平过程中患者会出现较严重的心肌疾病，如心肌炎或心肌病，部分病人甚至出现严重致死现象。

研究认为，抗精神病药致心肌损害的方式可能有：(1)药物对心肌细胞的直接毒性作用，导致心肌细胞变性、坏死，从而引发炎症因子释放、炎症细胞浸润以及纤维炎性修复；(2)药物引起心脏超敏性反应。前者表现为淋巴细胞浸润为主的急性毒性心肌炎；后者表现为心肌间质嗜酸性粒细胞显著浸润。在任一种方式中，药物诱导的心肌细胞损伤是后续炎症反应、纤维修复的先决条件。损伤的心肌细胞通过释放和召集炎症因子，触发免疫调节和修复，达到心肌重构的效应。这与大量研究指出的抗精神病药使用后机体炎症因子水平显著升高是吻合的。同时这也提示，抗精神病药导致的心肌毒性可能由一种与炎性因子密切相关的细胞通路介导。

至今，精神药物物导致心肌损害的研究绝大多数侧重于案例报道或回顾性分析，深入其机制的研究很少。基于此类药物目前在临床治疗中的不可替代性，阐明其内在的损害机制，以减少其毒副作用，从而提升疗效具有重要意义。基于此迫切需求，本研究团队前期构建了抗精神病药奥氮平连续处理小鼠21天以诱导心肌毒性的模型，并收集其与对照组基因进行信号通路分析，结果显示细胞焦亡相关信号通路在抗精神病药处理的小鼠模型中显著富集。

焦亡是一种与组织炎症反应密切相关的新型程序性细胞死亡形式，通常在病原体入侵时发生。细胞焦亡的特征是细胞肿胀和质膜破裂，导致细胞质内容物释放到细胞外。越来越多的证据表明，焦亡相关细胞死亡途径的关键成分，包括炎症小体形成和促炎细胞因子的释放，参与了心肌损害的发生和发展。诱导焦亡需要通过炎性caspase激活成孔蛋白gasdermin D(GSDMD)。在经典炎性小体通路中，NLRP3等与caspase-1形成炎性小体复合物，caspase-1从而被剪切而有活性，活化的caspase-1介导GSDMD的裂解和促炎细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)的成熟。裂解的GSDMD其N端转位至细胞膜上，促进细胞膜成孔，有利于细胞内组分渗漏到细胞外环境中。与经典炎性小体不同，非经典炎性小体通路可以通过半胱天冬酶-4，-5和-11直接结合细菌内毒素主要成分脂多糖LPS来引发。这些半胱天冬酶激活GSDMD以诱导细胞裂解和死亡。此外，caspase-1在非经典的焦亡途径中也被激活，导致成熟的IL-1β和IL-18的产生，IL-1β和IL-18继而被释放到细胞外环境中。我们通过小鼠模型中制备的心脏切片免疫荧光显示，奥氮平用药组中caspase-1和NLRP3显著高表达；心肌细胞在抗精神病药处理后，焦亡相关蛋白的表达量也有显著升高。以上结果显示细胞焦亡可能是抗精神病药诱导心肌毒性的基础。因此解析心肌细胞焦亡的新型调控因子，以为抗精神病药心肌毒性的防治提供潜在的治疗靶点显得尤为重要。

在进一步比较分析奥氮平处理后的小鼠心肌在转录水平和蛋白水平与对照组的差异后，本研究团队发现内源性大麻素信号(endocannabinoid signaling)通路在两个组学中都表现出一定程度的富集，这说明内源性大麻素信号转导通路与抗精神病药导致的心肌毒性有密不可分的关系；其中，1型大麻素受体(CB1R)作为内源性大麻素系统的重要组分，是一类受到广泛关注的细胞膜表面G蛋白偶联受体；考虑到超过30％的现有商业药物是通过靶向G蛋白偶联受体而开发的，CB1R目前已被报道认为是心血管疾病的重要潜在治疗靶点。内源性大麻素信号转导通路在奥氮平作用的心脏中转录水平和蛋白水平同时富集让我们再次将目光聚集在该受体家族上。

基于现有技术的基础与现状本申请的发明人拟提供1型大麻素受体拮抗剂在制备治疗心肌细胞焦亡药剂中的应用，本申请将进一步探讨CB1R是否与抗精神病药诱导的心肌焦亡过程相关。

发明内容

本发明的目的是提供焦亡调控因子的鉴定及其药物新用途，具体涉及鉴定焦亡调控因子的具体过程及利用其调控因子进一步治疗抗精神药物诱导心肌毒性方面的应用；尤其涉及1型大麻素受体(CB1R)调控焦亡的鉴定过程及CB1R的特异性拮抗剂在抗精神药物诱导心肌毒性方面的应用。

本申请基于前期同时分析转录组学和蛋白质组学的数据后，筛选到多条可能调控心肌焦亡的通路，并分别采用这些通路的特异性抑制剂，比较、分析何种通路的抑制剂对于细胞焦亡分子NLRP3、caspase-1及GSDMD的蛋白表达影响最显著；经试验，获得的数据显示1型大麻素受体(CB1R)拮抗剂作用后，焦亡通路分子改变最显著。利用心肌细胞上敲除CB1R的稳转株进行验证，发现可明显缓解抗精神药物诱导的心肌毒性，同时，CB1R选择性拮抗剂与抗精神病药物奥氮平同时作用可防治奥氮平引起的心肌损害；此结果证实了1型大麻素受体(CB1R)是心肌细胞焦亡的重要正性调控因子，意味着鉴定分离出一种焦亡通路的新型调控因子；而1型大麻素受体(CB1R)的选择性拮抗剂可成为一种新的焦亡通路调控药物，能为抗精神病药心肌毒性的治疗提供新的思路。本发明在上述基础上完成。

本发明提供了细胞焦亡调控因子的鉴定方法。

本发明提供了1型大麻素受体药物在制备心肌细胞焦亡药剂中的应用。

本发明的优选例中，所述的细胞是心肌细胞。

本发明提供了使用所述药剂的方法，即将1型大麻素受体药物与所述的细胞共同孵育。

其中，所述的药剂具有增强NLRP3炎性小体活化的作用。

另一方面，本发明提供了一种用于心肌细胞焦亡的试剂盒，所述的试剂盒含有奥氮平标准品。

所述的试剂盒具有激活心肌细胞焦亡的作用，其活性成分为奥氮平。

本发明的试剂盒中，可以含有标准样品，CB1R的拮抗剂，说明书等等。

由于其具有有效的药理功能，奥氮平可作为非典型抗精神病药物使用，但近年来由于其对心肌的副作用而引起临床医生的注意和警惕处方。与其他抗精神病药类似，奥氮平诱导的心脏毒性在临床上表现为QTc间期延长，心动过速，甚至心源性猝死。在病理学上，药物诱导的心肌损伤为非特异性改变，表现为炎症浸润和/或纤维化积聚，病理学上称之为心肌炎和心肌病。本发明使用临床治疗剂量的奥氮平连续注射到小鼠中以建立奥氮平慢性心脏毒性的小鼠模型。与安慰剂组相比，奥氮平暴露引起显著的炎症细胞积聚和血管周围纤维化病变和心肌间质纤维化。随着暴露时间延长或剂量加大，奥氮平显著损害心肌细胞的活力。所有这些实验证据证实了奥氮平在体内和体外诱导的心脏毒性。

药物毒性的根本影响是导致细胞死亡。心肌细胞中细胞程序性死亡方式中包含焦亡。其次，通过基因组学的方式分析，发现在精神病药处理后的小鼠心脏中焦亡通路的相对于对照组心脏显著性差异。收集精神药物作用于心肌细胞的蛋白和RNA，利用Western Blot和qPCR的方法分别在蛋白和转录水平验证焦亡的激活情况。焦亡会导致细胞膜破坏，继而胞质内容物释放，包括炎性细胞因子。这些细胞因子从死亡细胞中释放出来，发出应激信号，警告周围的细胞，并启动机体的保护机制。因此检测了奥氮平诱导的细胞焦亡关键分子的活化情况。结果显示奥氮平明显激活焦亡通路。由于已证实焦亡涉及多种药物毒性及其对心脏的毒性，因此寻找焦亡通路调控药物显得尤为重要。

本发明通过分析精神药物作用小鼠后心脏在转录水平和蛋白水平的变化，经过分析发现内源性大麻素系统在两种组学技术中都被显著富集。作为内源性大麻素系统的重要组成成分，1型大麻素受体CB1R属于G蛋白偶联受体的超家族，并且已被认为是心血管疾病的重要潜在治疗靶点。曾有报道两种亚型的CBR(CB1R和CB2R)作为关键膜受体，在氯氮平诱导的心肌损伤中具有极其重要作用；在本发明中，检测到1型大麻素受体在奥氮平损伤时有明显下降。因此评估了1型大麻素受体家族作为焦亡调控因子的可能性。经试验，获得的数据显示1型大麻素受体与焦亡通路密切相关，且利用细胞上敲除CB1R的稳转株进行验证，发现CB1R缺失可明显缓解抗精神药物诱导的心肌毒性，同时，CB1R选择性拮抗剂与抗精神病药物同时作用可发挥心脏保护性作用。实验数据说明，1型大麻素受体CB1R是焦亡的上游调节因子。1型大麻素受体药物(CB1R选择性拮抗剂)是焦亡通路新的调控药物，可用于奥氮平慢性心肌毒性的治疗。

附图说明

图1，奥氮平通过激活心肌细胞焦亡以引起心肌毒性，其中，(A)RNAseq后进行GeneOntocology(GO)功能分析发现焦亡(Pyroptosis)通路显著富集，(B)western blot分析奥氮平不同浓度或不同作用时间后焦亡通路各分子的蛋白改变，(C)qRT-PCR法分析奥氮平作用后心肌细胞焦亡的主要分子mRNA表达改变，(D)奥氮平刺激的心肌组织内，免疫荧光分析炎性小体形成情况，(D)NLRP3炎性小体特异性抑制剂VX-765对奥氮平引起心肌炎症浸润的改善情况，(E)NLRP3炎性小体特异性抑制剂VX-765对奥氮平引起心肌炎症浸润及心肌肥厚等心肌毒性的改善情况。

图2，奥氮平引起心肌细胞焦亡的关键通路筛选及CB1R选择性拮抗剂作用下奥氮平诱导心肌毒性的缓解情况，其中，(A，B)在稳定过表达CB1R的心肌细胞系中添加CB1R选择性拮抗剂，或在CB1R稳定敲除的心肌细胞中添加CB1R激动剂后，心肌细胞焦亡的主要分子表达改变，(C)CB1R选择性拮抗剂对奥氮平引起心肌炎症浸润和纤维化重构的形态学观察，(D)CB1R选择性拮抗剂对奥氮平引起心肌炎症浸润和纤维化重构的半定量分析，(E)CB1R选择性拮抗剂对奥氮平引起心重/体重比(HW/BW)及心重/胫骨长(HW/TL)的影响。

具体实施方式

本发明实施例中具体的实验材料、方法和步骤如下：

1.动物实验

所有动物实验均根据NIH指南的实验动物护理和使用(NIH出版物No.85-23，1996年修订)进行。动物实验的方案由复旦大学基础医学院的实验动物伦理委员会批准(编号：20170223-004)。实验中尽量减少动物痛苦。

年龄为～4周龄的雄性Balb/C小鼠购自SLAC Inc.(中国上海)并且适应性喂养1周。将所有小鼠圈养在无菌实验室动物繁殖条件下并保持在适当的温度下，以光照-黑暗各12小时来处理。所有动物可获得食物和水。在每天的15：00，向小鼠腹腔内注射100μLPBS(对照组)或奥氮平(2.5mg/kg)。对于其他分组的实验动物(额外注射其他药物)，在注射喹硫平或PBS之前约1小时提前腹腔注射。每天于药物处理小鼠前记录小鼠体重。治疗持续21天。在第21天，所有小鼠通过眼眶静脉采集血液以制备血清样品，同时测量左侧胫骨长度(TL)和心脏重量(HW)。将心脏横向切开，并将部分心脏组织进行福尔马林固定和石蜡包埋以制作心脏切片。剩余的心脏组织保存在-80℃直至使用。

2.组织学检查

心脏切片用苏木精和伊红(H&E)染色和PicroSirius Red(PSR)染色分别用于炎症浸润和纤维化病变的组织学观察。为了本研究的目的，心肌炎定义为≥1个炎症细胞集合，每个集合至少10个炎症细胞。根据细胞浸润程度对炎性浸润进行分类，并按照我们之前描述的方法，对0至4+(炎症浸润指数)采用5分制进行分级：0，无或可疑的炎症浸润；1+，1-2个炎症灶；2至3+，3个或以上的炎症灶；4+，整个心脏组织炎症灶集结成大片状，或广泛性、弥漫性炎症灶.

在PSR染色后，为了定量纤维化的程度，从每组小鼠心脏中随机选择5个视野并拍照。然后使用Image J软件(National Institute of Health，Bethesda，MD，USA)与切片面积成比例地自动分析纤维化区域所占百分比。

3.抗体

CB1R(目录号：93815)的兔单克隆一抗购自Cell Signaling Technology(Boston，MA，USA)。小鼠IL1β单克隆抗体购自Cell Signaling Technology(目录号：12242)。抗Bax(目录号：2272)和抗-GAPDH(目录号：5174)抗体也购自Cell Signaling Technology。LC3-B(目录号：192890)和IL-18(目录号：207323)的单克隆抗体购自Abcam。Caspase 3(目录号：19677-1-AP)和Bcl-2(目录号：12789-1-AP)的一抗购自Proteintech。针对β-actin的小鼠单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology(目录号：sc-47778，Santa Cruz，CA，USA)。Caspase1(目录号：)的一抗购自。Caspase11/NLRP1/NLRP3的一抗购自。HRP交联的二抗购自Jackson laboratories Inc.(West Grove，PA，USA)。山羊抗兔二抗Alexa Fluor 555(目录号：A-21428)和Alexa Fluor 488(目录号：A-11008)购自Invitrogen Inc.(Carlsbad，CA，USA)。所有本试验中应用的一抗均由制造商验证。

4.化学试剂

选择性CB1拮抗剂Rimonabant从Sigma-Aldrich商购获得。选择性CB1拮抗剂AM281(目录号：B6603)和选择性CB1R激动剂ACEA(目录号：1319)分别购自APExBio Technology(Boston，MA，USA)和Tocris Bioscience(Abingdon，OX，UK)。ACEA和Rimonabant分别制备成1mg/mL和0.6mg/mL工作溶液，分别配制在由DMSO，吐温-20和PBS组成的溶剂中。溶液中DMSO的最高终浓度≤1％，该浓度对小鼠存活率没有影响。抗精神病药奥氮平(目录号：S2493)购自Selleck Chemicals并溶于添加有1％乙酸的生理盐水中以制备储备溶液(分别为12mg/ml，0.5mg/ml)。体内实验的最终使用剂量为Rimonabant(3mg/kg)，AM281(2.5mg/kg)和ACEA(5mg/kg)

5.细胞培养

将心肌HL-1细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中。对于奥氮平毒性的体外考察模型，HL-1细胞用不同剂量的奥氮平处理，从低剂量(LD，1μM)，中剂量(MD，2μM)到高剂量(HD，4μM)在培养箱中在37℃下培养持24小时，或者将HL-1细胞采用固定剂量(2μM)的奥氮平处理，但奥氮平暴露时间分别为0，2，4，8，12，24小时。为了评估CB1R药物对奥氮平毒性的影响，用特定的CB1R调节剂预处理HL-1细胞。具体而言，在给予奥氮平之前30分钟将AM 251(1μM)、Rimonabant(2μM)、AM 281(2μM)分别添加到培养基中，而后再添加奥氮平。

6.蛋白质印迹分析

用RIPA缓冲液(Beyotime，Nantong，China)与蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合液(CellSignal Technology)混合裂解心肌细胞培养物。根据制造商的方案使用BCA试剂盒(ThermoScientific，CA，USA)对总蛋白质定量。然后在10％SDS-PAGE凝胶上将等量的蛋白质加载到每个泳道并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。然后将PVDF膜在5％脱脂牛奶中封闭1小时，在室温下用含有0.1％Tween-20的TBST缓冲液清洗3次，每次10分钟，添加一抗稀释液，在4℃过夜孵育。然后将印迹膜在含有0.1％tween-20的TBST中洗涤两次，并添加二抗稀释液(1∶50,000稀释，Jackson Laboratories)，37°孵育一小时。同时用β-actin作为内参。而后进行化学发光、显影、拍照。

7.免疫荧光试验

将奥氮平处理后的小鼠心脏组织切片进行石蜡脱水，抗原修复。用山羊血清封闭1小时后，将细胞与针对NLRP3和Caspase-1的一抗在4℃下共孵育过夜。以山羊抗兔AlexaFluor 555和山羊抗小鼠Alexa Fluor 488 IgG作为二抗。在室温下将DAPI以1∶1000的稀释度复染10分钟以显示细胞核。

8.慢病毒介导的基因表达

pLKO.1/puromycin慢病毒质粒构建稳定表达体系。简单地说，针对Cb1r(shCB1R)的shRNA序列被克隆到pLKO中。使用AgeI和EcoRI限制位点。1个含有非发夹插入物的载体作为阴性对照shRNA(shNC)。所有shRNA序列均由生工生物技术合成。(中国上海)。为了产生慢病毒，用pLKO.1瞬时转染慢x 293T细胞，包络载体pMD2.G和包装载体psPAX2使用Lipofectamine 3000转染试剂(Invitrogen)。媒介包含病毒在72h post-transfection收集和过滤0.45μm注射器过滤器。超离心浓缩慢病毒40000×g，4℃持续90min。将球团馏分用盐水悬浮。生成HL-1细胞基因表达稳定，心肌HL-1细胞被孵育在12孔板和感染了慢病毒表达shNC和shCB1R在聚凝胺的存在下(8μg/毫升；Sigma-Aldrich)持续48h。为了清除未被感染的细胞，加入含有10μg/毫升嘌呤霉素的新鲜培养基培养48h，随后存活的细胞经再次传代培养几次后，置于新鲜培养基中。随后的实验验证了基因的低表达。

9.实时荧光定量PCR

用TRIzol溶液(Vazyme，南京，中国)提取细胞或心脏组织匀浆中的总rna。在评估RNA质量和浓度后，使用HiScript II Q RT SuperMix(Vazyme)立即反向转录等量RNA(500ng)到cDNA中。使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme)在LightCycler480II系统(罗氏公司，巴塞尔，瑞士)上进行实时定量PCR(qRT-PCR)。利用上述方法将靶基因相对表达归一化为Gapdh。所有序列均由生工生物技术合成

10.统计分析

数据显示为平均值±标准误差(SEM)。Students′t-检验用于数值型变量的组间平均值比较，而单因素方差分析(ANOVA)用于≥3组的比较，并采用最小显著性差异(LSD)进行两组间差异检验。p值小于0.05被认为是统计学显著差异。

实施例1奥氮平通过诱导心肌细胞焦亡而介导心肌毒性

基于前期的研究发现，抗精神病药长期慢性使用过程中存在明显的心肌毒性，而奥氮平作为新一代的非典型抗精神病药在广泛使用过程中，也因其可能存在的较为严重的心脏毒副作用而在临床被谨慎使用，奥氮平心脏毒性的相关通路较少报道；在本实验中，使用了2.5mg/kg奥氮平(与临床治疗剂量相当)腹腔内注射小鼠。连续处理21天后，收集小鼠心脏组织，并提取其RNA。随即反转录为cDNA用于转录组学分析。与PBS处理的对照组相比，奥氮平处理的小鼠组织其基因中发现了焦亡通路的显著富集(图1A)。提示在奥氮平慢性作用下，焦亡通路在小鼠体内的激活；其次，在HL-1心肌细胞中，加入不同浓度(1、2和4μM)的奥氮平处理24小时或加入固定浓度(2μM)奥氮平处理不同时间(0、2、4、8、12和24h)。收集细胞总蛋白，经BCA试剂盒进行蛋白定量后，检测焦亡通路相关蛋白，发现NLRP3、GSDMD、IL-18和IL-1β的表达量随着浓度的不断升高和时间的不断延长而逐渐升高(图1B)，说明奥氮平心肌毒性在体外呈现浓度依赖性和时间依赖性。同时，在细胞中选用2μM奥氮平处理24h，后收集细胞总RNA；经反转录成cDNA后利用qRT-PCR技术测定mRNA水平上焦亡关键基因的转录情况，结果显示Nrlp3，Gsdmd，Il-18和Il-1β相对于PBS处理组来说均有不同程度的升高(图1C)；以上体现了奥氮平诱导心肌焦亡通路的广泛激活；最后，利用动物实验中收集的心脏组织制备心脏切片，利用免疫荧光技术观察奥氮平处理小鼠后，心肌组织中Caspase-1和NLRP3的表达和分布情况，结果显示，在奥氮平处理的小鼠心脏切片中Caspase-1和NLRP3的表达均有显著升高，并且Caspase-1和NLRP3在奥氮平处理的心肌组织内细胞空间分布上具有很大重叠(图1D)，提示奥氮平处理后心肌组织内炎性小体的形成；进一步，本实验采用NLRP3炎性小体的特异性抑制剂作用后，发现奥氮平引起的心肌炎症和心肌肥厚等心肌毒性表现被明显缓解(图1E-1F)；结果说明奥氮平通过诱导心肌焦亡而引起心肌毒性。

实施例2鉴定CB1R作为心肌细胞焦亡的新型调控因子

基于转录组学及蛋白质组学的交叉分析，发现奥氮平引起心肌毒性时可显著激活多条通路，包括内源性大麻素系统、细胞胞吞、PI3K/Akt通路等，本发明采用不同通路的特异性抑制剂，比较分析了各抑制剂对于心肌细胞焦亡分子NLRP3、Caspase-1及GSDMD的蛋白表达影响，经统计分析，发现抑制内源性大麻素系统功能后，细胞焦亡被最大程度地抑制，提示内源性大麻素系统是调控心肌细胞焦亡的重要环节；因此本发明继续以内源性大麻素系统的重要组分，CB1R作为研究对象，明确CB1R是否为心肌细胞焦亡的调控因子。

本实验构建了稳定过表达和敲除CB1R的心肌细胞系，并在CB1R过表达的心肌细胞中加入CB1R选择性拮抗剂AM 251、AM 281及Rimonabant，或在CB1R缺失的心肌细胞中，加入CB1R选择性激动剂ACEA，以观察CB1R对心肌细胞焦亡的影响，各组细胞收集总蛋白后，经BCA试剂盒定量，利用Western Blot的方法检测焦亡通路关键分子的表达情况，结果显示，CB1R拮抗剂可使心肌焦亡关键蛋白表达量降低，而CB1R过表达后，焦亡通路的分子激活更加明显；当在CB1R稳定过表达的心肌细胞中加入CB1R拮抗剂时，发现奥氮平引起的细胞焦亡被显著抑制，包括NLRP3，cleaved caspase-1及成熟的IL-1β、IL18等(图2A)，在敲除CB1R的心肌细胞中，使用CB1R的激动剂ACEA，观察CB1R过表达对于细胞焦亡的影响，WesternBlot显示加入CB1R激动剂后焦亡通路明显被强化，而在CB1R缺失的心肌细胞中，CB1R的激动剂不再引起上述效果(图2B)，以上结果表明CB1R是调节心肌细胞焦亡的重要因子，CB1R选择性拮抗剂或基因敲除CB1R可有效抑制心肌细胞焦亡。

实施例3抑制CB1R可有效缓解奥氮平心肌毒性

采用2.5mg/kg奥氮平(与临床治疗剂量相当)连续腹腔内注射小鼠21天，每天注射奥氮平之前半小时内小鼠使用CB1R特异性抑制剂AM281或Rimonabant预处理。阳性对照组小鼠只接受奥氮平处理，21天后，收集小鼠心脏组织用于组织学分析，并测量小鼠心脏重量、体重及胫骨长，小鼠心脏被制成石蜡切片后，与对照组相比，经H&E染色和PicroSiriusRed(PSR)染色分别显示奥氮平处理的心脏表现为大量炎症细胞聚集以及心肌间质纤维结缔组织明显积聚(图2C)，纤维结缔组织染色定量分析显示奥氮平暴露的心脏中纤维结缔组织的面积约为对照心脏的3倍(p＜0.001)，而加入CB1R拮抗剂后，结果显示炎症细胞数目明显减少；纤维结缔组织的聚集情况也明显好转(图2D)，心脏重量与胫骨长度的比率(HW/TL)和心脏重量与体重的比率(HW/BW)是反映心肌间质水肿和心脏病变的指标，结果显示，联合奥氮平和Rimonabant或AM281作用后，相对于仅有奥氮平暴露的小鼠处理组而言，其心脏毒性均有显著改善(图2E)，结果说明，作为心肌焦亡的调控因子，CB1R选择性拮抗剂可有效缓解奥氮平引起的心肌毒性。

Claims (7)

1.1型大麻素受体(CB1R)拮抗剂在制备治疗心肌细胞焦亡药剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的细胞是心肌细胞。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的1型大麻素受体拮抗剂抑制心肌细胞焦亡通路。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用中将1型大麻素受体拮抗剂与所述的细胞共同孵育。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药剂具有抑制NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡作用。

6.一种用于心肌细胞焦亡的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有奥氮平标准品。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有1型大麻素受体的拮抗剂。

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